一种液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置及分析系统的制作方法

1.本实用新型涉及烟草蛋白分析技术领域，具体涉及一种液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置及分析系统。


背景技术：

2.在植物生化研究领域，烟草作为重要的模式植物被广泛研究。2011年烟草首张全基因组绘制成功，烟草进入蛋白组学研究，植物基因常有四倍体甚至八倍体，因此植物蛋白的转录翻译更为复杂。烟草蛋白种类繁多，含量差异较大，传统的蛋白分析鉴定方法在分析低丰度蛋白时，受到高丰度蛋白的影响较大，对检测结果产生不利影响。目前，植物蛋白组检测技术主要有双向电泳(2
‑
de)、双向荧光差异凝胶电泳(dige)、同位素亲和标签(icat)、同重同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，itraq)。 2
‑
de方法由于重复性差，逐渐被dige法取代。dige法仍存在蛋白质点被污染的问题。icat 技术将活性反应基团引入，提高蛋白鉴定的灵敏度，但标记效率低，制约了蛋白鉴定的准确性和重复性。itraq仅能对标记上的多肽及相应蛋白进行分析，限制了检测目标蛋白的范围。


技术实现要素：

3.鉴于以上所述现有技术的缺点，本实用新型的目的在于提供一种液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置及分析系统。所述分离装置通过阵列式二维色谱装置进行分离，多根色谱柱同时分离检测效率高，具有高通量、分离效果良好的特点。所述分析系统采用阵列式多维液相色谱串联质谱，将高低丰度蛋白分别进行分析鉴定，并将检测结果相结合，得到完整的烟草蛋白的生物学信息。该分离装置及分析系统能够快速、高效地分离及分析鉴定烟草高丰度和低丰度蛋白，鉴定出的低丰度蛋白信息丰富，高丰度蛋白能够实现在阵列二维色谱中位置定位。
4.为实现上述目的及其他相关目的，本实用新型第一方面提供一种液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置，包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和馏分收集器；
5.所述第一维色谱单元包括第一泵、至少6个接口的第一多通阀、第一色谱柱、第一检测器和至少4个接口的第二多通阀；
6.所述第二维色谱单元包括第二泵、至少三个接口的第三多通阀、至少2个通道的分流器、至少2个捕集柱的捕集柱阵列、至少2个分流阀的分流阀阵列和至少2个第二色谱柱的第二色谱柱阵列；
7.所述第一多通阀分别与所述第一泵、第一色谱柱的进样端相连通，第一色谱柱的出样端、所述第一检测器、所述第二多通阀沿样品流通方向依次连通；
8.所述分流阀阵列分别与所述第二多通阀、所述捕集柱阵列、第二色谱柱阵列的进样端相连通，所述第三多通阀分别与所述第二泵、所述分流器相连通，所述分流器与所述捕集柱阵列连通；
9.所述第二色谱柱阵列的出样端与所述馏分收集器连通。
10.本实用新型第二方面提供一种阵列式多维液相色谱串联质谱分析烟草高低丰度蛋白的分析系统，包括：
11.上述分离装置，用于将烟草样品通过阵列式多维液相色谱分离烟草高低丰度蛋白并收集馏分；
12.蛋白含量测定单元，用于测定经所述分离装置获得的收集馏分的蛋白含量，确定高丰度蛋白所在的馏分和低丰度蛋白所在的馏分；
13.高丰度蛋白ms或lc
‑
ms分析单元，用于检测每个高丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息或全高丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息；
14.低丰度蛋白lc
‑
ms分析单元，用于检测全低丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息。
15.本实用新型具有如下有益效果中的至少一项：
16.1)本实用新型多根色谱柱同时分离分析，检测效率高；
17.2)本实用新型通过阵列式馏分转移方式有效去除高丰度蛋白的影响，鉴定出的低丰度蛋白信息丰富；
18.3)本实用新型实现高丰度蛋白在阵列二维色谱中位置定位；
