免疫层析诊断试剂盒用吸收垫的制作方法

1.本发明涉及免疫层析诊断试剂盒用的吸收垫、及使用了其的免疫层析诊断试剂盒。


背景技术：

2.近些年，随着医疗形势的变化，poct(point of care testing：现场快速检验)的关注度日益增加。poct是在被检者旁边由医务人员或被检者自行进行的检测，是具有不仅能够缩短检测时间而且被检者能够直接确认检测结果这样的优点的检测。充分利用这些优点，poct不仅在在门诊、病房被实施，而且在诊所、在家医疗的现场也得到稳步地普及。通常，poct不同于在医院的中央检测室、外包检测中心使用的检测，是在诊所、在家医疗中进行的检测，因此通常由对检测本身的知识不充足且对测定不熟练的人来处理。因此，对于poct用的检测试剂，寻求只需通过接受简单的说明就谁都能够得到可靠的检测结果那样简便的操作性。
3.作为用于这种简单且迅速诊断的试剂，广泛使用了利用了免疫层析法的测定原理的检测试剂盒。作为该试剂盒构成，主要由层析介质、试样添加部(样品垫)、标记试剂保持部(结合垫)、及吸收部(吸收垫)等构成，根据需要将这些构件粘贴于基材(背衬片)，并收纳于壳体构件中。由硝酸纤维素等构成的层析介质具有作为液体试样的展开部的功能，并且还具有作为检测结果的判定部的功能。将试样添加部(样品垫)和含有标记试剂的标记试剂保持部(结合垫)以能通液的方式设置在层析介质的长度方向的一端，在相反一侧的端部设置有用于吸收过量的试样液体的吸收部(吸收垫)。
4.基于免疫层析诊断试剂盒的检测通过将所采集的各种待检体或试样液体添加至试样添加部来进行。所添加的待检体、试样液体通过标记试剂保持部，利用毛细管现象在层析介质中沿着长度方向移动，通过判定部而被吸收垫吸收。试样液体中的被检测物质利用抗原
‑
抗体反应，在通过标记试剂保持部时与金胶体等有色的标记试剂形成复合物后，被层析介质上的判定部捕捉。基于免疫层析诊断试剂盒的检测中，以源自标记试剂的着色的强度作为指标，通过目视判定在所规定的反应时间(10～15分钟)内被捕捉在层析介质的判定部的被检测物质的量。
5.基于上述免疫层析法的检测中，一直以来强烈要求迅速且准确地进行疾病的判定。例如，有几种对于诊断急性冠脉综合征有用的检测项目。在急性冠脉综合征中，急性心肌梗塞也是冠状动脉被血栓堵塞、心肌组织坏死的疾病，在发病初期的再灌注的成功与否对预后产生很大影响。因此，准确性高的诊断变得尤为重要。在此情况下，需要定量地检测诊断所需的标记物，当然，该诊断中使用的免疫层析诊断试剂盒在免疫层析诊断试剂盒制品之间的显色强度偏差必须尽可能小。假若，在使用显色强度偏差大的免疫层析诊断试剂盒时，自然会导致误诊断，在上述疾病的情况下，因误诊断而也有可能危及生命。由此，尽可能地减小免疫层析诊断试剂盒制品之间的偏差成为免疫层析诊断试剂盒开发中的主要课题之一。
6.作为偏差的原因，虽被认为是构成试剂盒的各构件的影响，但特别是由于吸收垫是担负吸液的部分，因此成为由试样的吸液速度偏差所引起的显色强度、显色时间的偏差、进而本底着色之类的不良情况所致的显色强度偏差的原因。
7.此处，“本底”是指：由于标记试剂堵塞或者非特异吸附硝酸纤维素膜的细孔而导致硝酸纤维素膜着色的现象。若本底差则硝酸纤维素膜与测试线(tl)的对比度变差，难以发现tl的显色了的线，在医疗现场难以判定。进而若本底差则难以判断阴性的tl(即，没有显色)。这些现象有可能引起误诊。
8.作为免疫层析法的检测试剂盒中使用的吸收垫，一直以来使用了由纤维素纤维、玻纤、浆粕等纤维形成的绵、无纺布、滤纸等。然而，仅由这些原料构成的吸收垫受到其结构、构成原料、制造方法的影响，吸水性并不充分，另外，存在吸收量产生偏差的问题。
9.为了解决这些问题，以下的专利文献1中，研究了使用高吸水性聚合物颗粒的吸收垫，此外以下的专利文献2中，研究了使用将二氧化硅颗粒等喷雾于纤维素纤维等无纺布原料上的吸收垫。然而现状是，这些吸收垫由于难以实现纤维密度的均匀化、喷雾量的均匀化，因此即使改善吸水性，制品之间吸水速度也容易产生偏差，因此制品之间的偏差尚未得到改善。
