P16和MCM2、Ki67免疫组织化学检测试剂盒的制作方法

p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒
技术领域
1.本实用新型涉及免疫组织检测试剂盒技术领域，具体为p16和mcm2、ki67 免疫组织化学检测试剂盒。


背景技术：

2.p16基因又名多肿瘤抑癌基因(multipletumorsuppressor1，mts)，其表达的抑癌蛋白p16是细胞周期进展负调节蛋白。当人乳头瘤病毒整合感染宫颈上皮细胞后，引入并激活致癌基因e7，促使致癌蛋白e7表达，抑制prb与e2f蛋白结合，促进宫颈上皮细胞增殖；当细胞增殖过度，将激活细胞增殖负反馈调节机制，即通过激活抑癌基因p16，促使抑癌蛋白p16表达，促进 prb与e2f蛋白结合，从而抑制宫颈上皮细胞过度增殖。
3.mcm2、ki
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67基因是与细胞增殖相关的基因，其表达因细胞周期时相不同而异，开始表达于细胞周期的g1期，在s期及g2期表达增加，至m期达高峰，在细胞有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇，其g0期不表达。由于其半衰期短，不易受生长因子诱导，可作为评价细胞生长分数的指标。
4.现有的检测试剂盒通过免疫组织化学单染色检测，即单次通过免疫组织化学的方法仅检测p16基因或者仅检测mcm2、ki
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67基因。
5.市场上的免疫组织检测试剂盒在使用中，在宫颈癌筛查中，单次通过免疫组织化学的方法仅检测p16基因或者仅检测mcm2、ki
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67基因的方法，检测费时费力，需要同时处理两个样本，然后进行检测获得结果，较为复杂，染色液易陈旧，而且染色效果不稳定，影响实验人员的病理阅片的准确性，不便于观察，检测的准确率低，两次单染费事费力，但如果三染结合，就需要大量的试剂组装在同一试剂盒中。试剂盒结构就更需要完善，同样的三染试剂盒，其缓冲溶液由于装量较大，会分为两管进行分装，这造成了污染的可能性，但同时一管装量较大的缓冲液可能会增加试剂盒体积，为此，我们提出p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒。


