一种单硝酸异山梨酯有关物质的检测方法与流程

1.本发明涉及一种单硝酸异山梨酯原料及其制剂中杂质的检测方法，具体的涉及一种利用高效液相色谱法检测单硝酸异山梨酯原料及其制剂中有关物质的方法，属于药物分析领域。


背景技术：

2.单硝酸异山梨酯用于冠心病的长期治疗，主要药理作用是松弛血管平滑肌，使心肌耗氧量减少，供氧量增多，心绞痛得以缓解。在原料药5-单硝酸异山梨酯合成工艺中，会产生很多其他杂质。比如2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯以及硝酸异山梨酯等。本发明将主要针对特定杂质进行分析。


技术实现要素：

3.为解决以上技术问题，本发明采用高效液相色谱法对单硝酸异山梨酯中的有关物质进行检测，可用于单硝酸异山梨酯原料及其制剂生产中的质量控制。该方法具灵敏度高，峰型好的特点，且分析方法稳定，有关物质检测限低。
4.为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：
5.一种利用高效液相色谱法检测单硝酸异山梨酯中有关物质的方法，所述的有关物质为2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯以及硝酸异山梨酯中一种或多种。具体的，所述的高校液相色谱法的色谱条件为：
6.色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
7.柱温：20～30℃；
8.检测波长：200～220nm；
9.流动相：以水为流动相a，以甲醇为流动相b，以甲醇-水的混合溶剂作为流动相梯度洗脱；
10.流动相流速：0.8～1.2ml/min；
11.优选的，所述的流动相梯度洗脱条件为：以体积比计，水：甲醇＝100～60:0～40o12.优选的，所述的流动相梯度洗脱条件为：以体积比计，
[0013][0014]
优选的，上述色谱条件中检测波长为210nm，柱温为25℃，流动相的流速为1.0ml/min。
[0015]
优选的，上述色谱条件中色谱柱为agilent c18柱4.6
×
250mm，5μm或kromasil c18柱4.6
×
250mm，5μm。
[0016]
本发明所述的一种利用高效液相色谱法检测单硝酸异山梨酯原料及其制剂中有关物质的方法，具体操作步骤如下所述：
[0017]
a、取对照品适量，加水溶解，配制成每1ml含4-6μg的对照品溶液；
[0018]
b、取单硝酸异山梨酯原料或其制剂适量，加水溶解，配制成每1.0mg/ml的供试品溶液；
[0019]
c、分别取对照品和供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，按照以下色谱条件完成单硝酸异山梨酯原料或制剂中有关物质的分析检测；
[0020]
具体的，步骤a中所述的供试品为2-单硝酸异山梨酯或硝酸异山梨酯，进一步的，步骤a中所述的供试品为2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯以及硝酸异山梨酯。
[0021]
色谱条件：
[0022]
色谱柱：agilent c18柱4.6
×
250mm，5μm或kromasil c18柱4.6
×
250mm，5μm；
[0023]
柱温：20～30℃；
[0024]
检测波长：200～220nm；
[0025]
流动相：甲醇与水的混合溶剂作为流动相梯度洗脱；
[0026]
流动相流速：0.8～1.2ml/min；
[0027]
其中，以体积比计，所述流动相梯度洗脱设置为：
[0028][0029]
[0030]
本发明涉及的分析方法，可以有效的检测单硝酸异山梨酯中有关物质的含量，而且该方法分离度高，重复性及耐用性好，检测限低，操作简单，结果稳定可靠，从而可用于单硝酸异山梨酯原料及其制剂的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。
附图说明
[0031]
图1空白溶剂的hplc图谱
[0032]
图2空白辅料的hplc图谱
[0033]
图3实施例1有关物质对照品溶液hplc图谱
[0034]
图4实施例1单硝酸异山梨酯原料供试品溶液hplc图谱
[0035]
图5实施例1单硝酸异山梨酯片供试品溶液hplc图谱
具体实施方式
[0036]
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0037]
一、有关物质检查方法学研究与评价
[0038]
1.仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长：210nm；以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为20μl；
[0039]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0040][0041][0042]
2.试验步骤：
[0043]
2.1系统适用性实验：取单硝酸异山梨酯约、2-单硝酸异山梨酯约、硝酸异山梨酯约、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各10mg置20ml容量瓶中，加水溶解定容至刻度，取1ml混合溶液置10ml量瓶中，加水定容至刻度，作为系统适用性溶液，按照上述色谱条件测定，记录色谱图。
[0044]
色谱图显示，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.709min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为9.009min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.103min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.655min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.012min，硝酸异山梨酯为18.487min，与有关物质杂质峰的分离度为2.0，符合测定要求。
[0045]
2.2专属性
[0046]
1)空白溶剂干扰试验
[0047]
取溶解样品用水，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，记录色谱图，hplc图谱见附图1。
[0048]
由附图1可见，空白溶剂水中无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0049]
2)辅料干扰试验
[0050]
取单硝酸异山梨酯片剂辅料，加水制成约1.0mg/ml的溶液，按照上述色谱条件测定。记录色谱图，hplc图谱见附图2。
[0051]
由附图2可知，辅料中无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0052]
2.3定量限和检测限
[0053]
1)定量限：取有关物质对照品适量，用水配制含单硝酸异山梨酯0.042μg/ml，硝酸异山梨酯0.055μg/ml，2-单硝酸异山梨酯0.021μg/ml的溶液，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯0.036μg/ml，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯0.030μg/ml，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯0.028μg/ml，作为定量限溶液，依法测定。
[0054]
由色谱图可知，硝酸异山梨酯的保留时间为18.508min，s/n为13.50。单硝酸异山梨酯9.122min，s/n为12.36。2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.710min，s/n为11.29。2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.103min，s/n为10.86。2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.655min，s/n为11.66。2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.012min，s/n为15.36。
[0055]
2)检测限：取有关物质对照品适量，用水配制含单硝酸异山梨酯0.020μg/ml，硝酸异山梨酯0.22μg/ml，2-单硝酸异山梨酯0.084μg/ml的溶液，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯0.018μg/ml，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯0.020μg/ml，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯0.010μg/ml，作为检测限溶液，依法测定。
[0056]
由色谱图可知，单硝酸异山梨酯9.150min，s/n为8.02。硝酸异山梨酯的保留时间为18.510min，s/n为3.51。2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.721min，s/n为3.95。2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.164min，s/n为7.52。2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.201min，s/n为5.23。2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.210min，s/n为6.32。
[0057]
2.4线性与范围
[0058]
取单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯，对照品适量，用水配制出一系列浓度的混合溶液，分别进样，按照上述色谱条件测定，记录色谱图，得线性方程如下：
[0059]
表1单硝酸异山梨酯峰面积与浓度曲线关系表
[0060][0061]
由表1可知，单硝酸异山梨酯在0.042～1.662μg/ml范围内，浓度和峰面积线性关
系良好。
[0062]
表2 2-单硝酸异山梨酯峰面积与浓度曲线关系表
[0063][0064]
由表2可知，2-单硝酸异山梨酯在0.021～1.475μg/ml范围内，浓度和峰面积线性关系良好。
[0065]
表3硝酸异山梨酯峰面积与浓度曲线关系表
[0066][0067]
由表3可知，硝酸异山梨酯在0.055～1.523μg/ml范围内，浓度和峰面积线性关系良好。
[0068]
表4 2-硝酸-5-乙酸异山梨酯面积与浓度曲线关系表
[0069][0070]