10.另外，也报道了由现有的吸收垫引起的试剂盒制造工序上的问题。例如，在免疫层析诊断试剂盒生产工序中，在切割玻璃纤维制吸收垫时，脱落纤维有时以粉尘的形式飞扬。若吸入这些玻璃纤维的粉尘，则可能会引起支气管的炎症，因此从制造作业人员的健康危害的观点出发，有时并不建议使用。进而，也有很多切割模块的刀破损等不良情况的报道。基于这些理由，希望尽可能避免使用玻璃纤维制吸收垫。
11.另一方面，对于纤维素制的吸收垫，由于其厚度不均匀，因此在将免疫层析图的试剂盒收纳于作为最终制品形态的壳体中时，容易发生与设计值相比过厚而无法闭合、与设计值相比过薄而在壳体内发生位移等不良情况，结果使免疫层析诊断试剂盒制品之间的偏差变大。
12.进而，近些年，在试剂盒的小型化、试剂盒制造的自动化等的趋势中，强烈要求使包含吸收垫的试剂盒本身变薄、宽度变窄。然而，现有的纤维素制的吸收垫存在由于厚度、模量的问题而无法切碎之类的问题。进而，由于玻璃纤维制的吸收垫有不均，因此在切碎后吸液量会产生偏差，因此也存在在免疫层析诊断试剂盒制品之间也产生偏差这样的问题。
13.如此，强烈要求最大限度地抑制偏差的同时能够应对小型化的吸收垫。
14.现有技术文献
15.专利文献
16.专利文献1：日本专利第6134615号公报
17.专利文献2：日本特开2012
‑
189346号公报


技术实现要素：

18.发明要解决的问题
19.鉴于前述现有技术的问题，本发明要解决的课题在于提供一种免疫层析诊断试剂盒用吸收垫，其用于显色强度的偏差少且再现性优异的免疫层析诊断试剂盒。
20.用于解决问题的方案
21.本发明人等为了解决前述课题而进行了深入研究和重复实验，结果意外地发现：通过使用对由具有特定物性的热塑性树脂的纤维构成的无纺布施加亲水加工而进行亲水化得到的物质作为吸收垫，从而能使吸液性变得均匀、免疫层析诊断试剂盒的显色强度的偏差得到大幅改善，以至完成了本发明。
22.即，本发明如下所述。
23.[1]一种免疫层析诊断试剂盒用吸收垫，其特征在于，其包含由热塑性树脂的纤维构成的无纺布，该无纺布的单位面积重量为20～200g/m2，厚度为0.06mm～1.20mm，平均纤维直径为0.7μm～5.0μm，平均孔径为2.0μm～15.0μm，并且亲水化度为50mm～180mm。
[0024]
[2]根据前述[1]所述的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫，其中，前述无纺布的质地指数为90以下，并且孔径分布满足下式：
[0025]
dmax/dave<2.00
[0026]
dmax/dmin<3.50
[0027]
式中，dmax为最大孔径(μm)，dave为平均孔径(μm)，以及dmin为最小孔径(μm)。
[0028]
[3]根据前述[1]或[2]所述的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫，其中，前述热塑性树脂由聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚丙烯及聚乙烯中的1种构成或由它们中的多种复合而成。
[0029]
[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫，其中，前述无纺布为单层的无纺布或层叠的无纺布。
[0030]
[5]一种免疫层析诊断试剂盒，其使用了前述[1]～[4]中任一项所述的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫。
[0031]
发明的效果
[0032]
使用了本发明的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫的免疫层析诊断试剂盒的显色强度的偏差少且再现性优异。
[0033]
本发明的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中，通过将由热塑性树脂的纤维构成的无纺布的单位面积重量设为20～200g/m2、将厚度设为0.06mm～1.20mm、将平均纤维直径设为0.7μm～5.0μm、将平均孔径设为2.0μm～15.0μm，从而显色强度的偏差少、再现性优异。如文字所示，吸收垫是吸收水的材料，因此可使用亲水性的原料。现有的纤维素制的吸收垫、玻璃纤维制的吸收垫是亲水性的原料，专利文献1和2中记载的吸收垫也是同样的。然而，这些吸收垫中，在免疫层析诊断试剂盒中未观察到显色强度偏差的改善效果。