技术实现要素：

6.本实用新型的目的在于提供p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的在宫颈癌筛查中，单次通过免疫组织化学的方法仅检测p16基因或者仅检测mcm2、ki
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67基因的方法，检测费时费力，需要同时处理两个样本，然后进行检测获得结果，较为复杂，染色液易陈旧，而且染色效果不稳定，影响实验人员的病理阅片的准确性，不便于观察，检测的准确率低，两次单染费事费力，但如果三染结合，就需要大量的试剂组装在同一试剂盒中。试剂盒结构就更需要完善，同样的三染试剂盒，其缓冲溶液由于装量较大，会分为两管进行分装，这造成了污染的可能性，但同时一管装量较大的缓冲液可能会增加试剂盒体积的问题。
7.为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒，包括盒体和第一无菌装置孔，所述盒体内壁贴合有衬垫，且衬垫上表面边缘设
置有第一容器孔，所述第一容器孔一侧分布有第二容器孔，且第二容器孔一侧分布有第三容器孔，所述第三容器孔一侧分布有第四容器孔，所述第一容器孔右侧分布有第五容器孔，且第五容器孔一侧分布有第六容器孔，所述第六容器孔一侧分布有第七容器孔，且第七容器孔一侧分布有第八容器孔，所述第一无菌装置孔分布于第八容器孔右侧，且第一无菌装置孔右侧分布有第二无菌装置孔，所述第一无菌装置孔一端设置有第一活页，所述第二无菌装置孔一端设置有第二活页。
8.优选的，所述盒体内壁与衬垫的外壁相贴合，且盒体与衬垫的竖直中轴线重合。
9.优选的，所述第一容器孔、第二容器孔、第三容器孔与第四容器孔的水平中轴线重合，且第一容器孔与第四容器孔关于衬垫的水平中轴线呈对称分布。
10.优选的，所述第五容器孔、第六容器孔、第七容器孔与第八容器孔的水平中轴线重合，且第五容器孔与第八容器孔关于衬垫的水平中轴线呈对称分布。
11.优选的，所述第一无菌装置孔与第二无菌装置孔的水平中轴线平行，且第一无菌装置孔的长宽尺寸与第二无菌装置孔的长宽尺寸相等。
12.优选的，所述第一活页与第一无菌装置孔之间为活动连接，且第一活页与第一无菌装置孔的竖直中轴线重合。
13.与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：该p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒设置有第一容器孔，第一容器孔与第四容器孔关于衬垫的水平中轴线呈对称分布，第一容器孔、第二容器孔、第三容器孔与第四容器孔内部均放置有试剂瓶，且试剂瓶内分别盛装有p16一抗浓缩液，ki
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67一抗浓缩液、mcm2一抗浓缩液和抗体稀释液，p16和mcm2、ki
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67的免疫组织化学三染色检测高效，稳定，能够很好的满足科学、工作的需要。
14.第五容器孔与第八容器孔关于衬垫的水平中轴线呈对称分布，第五容器孔、第六容器孔、第七容器孔与第八容器孔内部均放置有试剂瓶，且试剂瓶内分别盛装有羊抗鼠二抗工作液，羊抗兔二抗工作液，dab染色底物、dab染色底物，方便使用者进行免疫组织化学染色试验，p16和mcm2、ki
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67的免疫组织化学三染色，在染色过程中，将两种蛋白的一抗混合后孵育样本，同时在一张样本制片上检测两种蛋白的表达，在准确筛查宫颈癌早期的前提下，还能做到廉价快捷，几乎加快了一倍的检测速度。这点优于同类的免疫组织化学单染检测p16基因或者仅检测mcm2、ki
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67基因试剂盒。p16和mcm2、 ki
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67的免疫组织化学三染法的结果显示在同一张样本制片上，即在同一张样本制片上显示结果，提高了实验人员的病理阅片的准确性，便于观察，检测的准确率提高，降低了假阳性及假阴性的可能，降低了误判的可能性。
15.第一活页与第一无菌装置孔的竖直中轴线重合，通过该结构，使用者需要提起第一活页、第二活页然后取出试剂瓶使用，使用者操作更加方便。
附图说明
16.图1为本实用新型整体结构示意图；
17.图2为本实用新型第一无菌装置孔结构示意图；
18.图3为本实用新型第一活页结构示意图。
19.图中：1、盒体；2、衬垫；3、第一容器孔；4、第二容器孔；5、第三容器孔；6、第四容器孔；7、第五容器孔；8、第六容器孔；9、第七容器孔； 10、第八容器孔；11、第一无菌装置孔；
12、第二无菌装置孔；13、第一活页；14、第二活页。
具体实施方式
20.下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
21.请参阅图1
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3，本实用新型提供一种技术方案：p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒，包括盒体1、衬垫2、第一容器孔3、第二容器孔4、第三容器孔5、第四容器孔6、第五容器孔7、第六容器孔8、第七容器孔9、第八容器孔10、第一无菌装置孔11、第二无菌装置孔12、第一活页13和第二活页14，盒体1内壁贴合有衬垫2，盒体1内壁与衬垫2的外壁相贴合，且盒体1与衬垫2的竖直中轴线重合，该结构的设置，使得该试剂盒结构紧凑、携带方便、重复性好、省时省力，衬垫2的设置可以缓冲装置晃动时对盒体1内部的试剂瓶产生的冲击，保证试剂瓶的安全，满足使用者的需求；
22.衬垫2上表面边缘设置有第一容器孔3，第一容器孔3一侧分布有第二容器孔4，且第二容器孔4一侧分布有第三容器孔5，第三容器孔5一侧分布有第四容器孔6，第一容器孔3、第二容器孔4、第三容器孔5与第四容器孔6 的水平中轴线重合，且第一容器孔3与第四容器孔6关于衬垫2的水平中轴线呈对称分布，第一容器孔3、第二容器孔4、第三容器孔5与第四容器孔6 内部均放置有试剂瓶，且试剂瓶内分别盛装有p16一抗浓缩液，ki
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67一抗浓缩液、mcm2一抗浓缩液和抗体稀释液，p16和mcm2、ki
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67的免疫组织化学三染色检测高效，稳定，能够很好的满足科学、工作的需要；
