麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的特征图谱构建及检测方法与流程

1.本发明涉及中药制剂检测方法，特别是涉及一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的特征图谱构建及检测方法，具体涉及一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的uplc特征图谱构建和检测方法。


背景技术：

2.麻黄为麻黄科植物草麻黄(ephedra sinica stapf)、中麻黄(ephedra intermedia schrenk et c.a.mey.)或者木贼麻黄(ephedra equisetina bge.)的干燥草质茎，性温，味辛、微苦，具有发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿的功效。桂枝为樟科植物肉桂(cinnamomum cassia presl)的干燥嫩枝，性温，味辛、甘，具有发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气等功效。药对是经过历代医家反复实践提炼的，符合中医药对七情配伍理论的，临床发挥协同、持制或者新生功用的，且已形成相对固定形式的，经常联用的两味药物。麻黄-桂枝药对源于张仲景的《伤寒论》的麻黄汤，为常用的辛温解表药对，是发汗解表之峻剂，具有解热、镇痛、抗流感、抗炎、平喘、免疫干预、抗过敏等药理作用。在临床上，麻黄汤主要用于感冒、上呼吸道感染、变态反应性及皮肤肌表疾病等的治疗。
3.麻黄-桂枝药对中药配方颗粒作为新型饮片中药配方颗粒的补充，既保留了经典方剂共煎配伍的特点，又具有中药配方颗粒随症加减的优势，在临床应用上具有重要意义。随着中药配方颗粒国家标准的颁布，中药配方颗粒市场即将全面开放，麻黄-桂枝药对中药配方颗粒在临床上的应用势必更为广泛，为保证用药的安全性和有效性，有必要建立一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的质量控制方法。
4.中药特征图谱是中药整体性化学特征的表达和反映，利用特征图谱获取全面的中药化学成分特征信息已广泛地应用于中药的质量控制之中。因此，建立麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的特征图谱可作为其生产各工序以及临床使用过程中的专属性鉴别方法和质量控制手段，亦可作为麻黄-桂枝药对中药配方颗粒与麻黄、桂枝单煎合用配方颗粒化学成分一致性的评价指标。
5.目前，虽然传统技术涉及采用hplc研究不同配伍配比对麻黄-桂枝药对中药配方颗粒指标成分含量的影响，但该传统技术并未构建得到能整体反映麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的化学特征信息的特征图谱。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的主要目的是提供一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的特征图谱构建及检测方法。本发明构建所得特征图谱能全面反映麻黄-桂枝药对中药配方颗粒整体化学成分信息，采用该特征图谱能够从内在质量上实现麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的专属性鉴别，并且操作简单、重复性好。
7.具体技术方案包括：
8.一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的uplc特征图谱的构建方法，所述构建方法包
括如下步骤：
9.制备对照品溶液和供试品溶液；其中，
10.所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取对照品，加溶剂溶解，所述对照品包括盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、原儿茶酸以及肉桂酸；
11.所述供试品溶液的制备包括如下步骤：取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒，加溶剂提取，过滤；
12.采用超高效液相色谱对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测。
13.在其中一个实施例中，所述检测采用的流动相包括：流动相a为乙腈，流动相b为磷酸体积浓度为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
14.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的程序包括：
15.0min～10min，所述流动相a的体积百分含量由3％上升至7％，
16.10min～17min，所述流动相a的体积百分含量由7％上升至9％，
17.17min～35min，所述流动相a的体积百分含量由9％上升至10％，
18.35min～36min，所述流动相a的体积百分含量由10％上升至17％，
19.36min～50min，所述流动相a的体积百分含量由17％上升至24％，
20.50min～70min，所述流动相a的体积百分含量由24％上升至45％。