[0034]
另一方面，本发明人等发现：作为免疫层析诊断试剂盒用的吸收垫，为了抑制显色强度的偏差，重要的是使用疏水性的热塑性无纺布而形成均匀的结构，进而进行亲水化处理，由此控制亲水化程度。另外，为了提高吸水速度，并非意味着简单地提高亲水性。换言之，为了改善吸水速度，必须控制亲水性和疏水性，本发明中，通过使用疏水性的热塑性无纺布来进行亲水化处理，从而能够控制本发明的吸水力，由此改善本底。进而，在免疫层析诊断试剂盒的制造工序中，与玻璃纤维相比脱嵌纤维少、切割/整形也容易，因此对于厚度、宽度等垫、试剂盒的尺寸设计具有高度的自由度，且也能够确保工序上的稳定性。
附图说明
[0035]
图1是作为本发明的一实施方式的免疫层析诊断试剂盒的剖视图。
具体实施方式
[0036]
以下，对本发明的实施方式进行详细地说明。
[0037]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫的特征在于，其包含由热塑性树脂的纤维构成的无纺布，该无纺布的单位面积重量为20～200g/m2，厚度为0.06mm～1.20mm，平均纤维直径为0.7μm～5.0μm，平均孔径为2.0μm～15.0μm，并且亲水化度为50mm～180mm。
[0038]
基于使用免疫层析诊断试剂盒所实施的免疫层析法的检测方法通常有如下两种：使包含被测定物的溶液相对于膜沿垂直方向通过的流经方式；及沿水平方向通过的侧向流动方式；但本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫可以用于这些中的任意方式。
[0039]
<无纺布>
[0040]
[无纺布结构]
[0041]
作为本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布，没有特别限制，可列举出：纺粘无纺布、熔喷无纺布、湿式无纺布、干式无纺布、干式浆粕无纺布、闪纺无纺布、开纤无纺布等。特别是，作为由极细纤维形成的无纺布，优选熔喷无纺布、闪纺无纺布。
[0042]
[单位面积重量]
[0043]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的单位面积重量为20g/m2以上且200g/m2以下。单位面积重量超过200g/m2时，在厚度过厚方面是不合适的。另外，首先从试剂盒构成上的影响、经济性的观点出发，单位面积重量完全没必要较大。因此，单位面积重量优选为190g/m2以下，更优选为180g/m2以下。另一方面，单位面积重量低于20g/m2时，无法确保作为吸收垫充足的吸液量，而且作为无纺布结构显著出现纤维的粗密不均，质地也变差，因此tl显色强度的偏差也变大。因此，单位面积重量优选为30g/m2以上，更优选为40g/m2以上。
[0044]
[厚度]
[0045]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的厚度为0.06mm以上且1.20mm以下。对于厚度的上限，若试图制造超过1.20mm厚度的无纺布，则单位面积重量、纤维直径不在规定范围内，在任意的情况下均会损害孔径分布、质地的均匀性。厚度优选为0.10mm以下，更优选为0.90mm以下。另一方面，低于0.06mm时，作为厚度过薄的吸收垫而无法得到充足的吸液量，另外，无法确保强度，因此在试剂盒的绘制工序中发生不良情况。另外，质地也变差，因此厚度优选为0.08mm以上，更优选为0.10mm以上。
[0046]
[平均纤维直径]
[0047]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的平均纤维直径为0.7μm以上且5.0μm以下。平均纤维直径超过5.0μm时平均孔径变大，另外，同时孔径分布的均匀性降低，由此tl显色强度的偏差变大。因此，平均纤维直径优选为4.0μm以下，更优选为3.0μm以下。另外，平均纤维直径越细且越均匀，则构成越致密且均匀的孔径，但即使纤维直径过细，在制造时单位面积重量也较小，另外，作为膜厚过薄的吸收垫，无法确保充足的吸液量、强度，并且对于单位面积重量，如前所述显著出现纤维的粗密不均，tl显色强度的偏差变大。因此，平均纤维直径优选0.9μm以上，更优选为1.0μm以上。