23.第一容器孔3右侧分布有第五容器孔7，且第五容器孔7一侧分布有第六容器孔8，第六容器孔8一侧分布有第七容器孔9，且第七容器孔9一侧分布有第八容器孔10，第一无菌装置孔11分布于第八容器孔10右侧，第五容器孔7、第六容器孔8、第七容器孔9与第八容器孔10的水平中轴线重合，且第五容器孔7与第八容器孔10关于衬垫2的水平中轴线呈对称分布，第五容器孔7、第六容器孔8、第七容器孔9与第八容器孔10内部均放置有试剂瓶，且试剂瓶内分别盛装有羊抗鼠二抗工作液，羊抗兔二抗工作液，dab染色底物 9、dab染色底物，方便使用者进行免疫组织化学染色试验，p16和mcm2、ki
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67 的免疫组织化学三染色，在染色过程中，将两种蛋白的一抗混合后孵育样本，同时在一张样本制片上检测两种蛋白的表达，在准确筛查宫颈癌早期的前提下，还能做到廉价快捷，几乎加快了一倍的检测速度。这点优于同类的免疫组织化学单染检测p16基因或者仅检测mcm2、ki
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67基因试剂盒。p16和mcm2、 ki
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67的免疫组织化学三染法的结果显示在同一张样本制片上，即在同一张样本制片上显示结果，提高了实验人员的病理阅片的准确性，便于观察，检测的准确率提高，降低了假阳性及假阴性的可能，降低了误判的可能性；
24.第一无菌装置孔11右侧分布有第二无菌装置孔12，第一无菌装置孔11 与第二无菌装置孔12的水平中轴线平行，且第一无菌装置孔11的长宽尺寸与第二无菌装置孔12的长宽尺寸相等，由于第一无菌装置孔11、第二无菌装置孔12中安放的缓冲液试剂瓶体积较大，为了节省空间，采用横躺设计，同时使得装置受力更加合理，延长装置的使用寿命；
25.第一无菌装置孔11一端设置有第一活页13，第二无菌装置孔12一端设置有第二活
页14，第一活页13与第一无菌装置孔11之间为活动连接，且第一活页13与第一无菌装置孔11的竖直中轴线重合，通过该结构，使用者需要提起第一活页13、第二活页14然后取出试剂瓶使用，使用者操作更加方便。
26.工作原理：对于这类的p16和mcm2、ki67免疫组织化学检测试剂盒，盒体1与衬垫2的竖直中轴线重合，该结构的设置，使试剂盒结构紧凑、携带方便、重复性好、省时省力，衬垫2的设置可以缓冲装置晃动时对盒体1内部的试剂瓶产生的冲击，保证试剂瓶的安全，满足使用者的需求，第一无菌装置孔11的长宽尺寸与第二无菌装置孔12的长宽尺寸相等，由于第一无菌装置孔11、第二无菌装置孔12中安放的缓冲液试剂瓶体积较大，为了节省空间，采用横躺设计，同时使得装置受力更加合理，延长装置的使用寿命，第一活页13与第一无菌装置孔11的竖直中轴线重合，通过该结构，使用者需要提起第一活页13、第二活页14然后取出试剂瓶使用，使用者操作更加方便。
27.该免疫组织化学染色检测方法共有七个步骤，即一抗孵育、二抗孵育、 dab染色、red染色、复染、封片和结果分析。
28.首先进行一抗孵育，试剂盒开封后，从第一容器孔3、第二容器孔4、第三容器孔5与第四容器孔6中取出试剂瓶，将1.85ml抗体稀释液和100μlp16 一抗浓缩液混合，加入到100μlmcm2、ki
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67一抗浓缩液中，配置成p16/lmcm2、 ki
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67一抗工作混合液，黏贴新标签，2～8℃避光保存，备用，滴加一抗工作混合液50μl/片，37℃湿盒孵育30min，pbst漂洗3min
×
3次，适度甩干；
29.然后进行二抗孵育，试剂盒开封后，从第五容器孔7、第六容器孔8、第七容器孔9与第八容器孔10中取出试剂瓶，将1ml羊抗鼠二抗工作液，加入到1ml羊抗兔二抗工作液中，配置成羊抗鼠/兔二抗工作混合液，黏贴新标签， 2～8℃避光保存，备用，滴加二抗工作混合液50μl/片，37℃湿盒孵育15min，pbst漂洗3min
×
3次，适度甩干；
30.再进行dab染色，取出缓冲液，制备dab工作混合液(根据样本量，取适量dab染色底物和dab染色剂缓冲液混匀)，即配即用，4h内使用完，室温(20～25℃)避光保存，滴加dab工作混合液50μl/片，室温(20～25℃) 湿盒孵育5～10min，流水冲洗3min，适度甩干(不可干片)；
31.接下来进行red染色，制备red工作混合液，即配即用，30min内使用完，室温(20～25℃)避光保存，滴加red工作混合液50μl/片，室温(20～25℃) 湿盒孵育10～30min，流水冲洗3min，适度甩干；
32.再进行复染，将细胞制片放入苏木素染料中浸染，室温(20～25℃)1s，进行复染，流水冲洗3min，吹干；
33.接下来进行封片，滴加1滴中性快速封片剂，加盖盖玻片，光学显微镜下评估结果
34.最后进行结果分析，根据同一单层细胞或者同一细胞簇的细胞核和细胞浆的染色情况进行结果分析。p16和mcm2、ki
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67抗体孵育后，dab和red染料三染，同一单层细胞或者细胞簇的细胞核显蓝色或者红色，细胞浆无染色；或者细胞核显棕色，细胞浆显棕色；或者细胞核显红色，细胞浆无染色，即判定为阴性结果，p16和mcm2、ki
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67抗体孵育后，dab染料单染，单层细胞或者细胞簇的细胞核显棕色，细胞浆显棕色；red染料单染，单层细胞或者细胞簇的细胞核显红色，细胞浆无染色，即判定为阳性结果。
35.p16和mcm2、ki
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67的免疫组织化学三染色，在染色过程中，将两种蛋白的一抗混合
后孵育样本，同时在一张样本制片上检测两种蛋白的表达，在准确筛查宫颈癌早期的前提下，还能做到廉价快捷，几乎加快了一倍的检测速度。这点优于同类的免疫组织化学单染检测p16基因或者仅检测mcm2、ki
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67 基因试剂盒。p16和mcm2、ki
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67的免疫组织化学三染法的结果显示在同一张样本制片上，即在同一张样本制片上显示结果，提高了实验人员的病理阅片的准确性，便于观察，检测的准确率提高，降低了假阳性及假阴性的可能，降低了误判的可能性。
36.尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同物限定。