19.4)本实用新型系统构建简单、自动化程度高，可调节参数多。
附图说明
20.图1为本实用新型液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置的示意图。
21.图2为本实用新型液相色谱串联质谱分析烟草高低丰度蛋白的分析系统图。
22.图3为本实用新型液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置及分析系统的分离及部分高丰度蛋白鉴定结果。
23.附图标记
24.25.26.27.28.具体实施方式
29.以下通过特定的具体实例说明本实用新型的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本实用新型的其他优点与功效。本实用新型还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本实用新型的精神下进行各种修饰或改变。
30.如图1所示，一种液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置，包括第一维色谱单元1、第二维色谱单元2和馏分收集器3；
31.所述第一维色谱单元1包括第一泵11、至少6个接口的第一多通阀12、第一色谱柱13、第一检测器14和至少4个接口的第二多通阀15；
32.所述第二维色谱单元2包括第二泵21、至少三个接口的第三多通阀22、至少2个通道的分流器23、至少2个捕集柱的捕集柱阵列24、至少2个分流阀的分流阀阵列25和至少2个第二色谱柱的第二色谱柱阵列26；
33.所述第一多通阀12分别与所述第一泵11、第一色谱柱13的进样端相连通，第一色谱柱 13的出样端、所述第一检测器14、所述第二多通阀15沿样品进样方向依次连通；
34.所述分流阀阵列25分别与所述第二多通阀15、所述捕集柱阵列24、第二色谱柱阵列26 的进样端相连通，所述第三多通阀22分别与所述第二泵21、所述分流器23相连通，所述分流器23与所述捕集柱阵列24连通；
35.所述第二色谱柱阵列26的出样端与所述馏分收集器3连通。
36.本实用新型分离装置以二维色谱为基础，搭建离子交换
‑
反相液相
‑
反相液相(iec
‑
rp
‑
rp) 装置。烟草蛋白提取产物在阵列式二维液相色谱中分离，首先，采用第一维色谱单元1如离子交换色谱分别将馏分收集到捕集柱阵列24中；其次，通过第三多通阀22切换
馏分被转移至第二色谱柱阵列26如反相液相色谱柱阵列；最后，经第二色谱柱阵列26分离后的馏分被馏分收集器3收集，待分析。烟草蛋白提取产物可以采用“苯酚法”提取。
37.在一个优选的实施例中，所述第一多通阀12为二位多通阀，所述第一多通阀12至少设有第一多通阀第一接口121、第一多通阀第二接口122、第一多通阀第三接口123、第一多通阀第四接口124、第一多通阀第五接口125和第一多通阀第六接口126，所述第一多通阀第一接口121为进样口，所述第一多通阀第二接口122与所述第一多通阀第五接口125相连通，所述第一多通阀第三接口123与所述第一泵11相连通，所述第一多通阀第四接口124与所述第一色谱柱13相连通，所述第一多通阀第六接口126为排废口。
38.所述第一多通阀12至少6个接口，如可以为六通阀、八通阀等，若多于6个接口，其他接口使用堵头进行封闭。
39.在一个优选的实施例中，所述第一多通阀12为二位多通阀；
40.第一位置关系为：所述第一多通阀第一接口121与所述第一多通阀第六接口126相连通；所述第一多通阀第二接口122与所述第一多通阀第三接口123相连通；所述第一多通阀第四接口124与所述第一多通阀第五接口125相连通；该位置为进样(inject)位置，由第一泵输送的流动相推动样品进入第一色谱柱13和第一检测器14进行分析；
41.第二位置关系为：所述第一多通阀第一接口121与所述第一多通阀第二接口122相连通；所述第一多通阀第三接口123与所述第一多通阀第四接口124相连通；所述第一多通阀第五接口125与所述第一多通阀第六接口126相连通。该位置为取样(load)位置，多余样品从所述第一多通阀第六接口126排出。
42.在一个优选的实施例中，所述第二多通阀15设有4～18个接口，所述分流器23设有2～16 个通道；所述捕集柱阵列24设有2～16个捕集柱；所述分流阀阵列25设有2～16个分流阀；所述第二色谱柱阵列26设有2～16个第二色谱柱。所述第二多通阀15、所述分流器23、所述捕集柱阵列24、所述分流阀阵列25和所述第二色谱柱阵列26对应设置，形成阵列式二维液相色谱。