[0048]
[平均孔径]
[0049]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的平均孔径(dave)
为2.0μm以上且15.0μm以下。平均孔径超过15.0μm时，在考虑到基于毛细管现象的液体吸收时，作为吸收垫吸液速度过快，根据要展开的液体的组成而无法顺利地吸液，产生吸液偏差等，因此tl显色强度的偏差变大。因此，平均孔径优选13.5μm以下，更优选12.0μm以下。另外，平均孔径低于2.0μm时，吸液速度变慢，因而tl显色时间也变慢，因此判定时间的长时间化等缺点较大。因此，平均孔径优选2.5μm以上，更优选为3.5μm以上。
[0050]
[孔径分布]
[0051]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的孔径分布优选满足下式：
[0052]
dmax/dave<2.00
[0053]
dmax/dmin<3.50
[0054]
{式中，dmax为最大孔径(μm)，dave为平均孔径(μm)，以及dmin为最小孔径(μm)。}。
[0055]
更优选dmax/dave<2.00，进一步优选dmax/dave<1.50.。此处，dmax/dave＝1是指：理论上由构成无纺布的纤维形成的孔径完全相同的理想状态下的孔径分布。dmax/dave≥2.00中，孔径分布极不均匀，且tl显色强度的偏差变大，不适合作为吸收垫用途。
[0056]
更优选dmax/dmin<3.00，进一步优选dmax/dmin<2.50。此处，dmax/dmin＝1是指：理论上由构成无纺布的纤维形成的孔径完全相同的理想状态下的孔径分布。dmax/dmin≥3.50中，孔径分布极不均匀，且tl显色强度的偏差变大，误诊的可能性增大，因此是不适合的。
[0057]
[质地指数]
[0058]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的质地指数优选为90以下。质地指数的值越小，表示作为无纺布的结构越均匀，相反质地指数的值越大，表示无纺布的结构越不均匀。质地指数可以通过制造无纺布时的单位面积重量与厚度、织布制造后的压制加工等进行调整。关于质地指数对吸收垫性能产生的影响，质地指数的值越大，则作为无纺布结构的偏差越大，其结果，tl显色强度的偏差增大，误诊的可能性增大。此外，特别是在制作宽度窄的免疫层析诊断试剂盒的情况(例如，2.0～3.0mm宽度的试剂盒)，无纺布将被更细地切割，且无纺布结构的不均匀性、换言之粗糙的部分与致密的部分之间的差异将对性能产生更大的影响。从这些观点出发，质地指数更优选75以下，进一步优选为60以下。
[0059]
[热塑性树脂]
[0060]
形成构成本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的纤维的热塑性树脂具有疏水性，可列举出：聚烯烃系树脂、聚酯系树脂、聚酰胺系树脂。具体而言，可以示例出：乙烯、丙烯、1
‑
丁烯、1
‑
己烯、4
‑
甲基
‑1‑
戊烯、1
‑
辛烯等α
‑
烯烃的单独或作为共聚物的高压法低密度聚乙烯、线性低密度聚乙烯(lldpe)、高密度聚乙烯、聚丙烯(丙烯均聚物)、聚丙烯无规共聚物、聚1
‑
丁烯、聚4
‑
甲基
‑1‑
戊烯、乙烯/丙烯无规共聚物、乙烯
‑1‑
丁烯无规共聚物、丙烯
‑1‑
丁烯无规共聚物等聚烯烃、聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯等)、聚酰胺(尼龙
‑
6、尼龙
‑
66、聚间二甲苯己二酰胺等)、聚氯乙烯、聚酰亚胺、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、聚碳酸酯、聚苯乙烯、离聚物或它们的混合物等。从对热、水分的稳定性、通用性的方面考虑，期望为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚丙烯、聚乙烯中的任意者。另外，也可以将由各自的树脂形成的无纺布复