由表3可知，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯在0.55～10.97μg/ml范围内，浓度和峰面积线性关系良好。
[0071]
表5 2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯峰面积与浓度曲线关系表
5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯，制备成80％、100％、120％三个浓度的供试品，每个浓度平行制备三份，按照上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表5。
[0083]
表5回收率实验
[0084]
[0085][0086]
2.7耐用性实验
[0087]
1)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent sb c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃，流速为1.0ml/min。
[0088]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0089][0090]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0091]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.698min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.985min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.007min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.563min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯14.986min，硝酸异山梨酯为18.501min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0092]
2)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为kromasil c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃，流速为1.0ml/min。
[0093]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0094][0095]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0096]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.398min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.762min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯11.921min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.482min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯14.986min，硝酸异山梨酯为18.301min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0097]
3)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温30℃，流速为1.0ml/min。
[0098]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0099][0100]
测定:取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0101]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.408min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.753min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯11.821min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯11.856min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯13.322min，硝酸异山梨酯为18.013min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0102]
4)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温20℃，流速为1.0ml/min。
[0103]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0104][0105][0106]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0107]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为9.012min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为9.312min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.405min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.921min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.346min，硝酸异山梨酯为18.787min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0108]
5)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，
柱温25℃，流速为1.2ml/min。
[0109]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0110][0111]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0112]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为7.956min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.321min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯11.420min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯12.982min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯14.269min，硝酸异山梨酯为17.669min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0113]
6)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃，流速为0.8ml/min。
[0114]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0115][0116]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0117]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为9.362min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为9.601min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.705min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯14.236min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.644min，硝酸异山梨酯为19.023min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0118]
7)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为205nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，
柱温25℃，流速为1.0ml/min。
[0119]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0120][0121]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0122]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.719min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为9.015min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.114min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.669min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.028min，硝酸异山梨酯为18.505min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0123]
8)仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为agilent c18(250
×
4.6mm，5μm)；检测波长为215nm；以水为溶剂，以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃，流速为1.0ml/min。