43.在一个优选的实施例中，所述第二多通阀15设有第二多通阀第一接口151、第二多通阀第二接口152和两个以上第二多通阀分接口，所述第二多通阀第一接口151与所述第一色谱柱13连通，所述第二多通阀第二接口152通过切换与所述两个以上第二多通阀分接口之任一选择连通。
44.如图1所示，所述第二多通阀15为十通阀，设有第二多通阀第一接口151、第二多通阀第二接口152和8个第二多通阀分接口即第二多通阀第三接口153、第二多通阀第四接口154、第二多通阀第五接口155、第二多通阀第六接口156、第二多通阀第七接口157、第二多通阀第八接口158、第二多通阀第九接口159和第二多通阀第十接口1510，还有一个接口使用堵头进行封闭，所述第二多通阀第一接口151与所述第一色谱柱13连通，所述第二多通阀第二接口152通过切换与所述第二多通阀第三接口153、所述第二多通阀第四接口154、所述第二多通阀第五接口155、所述第二多通阀第六接口156、所述第二多通阀第七接口157、所述第二多通阀第八接口158、所述第二多通阀第九接口159和所述第二多通阀第十接口1510之任一选择连通。
45.在一个优选的实施例中，所述第三多通阀22至少设有第三多通阀第一接口221、第三多通阀第二接口222和第三多通阀第三接口223，所述第一接口221与所述第二泵21相连
通，所述第二接口222与所述分流器23相连通，所述第三接口223为排废口。
46.在一个优选的实施例中，所述第三多通阀22为二位多通阀；
47.第一位置关系为：所述第三多通阀第一接口221与所述第三多通阀第二接口222相连通；
48.第二位置关系为：所述第三多通阀第二接口222与所述第三多通阀第三接口223相连通。
49.在一个优选的实施例中，所述分流器23设有分流器进口231和2个以上分流器通道，所述分流器进口231与所述第三多通阀22连通，所述2个以上分流器通道分别与所述捕集柱阵列24的捕集柱连通。
50.如图1所示，所述分流器23设有分流器进口231和8个分流器通道即分流器第一通道 232、分流器第二通道233、分流器第三通道234、分流器第四通道235、分流器第五通道236、分流器第六通道237、分流器第七通道238和分流器第八通道239，所述分流器进口231与所述第三多通阀22连通，所述分流器第一通道232、所述分流器第二通道233、所述分流器第三通道234、所述分流器第四通道235、所述分流器第五通道236、所述分流器第六通道237、所述分流器第七通道238和所述分流器第八通道239分别与所述捕集柱阵列24的捕集柱连通。
51.在一个优选的实施例中，所述第一色谱柱13为wax离子交换色谱柱。
52.在一个优选的实施例中，所述第一检测器14为紫外检测器。
53.在一个优选的实施例中，所述第二维色谱单元2为反相液相色谱。
54.在一个优选的实施例中，所述馏分收集器3包括至少2个收集针的收集针阵列31，移动平台32和至少24孔的多孔收集板33，所述第二色谱柱阵列26的出样端与所述收集针阵列 31连通，所述收集针阵列31设于所述移动平台32上，所述收集针阵列31设于所述多孔收集板33的上方。
55.所述馏分收集器3包括至少8个收集针的收集针阵列31，移动平台32和至少96孔的多孔收集板33，所述第二色谱柱阵列26的出样端与所述收集针阵列31连通，所述收集针阵列 31设于所述移动平台32上，所述收集针阵列31设于所述多孔收集板33的上方。
56.一种阵列式多维液相色谱串联质谱分析烟草高低丰度蛋白的分析系统，如图2所示，包括：
57.上述分离装置i
‑
1，用于将烟草样品通过阵列式多维液相色谱分离烟草高低丰度蛋白并收集馏分；
58.蛋白含量测定单元i
‑
2，用于测定经所述分离装置i
‑
1获得的收集馏分的蛋白含量，确定高丰度蛋白所在的馏分和低丰度蛋白所在的馏分；
59.高丰度蛋白ms或lc
‑
ms分析单元i
‑
3，用于检测每个高丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息或全高丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息；
60.低丰度蛋白lc
‑
