一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片

一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片
[技术领域]
[0001]
本实用新型涉及芯片技术领域，尤其涉及一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片。
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背景技术：
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[0002]
卵巢癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤之一，不易被早期发现，严重威胁女性健康。卵巢癌早期症状隐匿，超过70％的卵巢癌患者就诊时已发展为癌症晚期。因此，寻找卵巢癌早期诊断标志物迫在眉睫。
[0003]
人附睾蛋白4(he4)是一种新型蛋白，是提高卵巢癌诊断水平的一种较有前途的生物标志物，目前大量报道表明血液中he4对卵巢癌的检测，其特异性高于ca125，人骨桥蛋白(opn)与恶性肿瘤的发生、发展及转移有着密切的关系。opn广泛分布在血液、奶液中，在卵巢癌患者组织、血液中可检测到的高表达，是新的候选标志物。目前常用的肿瘤标志物检测标本为血液标本，存在采集标本有创、不方便等缺点。尿液标本具有经济、方便、安全无创等优点，尤其适用于卵巢癌的大规模筛查。
[0004]
然而尿液中的生物标志物通常浓度极低，常规检测方法，如免疫层析、免疫比浊、酶联免疫等，存在检测灵敏度低、操作复杂、多指标检测耗费时间长等缺点，不适合尿液生物标志物的检测；化学发光虽然具有较高的灵敏度，但其存在检测设备昂贵、无法联合检测的缺点，不适合疾病的大规模筛查。蛋白芯片是近十几年来迅速发展起来的一项新技术，具有样品耗费少、高灵敏度、高通量的优点，是一种理想的多指标检测方式。然而，传统的蛋白芯片检测灵敏度低、操作复杂，限制了它在医疗诊断、尤其是癌症这类极低含量标记物的早期筛查中的应用。因此亟需开发一种灵敏度高、操作简便的检测方法和装置，用于尿液卵巢癌生物标志物的检测，提高卵巢癌的诊断水平。
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技术实现要素：
]
[0005]
为克服现有技术所存在的问题，本实用新型提供一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片。
[0006]
本实用新型解决技术问题的方案是提供一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片，包括固相载体以及包被设置于所述固相载体上的检测抗体单元和质控抗体单元；所述固相载体包括二氧化硅基座以及设置于所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体；所述检测抗体单元具体包括多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元以及多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元，所述质控抗体单元具体包括多个鸡igy质控抗体单元；且所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元呈独立单列排布于所述二氧化硅基座上。
[0007]
优选地，所述多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元为第一排布置于所述二氧化硅基座上；所述多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元为第二排布置于所述二氧化硅基座上；所述鸡igy质控抗体单元为第三排布置于所述二氧化硅基座上。
[0008]
优选地，所述第一排、所述第二排以及所述第三排之间的间距相等。
[0009]
优选地，所述第一排的多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元之间的间距相等；所述第
二排的多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元之间的间距相等；所述第三排的多个鸡igy质控抗体单元之间的间距相等。
[0010]
优选地，所述二氧化硅基座整体呈方形体结构；且所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体也为方形体结构。
[0011]
优选地，所述第一排中人附睾蛋白4(he4)抗体单元的数量为五个；所述第二排中人骨桥蛋白(opn)抗体单元的数量为五个；所述第三排中鸡igy质控抗体单元的数量为五个。
[0012]
优选地，所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元为圆形体结构。
[0013]