[0124]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0125][0126]
测定：取对照品适量，用水配制成单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0127]
在此条件下，2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.793min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为9.022min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.129min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.674min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯15.032min，硝酸异山梨酯为18.599min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0128]
实施例1
[0129]
仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为kromasil c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃,流速为1.0ml/min，进样量为20μ1；
[0130]
以体积比计,所述梯度洗脱的设置为：
[0131][0132][0133]
实验：
[0134]
1、取对照品适量，用水配制成含单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，hplc图谱见附图3。
[0135]
由图3可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.691min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.966min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯12.020min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯13.531min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯14.989min，硝酸异山梨酯为18.504min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0136]
2、取单硝酸异山梨酯原料适量，用水制成约1.0mg/ml的溶液，依法测定，hplc图谱见附图4。
[0137]
由图4可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.711min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.972min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯14.990min，硝酸异山梨酯为18.510min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0138]
3、取单硝酸异山梨酯片适量，用水制成约1.0mg/ml的溶液，依法测定，hplc图谱见附图5。
[0139]
由图5可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为8.682min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为8.701min，2-乙酸-5-硝酸异山梨酯14.876min，硝酸异山梨酯为18.498min，无干扰有关物质检测的杂质峰。
[0140]
对比实施例1
[0141]
仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为kromasil c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为流动相a，以甲醇为流动相b，等度洗脱，柱温25℃,流速为1.0ml/min，进样量为20μ1；
[0142]
以体积比计，所述等度洗脱的设置为：a:b-60:40。
[0143]
实验：
[0144]
1、取对照品适量，用水配制成含单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0145]
由色谱图可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为10.659min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为11.669min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯16.958min，硝酸异山梨酯为24.632min，其中，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯峰形较差，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯未检测到。
[0146]
2、取单硝酸异山梨酯原料适量，用水制成约1.0mg/ml的溶液，依法测定，记录色谱图。
[0147]
由色谱图可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为10.884min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为11.774min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯16.996min，硝酸异山梨酯为24.698min，其中，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯峰形较差，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯未检测到。
[0148]
3、取单硝酸异山梨酯片适量，用水制成约1.0mg/ml的溶液，依法测定，记录色谱图。
[0149]
由色谱图可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为10.925min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为10.824min，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯17.002min，硝酸异山梨酯为24.745min，其中，2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯峰形较差，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯未检测到。
[0150]
对比实施例2
[0151]
仪器与条件：waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱为beh c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；检测波长为210nm；以水为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱，柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为20μ1；
[0152]
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
[0153][0154]
实验：
[0155]
1、取对照品适量，用水配制成含硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯各约0.5μg/ml的对照品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0156]
由色谱图可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为6.105min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为6.322min，2-硝酸-5-乙酸异山梨酯8.3332min，硝酸异山梨酯为16.022min，峰形差，无2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯峰。
[0157]
2、取单硝酸异山梨酯原料适量，用水制成约1.0mg/ml的溶液，依法测定，记录色谱图。
[0158]
由色谱图可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为6.006min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为6.210min，硝酸异山梨酯为16.156min，峰形差，无2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯峰。
[0159]
3、取单硝酸异山梨酯片适量，用水制成约1.0mg/ml的溶液，依法测定，记录色谱图。
[0160]
由色谱图可见：2-单硝酸异山梨酯的保留时间为5.968min，单硝酸异山梨酯主峰的保留时间为6.023min，硝酸异山梨酯为16.008min，峰形差，无2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯峰。
[0161]
由上述试验结果可知：利用本发明的检测方法可以有效的检测单硝酸异山梨酯原料及其制剂中有关物质的含量，空白辅料与空白溶剂对单硝酸异山梨酯原料及其制剂中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、2-硝酸-5-乙酸异山梨酯、2-乙酸-5-硝酸异甘露醇酯、2-乙酸-5-硝酸异山梨酯均无干扰，因此本方法可用于单硝酸异山梨酯原料及其制剂的质量控制。
[0162]
由试验结果可知：利用本发明的检测方法可以有效的检测单硝酸异山梨酯原料及其制剂中有关物质的含量，而且该方法分离度高，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠，从而可用于单硝酸异山梨酯原料及其制剂中有关物质的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。