21.在其中一个实施例中，所述检测采用的柱温为34℃～36℃；或/和所述检测采用的流速为0.23ml/min～0.28ml/min；或/和所述检测采用的波长为：0min～35min，波长为205nm～215nm，35min～70min，波长为270nm～290nm。
22.在其中一个实施例中，所述检测采用的进样量为0.8μl～2.0μl。
23.在其中一个实施例中，所述检测采用色谱柱为固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱。
24.在其中一个实施例中，所述溶解采用的溶剂为甲醇。
25.在其中一个实施例中，所述提取采用的溶剂为甲醇体积含量为50％～90％的甲醇水溶液；或/和所述提取的方式为超声提取，所述超声提取的条件包括：功率为200w～500w，频率为35khz～45khz，时长为20min～60min。
26.在其中一个实施例中，所述特征图谱包含有17个共有峰，所述共有峰中包括原儿茶酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱以及肉桂酸的特征峰。
27.本发明实施例提供的一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
28.取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒待测样品，加溶剂提取，制备待测品溶液；
29.采用超高效液相色谱对待测品溶液进行检测，并将得到的所述待测品溶液的检测图谱与如上所述的构建方法构建的特征图谱进行比对。
30.在其中一个实施例中，所述检测采用的流动相包括：流动相a为乙腈，流动相b为磷酸体积浓度为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
31.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的程序包括：
32.0min～10min，所述流动相a的体积百分含量由3％上升至7％，
33.10min～17min，所述流动相a的体积百分含量由7％上升至9％，
34.17min～35min，所述流动相a的体积百分含量由9％上升至10％，
35.35min～36min，所述流动相a的体积百分含量由10％上升至17％，
36.36min～50min，所述流动相a的体积百分含量由17％上升至24％，
37.50min～70min，所述流动相a的体积百分含量由24％上升至45％。
38.在其中一个实施例中，所述检测采用的柱温为34℃～36℃；或/和所述检测采用的流速为0.23ml/min～0.28ml/min；或/和所述检测采用的波长为：0min～35min，波长为205nm～215nm，35min～70min，波长为270nm～290nm。
39.在其中一个实施例中，所述检测采用的进样量为0.8μl～2.0μl。
40.在其中一个实施例中，所述检测采用的色谱柱为固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱。
41.在其中一个实施例中，所述提取采用的溶剂为甲醇体积含量为50％～90％的甲醇水溶液；或/和所述提取的方式采用超声提取，所述超声提取的条件包括：功率为200w～500w，频率35khz～45khz，时长为20min～60min。
42.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
43.本发明选用原儿茶酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱以及肉桂酸为对照品，构建含有这些化学成分的特征峰的麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的特征图谱，特别是在合适的色谱条件下构建包括这些化学成分的特征峰的含17个特征峰的特征图谱，所得特征图谱能全面反映麻黄-桂枝药对中药配方颗粒整体化学成分信息，采用该特征图谱能够从内在质量上实现麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的专属性鉴别，并且操作简单、重复性好。
附图说明
44.图1为麻黄-桂枝药对中药配方颗粒特征图谱；
45.图2为特征峰指认；
46.图3为10批麻黄-桂枝药对中药配方颗粒特征图谱；
47.图4为不同吸收波长对麻黄-桂枝药对中药配方颗粒特征图谱影响的考察；
48.图5为不同柱温对麻黄-桂枝药对中药配方颗粒特征图谱影响的考察；
49.图6为不同流速对麻黄-桂枝药对中药配方颗粒特征图谱影响的考察；
50.图7为3批麻黄-桂枝药对中药配方颗粒样品检测。
具体实施方式
51.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
52.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
53.本发明实施例提供一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的uplc特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
54.制备对照品溶液和供试品溶液；其中，
55.所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取对照品，加溶剂溶解，所述对照品包括盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、原儿茶酸以及肉桂酸；