ms分析单元i
‑
4，用于检测全低丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息。
61.通过分离装置i
‑
1中馏分收集器3收集阵列式多维液相色谱分离后的馏分，经蛋白含量测定单元i
‑
2测定蛋白含量，将收集到的馏分归为含有高丰度蛋白及低丰度蛋白两类。对于含有高丰度蛋白的馏分，经高丰度蛋白ms分析单元逐个进行质谱分析，获取各个馏分中的蛋白质组学信息，并对高丰度蛋白在阵列二维色谱中进行定位，或者，对于高丰度蛋白
组成的馏分，合并后经高丰度蛋白lc
‑
ms分析单元进行lc
‑
ms分析，获取全高丰度蛋白馏分的蛋白质组学信息；对于低丰度蛋白组成的馏分，合并后经低丰度蛋白lc
‑
ms分析单元i
‑
4进行分析，得到低丰度蛋白的整体分析结果。最后将两部分的检测结果相结合，得到完整的烟草提取蛋白的生物学信息。
62.实施例1
63.1.材料与试剂
64.蔗糖，氯化钾，乙二胺四乙酸，三羟甲基氨基甲烷，氯化氢，三氟乙酸，饱和苯酚的tris
‑
hcl 溶液，乙腈(hplc级纯)，甲醇(hplc级纯)，丙酮(hplc级纯)，醋酸铵，碳酸氢铵，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，胰蛋白酶均购自sigma
‑
aldrich。
65.2.烟草前处理步骤
66.取约5g烟草叶，将其剪成小片，向研钵中加入一定量液氮，将烟草叶研磨至粉末状。加入蔗糖提取液(0.7m蔗糖；0.1mkcl；50mm edta；0.5m tris
‑
hcl，ph＝7.5)至总体积约为25ml，振摇10min后加入25ml饱和苯酚的tris
‑
hcl溶液，振摇10min，在5000g的转速下离心30min，取上清液并加入溶液等体积的蔗糖提取液，振摇5min，在5000g转速下离心25min。重复上述提取操作一次，向提出的上清液中加入40ml含0.1m醋酸铵的甲醇溶液，将溶液冷却至
‑
20℃后保存过夜。样品在5000g的转速下离心30min，用15ml冰甲醇洗涤沉淀两次，再用15ml冰丙酮洗涤沉淀两次，室温下挥干。将所得产物粉末重溶于10ml 7m尿素中，使用0.22μm针式滤器过滤上述溶液。使用3kda超滤离心管将上述溶液超滤浓缩10 倍，再稀释至原体积，重复五次，最后再稀释至2ml，得到的溶液用bca法测定其中的蛋白含量。
67.3.液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置的构建
68.液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置如图2所示。第一色谱柱13采用wax离子交换色谱柱(tskgel deae
‑
3sw，7.5*75mm，10μm)，流动相a为tris
‑
hcl溶液(20mm， ph＝6.8)，流动相b为tris
‑
hcl溶液(20mm，ph＝6.8)中加入1.5m nacl；样品进样量为1.5ml；流速0.2μl/min；柱温35℃；第一检测器14为紫外检测器，检测波长215nm；流动相梯度为： 0min,100％a；15min,100％a；20min,96％a；74min,78％a；116min,45％a；120min,100％a； 130min,100％a；
69.在第一色谱柱13的分离过程中，从30
‑
110分钟，每10分钟收集一个馏分，共收集8个馏分，分离的同时通过第一检测器14在线检测样品的分离结果。此阶段中，分流阀阵列25 中连接第二色谱柱阵列26的部分(25与26间)处于封闭状态，8个馏分分别通过第二多通阀15转移至捕集柱阵列24上进行捕集，随后用第一维流动相继续冲洗捕集柱3分钟。
70.第二色谱柱阵列26由8根反相色谱柱(welchxtimate c8，2.1*250mm，5μm)组成，经第二泵21输送的流动相经分流器23平均分成八份。此时，分流阀阵列25中连接第二色谱柱阵列26的部分打开，流动相将组分从捕集柱上洗脱下来后输送至第二色谱柱阵列26，进行后续的分离。在第二维色谱单元2中，流动相a为95％水+5％乙腈+0.1％tfa，流动相b为 95％乙腈+5％水+0.1％tfa；样品进样量为2ml；流速0.2ml/min；柱温35℃；检测器为紫外检测器，检测波长215nm；流动相梯度为：0min,100％a；5min,100％a；15min,75％a；25min, 67％a；60min,60％a；80min,46％a；85min,33％a；85.1min,0％a；95min,0％a；95.1min, 100％a；110min,100％a；
