内套式猪瘟病毒含量检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及动物生物制品领域，特别涉及一种内套式猪瘟病毒含量检测试剂盒。

背景技术：

猪瘟是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)引起的一种高度接触性传染病，它对全世界的养猪业构成巨大威胁。不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80～90％。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合症共存等现象。猪瘟新的流行形式给我国养猪业提出了新的挑战，免疫接种仍是防制猪瘟的重要措施。

我国的猪瘟兔化弱毒活疫苗(hclv)是世界公认的、最好的猪瘟疫苗，对世界猪瘟的防控起到了巨大作用。猪瘟疫苗的质量是决定免疫效果，而疫苗中有效病毒含量，是决定疫苗质量的重要指标。传统的猪瘟疫苗病毒含量的测定方法为兔体定型热试验方法。该法检测成本高、结果可重复性差、检验周期长，易受动物因素制约，且费时、费力，存在一定的局限性。而且常规的试剂盒的设计为一个整体的，不能满足不同保存条件试剂的保存要求，因此建立一种合理有效、快速准确的猪瘟疫苗检测方法，对于提高猪瘟疫苗的质控水平，保证猪瘟疫苗的质量尤为重要；而设计一个内套式猪瘟病毒含量检测试剂盒，可以保障猪瘟病毒含量检测操作便捷、结果稳定可靠。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本实用新型的目的是为了提供一种快速、有效、准确的猪瘟病毒含量检测试剂盒。为保证猪瘟疫苗的质量，提高疫苗的检验水平提供了一种新的快捷高效的工具。

为实现上述目的，本实用新型提供的内套式猪瘟病毒含量检测试剂盒，其特征在于：包括盒体和套盒；所述套盒位于盒体内部；

所述盒体内部还设有第一孔槽、固定液孔槽、第二孔槽、抗体稀释液孔槽、第三孔槽和第四孔槽；

所述套盒为内外2层的结构，套盒的外层为长方体、分体盖、1-2cm厚度的泡沫盒体，所述套盒的内层为塑料空心盒体；

所述塑料空心盒体内设有一抗孔槽和二抗孔槽；所述塑料空心盒体的内部充满有冷冻剂；

所述第一孔槽内存放有浓缩洗涤液pbst；

所述固定液孔槽内存放有固定液；

所述第二孔槽存放有0.5％tritonx-100溶液；

所述抗体稀释液孔槽内存放有抗体稀释液；

所述一抗孔槽和二抗孔槽内分别存放有一抗、二抗；

所述第三孔槽存放有96孔细胞板；

所述第四孔槽存放有操作说明书。

作为优选方案，所述浓缩洗涤液pbst为含有0.5％tween-20、0.1mol/l、ph7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，100ml/瓶分装，使用时用水10倍稀释。

进一步地，所述固定液为4％的甲醛溶液，100ml/瓶分装。

更进一步地，所述抗体稀释液为含1％bsa、0.01mol/l、ph7.2的磷酸盐缓冲液，100ml瓶分装。

更进一步地，所述一抗为猪瘟病毒单克隆抗体，使用时用抗体稀释液1000倍稀释，0.1ml/瓶分装。

更进一步地，所述二抗为fitc标记抗鼠igg，0.1ml/瓶分装，使用时用抗体稀释液1000倍稀释。

更进一步地，所述套盒的外层的泡沫盒体厚度为1-2cm。

本实用新型的设计方案中，试剂盒有盒体和套盒，套盒位于盒体之内，为盒体的一个小套盒。盒体内设有第一孔槽、固定液孔槽、第二孔槽、抗体稀释液孔槽、第三孔槽、第四孔槽、套盒，套盒内设有一抗孔槽、二抗孔槽。