56.所述供试品溶液的制备包括如下步骤：取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒，加溶剂提取，过滤；
57.采用超高效液相色谱对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测。
58.在其中一个示例中，所述检测采用的流动相包括：流动相a为乙腈，流动相b为磷酸体积浓度为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。可以理解的是，在该范围内，可以选取任一合适浓度的磷酸水溶液进行特征图谱构建，例如流动相可以为：流动相a为乙腈、流动相b为磷酸体积浓度为0.1％的磷酸水溶液，流动相a为乙腈、流动相b为磷酸体积浓度为0.08％的磷酸水溶液，流动相a为乙腈、流动相b为磷酸体积浓度为0.12％的磷酸水溶液，等。优选地，所述检测采用的流动相包括：流动相a为乙腈，流动相b为磷酸体积浓度为0.1％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
59.在其中一个示例中，所述梯度洗脱的程序包括：
60.0min～10min，所述流动相a的体积百分含量由3％上升至7％，
61.10min～17min，所述流动相a的体积百分含量由7％上升至9％，
62.17min～35min，所述流动相a的体积百分含量由9％上升至10％，
63.35min～36min，所述流动相a的体积百分含量由10％上升至17％，
64.36min～50min，所述流动相a的体积百分含量由17％上升至24％，
65.50min～70min，所述流动相a的体积百分含量由24％上升至45％。
66.在其中一个示例中，所述检测采用的柱温为34℃～36℃。本发明实施例的柱温例如可以是34℃、35℃、36℃等。优选地，所述检测采用的柱温为35℃。采用本发明实施例提供的柱温条件，各特征峰峰形最佳，峰2、峰3、峰4、峰5、峰6的分离度最好。
67.在其中一个示例中，所述检测采用的流速为0.23ml/min～0.28ml/min。本发明实施例采用的流速为0.23ml/min、0.25ml/min、0.28ml/min等。采用本发明实施例提供的流速条件，峰2、峰3、峰4、峰5的分离度好。优选地，所述检测采用的流速为0.25ml/min。
68.在其中一个示例中，所述检测采用的波长为：0min～35min，波长为205nm～215nm，35min～70min，波长为270nm～290nm。采用本发明实施例提供的检测波长，色谱峰峰数较多，各峰之间的分离度较好，信息量大，基线平稳。优选地，所述检测采用的波长为：0min～35min，波长为210nm，35min～70min，波长为280nm。
69.在其中一个示例中，所述检测采用的进样量为0.8μl～2.0μl。
70.在其中一个示例中，所述检测采用的色谱柱为固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱。可用于本发明实施例的固定相的种类包括但不限于waters acquity hss t3(2.1mm
×
150mm，1.8μm)。
71.在其中一个示例中，所述溶解采用的溶剂为甲醇。
72.在其中一个示例中，所述提取采用的溶剂为甲醇体积含量为50％～90％的甲醇水溶液。
73.在其中一个示例中，所述提取的方式为超声提取。优选地，本发明实施例所述的超声提取采用的功率为200w～500w、频率为35khz～45khz、时长为20min～60min。
74.在其中一个示例中，所述特征图谱包含有17个共有峰，所述共有峰中包括原儿茶
酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱以及肉桂酸的特征峰。
75.本发明实施例还提供一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
76.取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒待测样品，加溶剂提取，制备待测品溶液；
77.采用超高效液相色谱对所述待测品溶液进行检测，并将得到的所述待测品溶液的检测图谱与如上所述的构建方法构建的特征图谱进行比对。
78.在其中一个示例中，所述检测采用的流动相包括：流动相a为乙腈，流动相b为磷酸体积浓度为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
79.在其中一个示例中，所述梯度洗脱的程序包括：
80.0min～10min，所述流动相a的体积百分含量由3％上升至7％，
81.10min～17min，所述流动相a的体积百分含量由7％上升至9％，
82.17min～35min，所述流动相a的体积百分含量由9％上升至10％，
83.35min～36min，所述流动相a的体积百分含量由10％上升至17％，
84.36min～50min，所述流动相a的体积百分含量由17％上升至24％，
85.50min～70min，所述流动相a的体积百分含量由24％上升至45％。
86.在其中一个示例中，所述检测采用的柱温为34℃～36℃。
87.在其中一个示例中，所述检测采用的流速为0.23ml/min～0.28ml/min。
88.在其中一个示例中，所述检测采用的波长为：0min～35min，波长为205nm～215nm，35min～70min，波长为270nm～290nm。
89.在其中一个示例中，所述检测采用的进样量为0.8μl～2.0μl。