与现有技术相比，本实用新型一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片通过同时设置固相载体以及包被设置于所述固相载体上的检测抗体单元和质控抗体单元；所述固相载体包括二氧化硅基座以及设置于所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体；所述检测抗体单元具体包括多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元以及多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元，所述质控抗体单元具体包括多个鸡igy质控抗体单元；且所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元呈独立单列排布于所述二氧化硅基座上，基于本申请芯片的具体结构，实际应用过程中，该蛋白芯片可以用于测定人尿液中的附睾蛋白和骨桥蛋白蛋白浓度，具有无创检测、多指标联合检测、操作方便、准确度高、灵敏度高的优点。
[附图说明]
[0014]
图1是本实用新型一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片的平面结构示意图。
[具体实施方式]
[0015]
为使本实用新型的目的，技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本实用新型，并不用于限定此实用新型。
[0016]
请参阅图1，本实用新型一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片10包括固相载体以及包被设置于所述固相载体上的检测抗体单元和质控抗体单元；所述固相载体包括二氧化硅基座以及设置于所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体；所述检测抗体单元具体包括多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元以及多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元，所述质控抗体单元具体包括多个鸡igy质控抗体单元；且所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元呈独立单列排布于所述二氧化硅基座上。
[0017]
本申请通过同时设置固相载体以及包被设置于所述固相载体上的检测抗体单元和质控抗体单元；所述固相载体包括二氧化硅基座以及设置于所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体；所述检测抗体单元具体包括多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元以及多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元，所述质控抗体单元具体包括多个鸡igy质控抗体单元；且所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元呈独立单列排布于所述二氧化硅基座上，基于本申请芯片的具体结构，实际应用过程中，该蛋白芯片可以用于测定人尿液中的附睾蛋白和骨桥蛋白蛋白浓度，具有无创检测、多指标联合检测、操作方便、准确度高、灵敏度高的优点。
[0018]
优选地，所述多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元为第一排布置于所述二氧化硅基座上；所述多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元为第二排布置于所述二氧化硅基座上；所述鸡igy质控抗体单元为第三排布置于所述二氧化硅基座上。
[0019]
优选地，所述第一排、所述第二排以及所述第三排之间的间距相等。
[0020]
优选地，所述第一排的多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元之间的间距相等；所述第二排的多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元之间的间距相等；所述第三排的多个鸡igy质控抗体单元之间的间距相等。
[0021]
优选地，所述二氧化硅基座整体呈方形体结构；且所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体也为方形体结构。
[0022]
优选地，所述第一排中人附睾蛋白4(he4)抗体单元的数量为五个；所述第二排中人骨桥蛋白(opn)抗体单元的数量为五个；所述第三排中鸡igy质控抗体单元的数量为五个。
[0023]
优选地，所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元为圆形体结构。
[0024]
本申请的蛋白芯片用于测定人尿液中的he4和opn蛋白浓度，具有无创检测、多指标联合检测、操作方便、准确度高、灵敏度高的优点，适合卵巢癌的诊断和筛查。
[0025]
本申请具体是基于以下发现提出的：常用的肿瘤标志物检测标本为血液标本，存在采集标本有创、不方便等缺点，尿液标本具有经济、方便、安全无创等优点。发明人意外发现，尿液标本中含有he4和opn蛋白，并且可以作为卵巢癌诊断的指标，但he4和opn在尿液中的含量极低，难以被常规的方法检测到。
[0026]
由此，本实用新型提出了卵巢癌诊断多指标蛋白芯片，所述蛋白芯片由固相载体和包被在固相载体上的检测抗体和质控抗体组成。
[0027]
在本实用新型的一些实施例中，所述固相载体由二氧化硅基底和固定在基底四角的支柱构成。由此，可以通过点样技术将特定的蛋白按预定的序列固定到固相载体上，方便实现生物标志物的联合检测，同时检测he4和opn两种标志物。
[0028]
在本实用新型的一些实施例中，所述检测抗体是人附睾蛋白4(he4)抗体和人骨桥蛋白(opn)抗体。
[0029]
在本实用新型的一些实施例中，所述质控抗体是鸡igy抗体。
[0030]