合。
[0061]
[亲水化处理]
[0062]
对于本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布，需要进行亲水化处理，并具有以下所述的规定范围的亲水化度。通常热塑性树脂大多数为疏水性，且即使作为无纺布形成结构，也几乎没有吸水的热塑性树脂。本实施方式中，使用由前述的疏水性的热塑性树脂的纤维构成的无纺布，通过进行亲水化处理，从而实现了能够尽可能减少吸水偏差的性能。对于亲水化的方法没有特别限定，若为物理加工方法，例如可列举出：基于电晕处理或等离子体处理的亲水化，另外，化学加工方法例如可列举出：通过氧化处理等导入磺酸基、羧酸基等表面官能团的导入；利用浸入法、喷涂法等公知的方法将聚乙烯醇(pva)、聚酯系树脂、聚苯乙烯磺酸或聚谷氨酸等水溶性高分子、和/或例如非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、或两离子性表面活性剂等表面活性剂等处理剂浸渗、涂覆于无纺布。考虑到吸收垫所需的吸水性，可以选择适合的亲水化加工方法和条件、例如处理剂的用量和官能团的导入量等。
[0063]
[亲水化度]
[0064]
亲水化度是示出免疫层析诊断试剂盒用吸收垫的吸水性能的指标，可以通过通常的吸水试验中使用的byreck法、滴加法、沉降法、基于免疫层析的吸液性试验等来进行评价。本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布的亲水化度基于依据jis
‑
l1907的byreck法的吸水高度为50mm以上且180mm以下。亲水化度低于50mm时，作为吸收垫无法确保展开/保持展开液等所需的充足的吸水性。因此，亲水化度优选为60mm以上，更优选为70mm以上。另外，亲水化度的上限没有特别限定，为180mm以下。吸水高度超过180mm时，吸水速度过快而导致灵敏度降低，或有展开、颗粒的流动反而变得不均匀的担心。因此，亲水化度优选为165mm以下，更优选为150mm以下。
[0065]
[层叠]
[0066]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫中使用的无纺布也可以根据各种用途进行层叠。层叠无纺布的情况，可以采用如下方法：热压花加工、超声波熔合等热熔合法、针刺、喷水等机械交缠法、基于热熔粘接剂、氨基甲酸酯系粘接剂等粘接剂的方法、以挤出层压等为主的各种公知的方法，没有特别限定。
[0067]
<免疫层析>
[0068]
利用使用本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫的免疫层析诊断试剂盒时的“诊断方法”是指：使用免疫层析诊断试剂盒进行的各种诊断。对于诊断对象没有特别限定，可以用于人用、动物用、食品用、植物用、其它环境检查等各种诊断对象的检查。通常的诊断步骤中，由检查对象采集检样试样，根据需要对其进行抽提、过滤等前处理，滴加到样品垫，由检查开始等待规定时间，根据有无检查对象物质而不同的显色来判断诊断结果。当然不限于这种步骤，也可以用于相同的步骤、原理的诊断。优选的是，通过将检样试样预先过滤，可以去除多余的异物、夹杂物，由此可以期待诊断的进一步迅速化、诊断精度改善。
[0069]
[免疫层析诊断试剂盒]
[0070]
本实施方式的免疫层析诊断试剂盒用于简便地检测各种待检体中的检测对象物质的有无。作为诊断试剂盒的种类，有侧向流动式、流经式。只要使用标记试剂、吸收垫就没有特别限定，优选为侧向流动式。另外，侧向流动式之中，存在浸渍(dipstick)类型和卡盒
(cassette)类型，但是对于这些类型没有特别限定。对于诊断试剂盒的结构没有特别限定，若为该领域中通常使用的结构则可以为任意一种。作为构件，只要是该领域使用的构件就没有特别限定，例如可列举出：图1所示的(a)吸收垫、(b)硝酸纤维素膜、(c)结合垫(包含抗体敏感性标记试剂)、(d)样品垫、及(e)衬纸。另外，也可以根据需要省略这些构件的一部分。