90.在其中一个示例中，所述检测采用的色谱柱为固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱。
91.在其中一个示例中，所述提取采用的溶剂为甲醇体积含量为50％～90％的甲醇水溶液。
92.在其中一个示例中，所述提取的方式为超声提取。
93.在其中一个示例中，所述提取的时长为20min～60min。
94.实施例1：一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的特征图谱建立方法
95.1仪器与试药
96.1.1仪器
97.超高效液相色谱仪：waters h-class uplc(美国waters公司)；
98.电子天平：me203e、me204e、xp26(mettler toledo公司)；
99.超纯水机：miliq direct 8(默克密理博公司)；
100.色谱柱：waters acquity hss t3(2.1mm
×
150mm，1.8μm)；
101.高频数控超声波清洗器：kq-300td(昆山市超声仪器有限公司)。
102.1.2试剂
103.乙腈、磷酸为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
104.1.3试药
105.麻黄-桂枝药对中药配方颗粒样品均为广东一方制药有限公司技术中心实验室自制。
106.对照品：原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，110809-200604)、盐酸麻黄碱(中国食品药品检定研究院，171241-200506)、盐酸伪麻黄碱(中国食品药品检定研究院，171237-201208)、肉桂酸(中国食品药品检定研究院，110786-201604)。
107.2方法与结果
108.2.1色谱条件
109.色谱柱：waters acquity hss t3(2.1mm
×
150mm，1.8μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；柱温：35℃；流速：0.25ml/min；检测波长：0min～35min，波长为210nm，35min～70min，波长为280nm；进样量：1μl。
110.表1、流动相梯度洗脱条件
[0111][0112]
2.2供试品溶液制备
[0113]
取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，精密加入体积浓度为50％的甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为50％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0114]
2.3参照物溶液制备
[0115]
分别取原儿茶酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、肉桂酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成混合对照品溶液，即得参照物溶液。
[0116]
2.4测定法
[0117]
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得麻黄-桂枝药对中药配方颗粒特征图谱，图1。
[0118]
2.5色谱峰指认
[0119]
采用盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、原儿茶酸、肉桂酸对照品进行定位，结果表明：峰3为原儿茶酸、峰6为盐酸麻黄碱、峰7为盐酸伪麻黄碱、峰15为肉桂酸，见图2。
[0120]
2.6参照峰和共有峰的选择
[0121]
比较10批麻黄-桂枝药对中药配方颗粒所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了17个共有峰，见图3。
[0122]
2.7对照特征图谱的建立和相似度评价
[0123]
将10批自生产的麻黄-桂枝药对中药配方颗粒色谱图导入“中药色谱指纹图谱相
似度评价系统2012版”，采用中位数法生成对照特征图谱(见图1)，10批麻黄-桂枝药对中药配方颗粒相似度均在0.95以上(见表2)。
[0124]
表2、10批麻黄-桂枝药对中药配方颗粒样品相似度计算结果
[0125][0126][0127]
3方法学考察
[0128]
3.1精密度试验
[0129]
取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒样品1份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取同一供试品溶液1μl，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以盐酸麻黄碱参照物峰(峰6)为参照峰s1，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11的相对保留时间和相对峰面积；以肉桂酸(峰15)参照物峰为参照峰s2，计算峰12、峰13、峰14、峰16、峰17的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3和表4。精密度试验结果显示，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
[0130]
表3、精密度试验-相对保留时间比值