71.经反相色谱分离的馏分通过馏分收集器3收集，从0
‑
96分钟每分钟收集一个馏分，
共收集96个馏分，通过蛋白含量测定单元i
‑
2测定各个馏分中的蛋白含量，可以采用bca测定蛋白含量的方法。
72.4.lc
‑
ms/ms分析与数据分析
73.通过液相色谱分离烟草高低丰度蛋白的分离装置分离烟草样品收集馏分后，馏分分别冻干，用20μl 50mm碳酸氢铵充分复溶，95℃加热10分钟使蛋白变性，加入10μl30mm dtt， 50℃下振荡反应半小时；加入10μl55mm iaa，室温下避光反应半小时；最后再加入10μl25mm dtt，37℃反应5分钟以猝灭多余的iaa。加入50ul 20ng/μl胰蛋白酶，37℃反应15小时，酶解完成后加入1％tfa终止酶解。
74.将低丰度蛋白所在馏分合并后，后续的lc
‑
ms/ms分析通过q
‑
exactiveorbitrap质谱 (thermo fisher scientific，san jose，ca，usa)完成。分离色谱柱为acclaim pep map c18 (thermo fisher scientific，san jose，ca，usa)。流动相a3为水(加0.1％甲酸)，b3为乙腈(加0.1％甲酸)。分离柱的流速为300nl/min，用于肽段分离的流动相梯度为：0
‑
90分钟： 5
‑
30％(b3)，90
‑
100分钟：30
‑
80％，100
‑
101分钟：80
‑
5％，101
‑
106分钟：5％。质谱参数如下：full scan，质荷比扫描范围：350
‑
1600；分辨率：70000；ms/ms扫描：分辨率17500。
75.质谱结果通过proteome discover(pd version 1.4.0.288,thermo fisher scientific)进行分析，使用mascot引擎(matrix science，london,uk,version 2.6.0)与烟草数据库_up000084051 进行匹配。质谱的参数设置如下：母离子质量的扫描范围：350
‑
5000da；ms/ms谱图的最小峰数为10；最低信噪比为1.5。数据库匹配参数设置如下：最大允许漏切位点数：2个；fdr： 0.05；设置脲甲基化为固定修饰，甲硫氨酸氧化为可变修饰；酶切类型：胰蛋白酶。
76.5.结果与讨论
77.蛋白层面的top
‑
down分析中，组分复杂难以分离、单次样品分析时间长、馏分收集繁琐，阵列二维色谱体系有效地克服了这些弊端。第一色谱柱13采用了wax离子交换色谱柱对样品进行分离，在30
‑
110分钟间每10分钟收集一个馏分，将收集到的8个馏分输送至捕集柱阵列24上暂时贮存，馏分随后从捕集柱阵列24中捕集柱上洗脱下来，在8根第二色谱柱(反相色谱柱)中进行第二维分离，分离结果如图3所示，8个第二维色谱图之间彼此具有较好的区分度，说明第一维色谱的分离效果较为理想；同时通过第二维的反相色谱实现组分进行进一步分离，有利于后续的质谱分析。两维色谱的分离原理不同，分别从蛋白的电荷状态、亲/疏水性这两类不同的性质进行分离，具有良好的正交性，因此构建的二维色谱体系峰容量较高，相比传统的一维色谱而言分离效果更好。此外，由于两维色谱的单次样品分析时间都较长(1d：130分钟；2d：110分钟)，如果对第一维的馏分逐个进行后续的反相色谱分离，耗时过长且馏分收集过程繁琐。通过这套二维色谱阵列体系同时对8个馏分进行第二维色谱分离，极大提升了通量，节约了分析时间；经反相色谱分离后的馏分通过馏分收集器直接存储在96孔板中，节约了大量人力成本。
78.上述实施例仅例示性说明本实用新型的原理及其功效，而非用于限制本实用新型。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本实用新型的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本实用新型所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本实用新型的权利要求所涵盖。