[0071]
[(a)吸收垫]
[0072]
如图1所示，(a)吸收垫是最后吸收作为免疫层析中测定对象的待检体的部分。需要说明的是，如前所述，作为现有技术中通常的吸收垫，可列举出：纤维素滤纸、纸、玻纤、玻璃纤维(glass fiber)等。
[0073]
[层析介质]
[0074]
对于免疫层析诊断试剂盒中使用的层析介质没有特别限定，可以使用通常使用的各种层析介质。具体而言，可列举出：(b)硝酸纤维素膜。
[0075]
[(c)结合垫]
[0076]
结合垫是预先将抗体敏感性标记试剂等标记颗粒干燥固定化的部分。作为通常的结合垫，可列举出：玻纤、玻璃纤维、丙烯腈系纤维、pet纤维单体或经复合的无纺布、织布等。另外，也可以根据需要进行预处理。
[0077]
[(d)样品垫]
[0078]
样品垫是最初接收作为免疫层析中测定对象的待检体的部分。作为通常的样品垫，可列举出：纤维素滤纸、纸、玻纤、玻璃纤维、丙烯腈系纤维、尼龙纤维、各种织物等。另外，也可以根据需要进行预处理。例如可以进行预先含有缓冲液、表面活性剂、蛋白质、捕捉检样试样中的夹杂物的试剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧化剂、吸湿剂等的处理。
[0079]
[标记试剂]
[0080]
被固定于结合垫上的标记试剂不溶于水、缓冲液等，是负载有色素、染料等的颗粒状物质。构成颗粒的原料没有特别限定，作为这样的标记试剂，例如可列举出：金胶体、铂胶体、银胶体、硒胶体等金属胶体颗粒、将聚苯乙烯胶乳等苯乙烯系胶乳、丙烯酸系胶乳等着色而成的着色胶乳颗粒、将由包含硅原子和氧原子的三维结构体形成的二氧化硅着色而成的着色二氧化硅颗粒、将纤维素着色而成的着色纤维素颗粒、将炭黑等着色成分直接颗粒化的标记试剂、磁性颗粒等。另外，前述标记试剂也可以是荧光发光性颗粒。
[0081]
[负载物质]
[0082]
标记试剂需要负载抗体等与被检出物特异性结合的物质，对于该负载方法没有特别限定。例如可列举出：利用物理吸附进行的负载、利用共价键进行的负载、利用它们的组合进行的负载等。对于所负载的物质的种类、量也没有特别限定。作为所负载的物质的种类，抗体是最常见且优选的。另外，作为进行负载的方法，从容易程度的观点考虑，优选为利用物理吸附进行的负载，从稳定性、性能等观点考虑，优选为利用共价键进行的负载。
[0083]
[诊断对象]
[0084]
对于可以利用本实施方式的免疫层析诊断试剂盒进行诊断的对象没有特别限定，作为具体例，可列举出以下的例子：癌标记物、激素、感染症、自身免疫、血浆蛋白、tdm、凝血/纤溶、氨基酸、肽、蛋白、基因、细胞等。更具体而言，可列举出：cea、afp、铁蛋白(ferritin)、β2微球蛋白、psa、ca19
‑
9、ca125、bfp、弹性蛋白酶1、胃蛋白酶原1
·
2、便潜血、
尿β2微球蛋白、pivka
‑
2、尿bta、胰岛素、e3、hcg、hpl、lh、hcv抗原、hbs抗原、hbs抗体、hbc抗体、hbe抗原、hbe抗体、htlv
‑
1抗体、hiv抗体、弓形虫抗体、梅毒、aso、甲型流感抗原、甲型流感抗体、乙型流感抗原、乙型流感抗体、轮状抗原、腺病毒抗原、轮状/腺病毒抗原、a群链球菌、b群链球菌、念珠菌抗原、cd菌、隐球菌抗原、霍乱弧菌、脑膜炎球菌抗原、粒细胞弹性蛋白酶、幽门螺杆菌抗体、o157抗体、o157抗原、钩端螺旋体抗体、曲霉抗原、mrsa、rf、总ige、le test(狼疮试验)、crp、igg,a,m、igd、转铁蛋白、尿白蛋白、尿转铁蛋白、肌红蛋白、c3
·
c4、saa、lp(a)、α1
‑
ac、α1
‑
m、触珠蛋白、微量转铁蛋白、apr评分、fdp、d二聚体、血纤维蛋白溶酶原、at3、α2pi、pic、pai
‑
1、蛋白c、凝血因子x3、iv型胶原、透明质酸、ghba1c、其它各种抗原、各种抗体、各种病毒、各种细菌、各种氨基酸、各种肽、各种蛋白质、各种dna、各种细胞、各种过敏原、各种农药残留、各种有害物。
[0085]
[免疫层析诊断试剂盒的制作方法]
[0086]