上述的浓缩洗涤液优选为含有0.5％tween-20、0.1mol/l、ph7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，100ml/瓶分装，使用时用水10倍稀释。固定液为4％的甲醛溶液，100ml/瓶分装。抗体稀释液为含1％bsa、0.01mol/l、ph7.2的磷酸盐缓冲液，100ml瓶分装。一抗优选为猪瘟病毒单克隆抗体，可以自制也可以是商品化的产品，使用时用抗体稀释液1000倍稀释，0.1ml/瓶分装。二抗优选为商品化的fitc标记抗鼠igg，0.1ml/瓶分装，使用时用抗体稀释液1000倍稀释。套盒可以从盒体取出，存放于-20℃以下的条件。取出套盒之后的盒体存放室温条件。

本实用新型采用faid50方法测定猪瘟病毒的含量，将待检样品做10倍系列稀释，接种已长成良好bt细胞单层培养3天，固定细胞，采用猪瘟特性克隆抗体检测病毒对细胞的感染情况，用spearman-karber法计算faid50。

本实用新型的试剂盒具有以下优点：

检测成本低、结果可重复性好、实验操作方便快捷，可提高疫苗的质控水平，有效保证疫苗的质量。采用内套式设计，试剂盒设计合理，能够满足不同保存条件的试剂的存放要求，为试剂盒的质量提供了保障。

附图说明

图1为本实用新型的横切面视图。

图中：盒体1；第一孔槽2；固定液孔槽3；第二孔槽4；抗体稀释液孔槽5；一抗孔槽6；二抗孔槽7；第三孔槽8；第四孔槽9；套盒10。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对实用新型作进一步地详细描述。

以下是本实用新型的一个具体的实施方案，以进一步的阐述本实用新型，但不能解释为限制本实用新型的范围。

实施例

如图所示的内套式猪瘟病毒含量试剂盒，其中1为盒体，2为第一孔槽(内存放有浓缩洗涤液pbst)，3为固定液孔槽，4为第二孔槽(存放有0.5％tritonx-100溶液)，5为抗体稀释液孔槽，6为一抗孔槽，7为二抗孔槽，8为第三孔槽(存放有96孔细胞板)，9为第四孔槽(存放有操作说明书)，10为套盒。

内套式猪瘟病毒含量检测试剂盒的组装方法如下：

(1)浓缩洗涤液pbst：配制0.1mol/l、ph7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，加入0.5％tween-20制成，100ml/瓶分装；

(2)固定液：用水将37％的甲醛溶液稀释至4％制成，100ml/瓶分装；

(3)抗体稀释液:配制0.01mol/l、ph7.2的磷酸盐缓冲液，加入1％bsa制成，100ml瓶分装；

(4)一抗：自制或商品化猪瘟病毒单克隆抗体，0.1ml/瓶分装；

(5)二抗：商品化的fitc标记抗鼠igg，0.1ml/瓶分装；

(6)0.5％tritonx-100溶液：在水中加入tritonx-100，是的tritonx-100的终浓度为0.5％(v/v)制成,100ml/瓶分装。

每个试剂盒包含96孔细胞板孔5块，浓缩洗涤液pbst、固定液、抗体稀释液、0.5％tritonx-100溶液、一抗和二抗各1瓶，操作说明书1份。

应用例：猪瘟病毒含量检测

将bt细胞接种96孔细胞培养板，待细胞形成单层之后，将待检样品用dmem培养做10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、5个稀释度的病毒液，接种上述长满单层的细胞培养板，每个稀释度接种6孔，0.1ml/孔，同时设立正常细胞对照孔。置37℃、含5％co2培养箱中培养3天，弃去培养基，用pbst洗涤液洗涤2次，0.2ml/孔。加入固定液，0.1ml/孔，室温下固定10min，弃去固定液，用pbst洗涤液洗涤2次，0.2ml/孔。加入0.5％tritonx-100，0.2ml/孔，室温下作用10min，弃去。加入1000倍稀释的一抗，0.1ml/孔，37℃湿盒孵育45分钟，弃去1抗，用pbst洗涤液洗涤2次，0.2ml/孔。每孔加入1000倍稀释的二抗，0.1ml/孔，37℃湿盒孵育45分钟，弃去，用pbst洗涤2次，置显微镜下观察，细胞浆中出现特异性绿色荧光为病毒阳性。用spearman-karber法计算faid50。