在本实用新型的一些实施例中，所述检测抗体和质控抗体在固相载体上有五个重复。
[0031]
在本实用新型的一些实施例中，所述蛋白芯片用于人尿液中的附睾蛋白4(he4)和骨桥蛋白(opn)蛋白浓度的测定，测定步骤为：(1)向离心管中加入20
‑
30ml尿液和2μl检测抗体；(2)将蛋白芯片放入离心管中，盖紧管盖，摇动反应1h；(3)取出蛋白芯片，清洗，甩干；(4)用生物芯片阅读仪扫描芯片表面，得到各点的荧光强度值。
[0032]
本实用新型通过检测尿液标本中的卵巢癌标志物，对女性卵巢癌进行诊断、筛查，具有以下有益效果：
[0033]
(1)无创检测。
[0034]
根据本实用新型的一个实施例，可使用20
‑
30ml尿液样本进行检测，相比目前使用的血液检测方法，减轻病人的痛苦。
[0035]
(2)多指标联合检测。可对两个标志物同时检测，不仅提高了检测准确性，而且更高效。
[0036]
(3)操作方便。只需把蛋白芯片放入尿液中反应，清洗、扫描后就能得到结果。
[0037]
(4)灵敏度高。使用20
‑
30ml尿液，样本用量是常规方法的30倍，更多的尿液标志物被富集到蛋白芯片上，提高灵敏度。
[0038]
根据本实用新型的一个方面，本实用新型提出了卵巢癌诊断多指标蛋白芯片，所述蛋白芯片由固相载体和包被在固相载体上的检测抗体和质控抗体组成。所述固相载体由二氧化硅基底和固定在基底四角的支柱构成。由此，可以通过点样技术将特定的蛋白按预定的序列固定到固相载体上，方便实现生物标志物的联合检测，同时检测he4和opn两种标志物。
[0039]
根据本实用新型的一个方面，与普通的蛋白芯片不同的是，本实用新型在蛋白芯片四角固定有支柱，由此，在尿液样本与蛋白芯片反应过程中，由于支柱对蛋白芯片表面的保护，可以防止固定在蛋白芯片表面的抗体接触到反应容器而损伤蛋白芯片，从而使得本实用新型的蛋白芯片能够与大体积的样本中进行反应，提高检测灵敏度。进一步，由于支柱对蛋白芯片表面的保护，反应过程中可以进行摇动混匀，增加样本与芯片的接触机会，使尿液样本中的标志物更多地被富集在芯片表面，进一步提高检测灵敏度。
[0040]
根据本实用新型的另一个方面，检测抗体是人附睾蛋白4(he4)抗体和人骨桥蛋白(opn)抗体，质控抗体是鸡igy抗体。质控抗体的加入，可以控制蛋白芯片质量，减少蛋白芯片间的差异，同时对整个实验过程进行质控，提高检测的准确度。
[0041]
根据本实用新型的另一个方面，检测抗体和质控抗体在固相载体上有五个重复，最终的荧光检测结果取这五个重复的平均值，由此，可以减小随机误差，提高数据的可靠性，进一步提高准确度。
[0042]
根据本实用新型的另一个方面，所述蛋白芯片用于人尿液中的附睾蛋白4(he4)和骨桥蛋白(opn)蛋白浓度的测定，测定步骤为：(1)向离心管中加入20
‑
30ml尿液和2μl检测抗体；(2)将蛋白芯片放入离心管中，盖紧管盖，摇动反应1h；(3)取出蛋白芯片，清洗，甩干；(4)用生物芯片阅读仪扫描芯片表面，得到各点的荧光强度值。本实用新型的样本用量是常规方法的30倍，更多的尿液标志物被富集到蛋白芯片上，提高了灵敏度。
[0043]
实施例1
[0044]
(1)蛋白芯片点样
[0045]
将he4、opn和鸡igy抗体分别用pbs稀释到0.2mg/ml，并通过微量蛋白打印仪gesim nano
‑
plotter tm 2.1打印到固相载体上每孔的第一排、第二排和第三排，每种抗体5个点重复，每个点打印2nl。将点样后的蛋白芯片在室温下孵育0.5h，然后37℃真空孵育过夜，第二天进行检测。
[0046]
(2)抗原检测
[0047]
将点样后的芯片在含1％bsa的pbs中摇动1小时封闭，以减少非特异性结合。每管分别加入20ml系列浓度梯度的he4抗原和opn抗原(10ng/ml)的混合物，然后分别加入2μl荧光染料irdye800标记的检测抗体(4nmol/l)，摇动1小时。芯片用纯水清洗一次，离心机甩干。
[0048]
(3)荧光测量
[0049]
用midasca生物芯片阅读仪扫描该芯片，选择800纳米通道、激光强度设置为7.0、分辨率设置为20微米。扫描后获得16位灰度图像。用midascan software v1.0.0或更高版本软件分析该图像。选择栅阵列分析模式测量每个点的强度，点阵的形貌由程序自动识别。每个点的强度通过所选区域总信号强度除以面积获得。图像上平行的5个点的平均荧光强度被定义为测试的强度。
[0050]
(4)数据分析
[0051]
不同浓度的抗原测得的荧光强度如表1所示，结果显示卵巢癌诊断多指标蛋白芯片检测he4、opn抗原时，灵敏度都可以达到0.01ng/ml。
[0052]
表1不同浓度的he4、opn抗原和鸡igy测得的荧光强度
[0053][0054]
与现有技术相比，本实用新型一种卵巢癌诊断多指标蛋白芯片10通过同时设置固相载体以及包被设置于所述固相载体上的检测抗体单元和质控抗体单元；所述固相载体包括二氧化硅基座以及设置于所述二氧化硅基座四个对角部位的支柱体；所述检测抗体单元具体包括多个人附睾蛋白4(he4)抗体单元以及多个人骨桥蛋白(opn)抗体单元，所述质控抗体单元具体包括多个鸡igy质控抗体单元；且所述人附睾蛋白4(he4)抗体单元、人骨桥蛋白(opn)抗体单元、鸡igy质控抗体单元呈独立单列排布于所述二氧化硅基座上，基于本申请芯片的具体结构，实际应用过程中，该蛋白芯片可以用于测定人尿液中的附睾蛋白和骨桥蛋白蛋白浓度，具有无创检测、多指标联合检测、操作方便、准确度高、灵敏度高的优点。
[0055]
以上所述的本实用新型实施方式，并不构成对本实用新型保护范围的限定。任何在本实用新型的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的权利要求保护范围之内。