准备调整到了规定浓度的标记试剂的分散液，加入缓冲液、抗体，边进行温度调整边搅拌一定时间，使抗体吸附于标记试剂。搅拌一定时间后，进而加入封闭剂边进行温度调整边搅拌一定时间，由此进行着色纤维素颗粒的封闭。作为封闭剂，可以根据检查对象物质、检样或稀释其的溶液的组成等使用各种封闭剂。为了将抗体吸附/封闭后的标记试剂清洗，进行离心分离，将含有多余的抗体和封闭剂的上清液与沉降了的颗粒分离，通过倾析而去除上清液。向沉降了的颗粒中加入缓冲液等液体，根据需要利用超声波等进行分散处理。通过这种利用离心分离的沉降、上清液去除、液体的添加这一系列的操作进行的清洗进行必要次数，制造含有规定浓度的进行了抗体吸附和封闭的颗粒的分散液。向该分散液中根据需要加入蛋白质、表面活性剂、蔗糖、海藻糖等糖，将所得到的溶液以一定量涂布于玻璃纤维制的结合垫，并进行干燥，制备含有检出试剂的部分。另外在再生纤维素连续长纤维无纺布中根据需要涂布缓冲液、表面活性剂、蛋白质、捕捉检样试样中的夹杂物的试剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧化剂、吸湿剂等，并进行干燥，制造样品垫。进而制造在规定位置固定化了抗体的硝酸纤维素膜制的层析介质、用于吸收检样的纤维素滤纸制的吸收垫。将它们固定化于被称为背衬片的具有粘接部位的片，裁断为规定尺寸，由此制作免疫层析诊断试剂盒。
[0087]
实施例
[0088]
以下，通过实施例、比较例对本发明进行更具体地说明，但本发明不仅仅限定于实施例。另外，只要没有特别记载，则全部操作均在温度23℃、相对湿度55％rh的环境下进行。
[0089]
首先，对实施例等中使用的物性的测定方法进行说明。
[0090]
<厚度(mm)>
[0091]
通过依据jis
‑
l1096的厚度试验将载荷设为1.96kpa测定了无纺布的厚度。
[0092]
<单位面积重量(g/m2)>
[0093]
将0.5m2以上的面积的无纺布在105℃下干燥至一定重量后，在20℃、65％rh的恒温室静置16小时以上，测定其重量，测定无纺布的单位面积重量的重量，作为无纺布的单位面积重量。
[0094]
<平均纤维直径(μm)>
[0095]
使用装置型号：jsm
‑
6510日本电子株式会社制。将得到的无纺布切割成10cm
×
10cm，在60℃的铁板上以0.30mpa的压力上下压制90秒后，用铂蒸镀无纺布。接着使用上述sem，在加速电压15kv、工作距离21mm的条件下进行拍摄。拍摄倍率如下：平均纤维直径低于
0.5μm的线为10000倍、平均纤维直径0.5μm以上且低于1.5μm的线为6000倍、平均纤维直径1.5μm以上的线为4000倍。在各拍摄倍率下的拍摄视野是：10000倍下为12.7μm
×
9.3μm、6000倍下为21.1μm
×
15.9μm、4000倍下为31.7μm
×
23.9μm。随机拍摄纤维100根以上，测量所有的纤维直径。此时，测定时省略了沿线长方向熔合的纤维彼此。
[0096]
将根据下式求出的重均纤维直径(dw)作为平均纤维直径(μm)：
[0097]
dw＝σwi
·
di＝σ(ni
·
di2)/(ni
·
di)
[0098]
{式中，wi＝纤维直径di的重量分数＝ni
·
di/σni
·
di。}。
[0099]
<dmax、dave、dmin的测定>
[0100]
使用装置型号：automated perm porometer(多孔制材料自动细孔直径分布测定系统)porous materials,inc.制。
[0101]
用冲裁刀将无纺布样品切割成φ25mm，浸渍于galwick试液中，进行1小时脱气。然后放置样品，并施加气压。galwick试液克服了毛细管内的液体表面张力而被挤出，因此通过测定此时的压力而由从毛细管的式子导出的washburn式，求出最大孔径dmax(μm)、平均孔径dave(μm)、最小孔径dmin(μm)。
[0102]
<质地指数>
[0103]
使用装置型号：fmt
‑
miii野村商事株式会社制。
[0104]
在未放置样品的状态下、用ccd相机分别测定光源打开时/关闭时的透射光量。接着，在放置切割成a4尺寸的无纺布的状态下同样地测定透射光量，求出平均透射率、平均吸光度、标准偏差(吸光度的偏差)。质地指数可以通过标准偏差
÷
平均吸光度