[0131][0132][0133]
表4、精密度试验-相对峰面积比值
[0134][0135]
3.2重复性试验
[0136]
取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒样品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取同一供试品溶液1μl，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以盐酸麻黄碱参照物峰(峰6)为参照峰s1，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11的相对保留时间和相对峰面积；以肉桂酸(峰15)参照物峰为参照峰s2，计算峰12、峰13、峰14、峰16、峰17的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5和表6。精密度试验结果显示，各特征峰的相对保留时间为0.00％～0.99％，相对峰面积的rsd值为0.00％～2.67％，均小于3％，表明仪器重复性良好。
[0137]
表5、重复性试验-特征峰相对保留时间比值
[0138][0139][0140]
表6、重复性试验-相对峰面积比值
[0141][0142]
3.3稳定性试验
[0143]
取麻黄-桂枝药对中药配方颗粒样品1份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24h，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以盐酸麻黄碱参照物峰(峰6)为参照峰s1，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11的相对保留时间和相对峰面积；以肉桂酸(峰15)参照物峰为参照峰s2，计算峰12、峰13、峰14、峰16、峰17的相对保留时间和相对峰面积，结果见表7和表8。精密度试验结果显示，各特征峰的相对保留时间为0.00％～0.23％，相对峰面积的rsd值为0.00％～2.43％，均小于3％，表明样品在24小时内稳定。
[0144]
表7、稳定性试验-相对保留时间比值
[0145][0146][0147]
表8、稳定性试验-相对峰面积比值
[0148][0149]
3.4耐用性
[0150]
波长考察：比较了检测波长210nm、250nm、280nm、程序波长(0min～35min，波长为210nm，35min～70min，波长为280nm)下的色谱峰，结果表明程序波长下的色谱峰峰数较多，各峰之间的分离度较好，信息量大，基线平稳，故检测波长确定为0min～35min，波长为210nm，35min～70min，波长为280nm，见图4。
[0151]
柱温考察：比较了25℃、30℃、35℃的色谱图，结果显示，柱温为25℃和30℃时，峰5和峰6不能分离，而柱温为35℃时，各特征峰峰形最佳，峰2、峰3、峰4、峰5、峰6的分离度最好，故柱温确定为35℃，见图5。
[0152]
流速考察：比较了0.2ml/min、0.25ml/min、0.3ml/min的色谱图，结果显示0.25ml/min的色谱峰峰形最佳，峰2、峰3、峰4、峰5的分离度最好，故柱温确定为0.25ml/min，见图6。
[0153]
实施例2：一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的检测方法
[0154]
(1)供试品溶液的制备
[0155]
取待测样品(麻黄-桂枝药对中药配方颗粒，广东一方制药有限公司自生产)，研细，取约0.2g，精密称定，精密加入体积浓度为50％的甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理
(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为50％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0156]
(2)检测
[0157]
精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱仪的条件同实施例1中“2.1”项下色谱条件。
[0158]
参照上述方法，对3批次待测样品进行检测，得到的检测图谱如图7所示。
[0159]
通过与图1比较，可知，该待测样品的检测图谱能检出17个特征峰，与对照特征谱图的相似度为0.998，可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格产品。
[0160]
本实施例针对麻黄-桂枝药对中药配方颗粒质量控制领域尚属空白的问题，提供一种麻黄-桂枝药对中药配方颗粒uplc特征图谱的建立方法，该方法根据麻黄、桂枝药材的化学成分特点，指认了原儿茶酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、肉桂酸等专属性强的共有特征峰，从内在质量上实现麻黄-桂枝药对中药配方颗粒的专属性鉴别，为麻黄-桂枝药对中药配方颗粒质量评价体系研究提供科学的实验依据。同时也建立了一种专属性强、操作简单、重复性好的麻黄-桂枝配方颗粒的检测方法。
[0161]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0162]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。