×
10而求出。质地指数与目视具有极高的相关性，是无纺布的质地最直接的表示。另外，质地越好、质地指数为越小的值，质地越差、质地指数为越大的值。
[0105]
<亲水化度>
[0106]
通过依据jis
‑
l1907的byreck法测定了吸水高度。具体而言，分别采集5张大小约200mm
×
25mm的试验片。接着，用别针等将试验片固定于支撑在放入有水的水槽的水面上的水平棒上，然后使水平棒下降，进行调整使试验片的下端的20mm
±
2mm浸渍于水中，在此状态下放置10分钟。放置后，用测量器测定由于毛细管现象而水上升的高度直至1mm。将5张试验片各自的吸水高度的平均值作为亲水化度。
[0107]
<免疫层析诊断试剂盒的本底(bg着色)>
[0108]
将切割成适合的宽度的免疫层析诊断试剂盒放入塑料的壳体中。接着，制备包含1重量％bsa的66mm、ph7.4的pbs，作为阴性待检体。使用得到的装入壳体的诊断试剂盒，将100μl的阴性待检体滴加至诊断试剂盒的样品滴加部，5分钟后使用hamamatsu photonics k.k.制的免疫层析读取器c10066
‑
10，测定了tl与cl之间的1点上的显色强度(单位为mabs)。此处将显色强度为20mabs以上的情况判断为bg着色。此处设为20mabs以上的理由在于，若为20mabs以上，则能够通过目视可靠地确认着色。
[0109]
<免疫层析诊断试剂盒的测试线(tl)的显色时间>
[0110]
对于tl显色时间的测定，检测对象物质使用人绒毛膜促性腺激素(以下称为“hcg”)，用包含1重量％的牛血清白蛋白(以下称为“bsa”。)的66mm、ph7.4的磷酸缓冲液(以下称为“pbs”)稀释hcg，制备了hcg浓度为10miu/ml的阳性待检体。将该阳性待检体100μl滴加至诊断试剂盒的样品滴加部，之后每20秒利用前述同样免疫层析读取器进行测定，测定
了tl的经时变化。在此，设为每20秒的理由在于测定1次需要近20秒。接着，测定了通过免疫层析读取器得到的tl的显色强度为20mabs以上的时间。此处设为20mabs的理由在于，若为20mabs以上，则通过目视也能够确认tl的存在。共计进行30次该测定，将平均的时间(单位为秒)作为tl显色时间。
[0111]
<测试线(tl)显色强度>
[0112]
对于tl显色强度的测定，与上述同样地将阳性待检体100μl滴加至诊断试剂盒的样品滴加部，通过免疫层析读取器测定了5分钟后的测试线的显色强度(mabs)。共计进行30次该测定，将平均的显色强度(mabs)作为tl显色强度。
[0113]
另外，同时求出tl显色强度的标准偏差，表示再现性的指标％cv通过下式计算出：
[0114]
％cv＝(tl显色强度的标准偏差/tl显色强度)
×
100。
[0115]
[实施例1]
[0116]
<热塑性无纺布的制作>
[0117]
使用聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂，利用挤出机将该树脂熔融从喷嘴直径0.3mm的喷嘴以单孔喷出量0.12g/分钟挤出。在挤出上述的热塑性树脂时，对于纺丝气体设定为纺丝气体温度370℃、纺丝气体压力0.075mpa的条件，制作了聚对苯二甲酸乙二醇酯制无纺布。得到的无纺布的单位面积重量80g/m2、厚度0.22mm、平均纤维直径：1.9μm。另外，利用上述的方法测定孔径和质地指数，结果为dmax：5.64μm、dave：4.10μm、dmin：3.23μm、质地指数为49。
[0118]
<亲水加工>
[0119]
利用浸入法将如上制作的无纺布亲水化。具体而言，将阴离子性表面活性剂和水混合而成的亲水加工剂放入加工浴中，通过浸渍、轧液将制作的热塑性无纺布的原卷以规定的拉深率拉深后，利用拉幅型干燥机进行干燥/热处理。亲水加工后，利用上述的byreck法测定了亲水化度，结果为109mm。
[0120]
<抗体敏感性金胶体颗粒的制备>
[0121]
在金胶体颗粒悬浮液(田中贵金属公司制，平均粒径40nm、颗粒浓度0.006wt％、平均粒径40nm)2500μl中加入600μl的磷酸缓冲液(50mm、ph7.0)，进而加入200μl的抗hcg
‑
α小鼠抗体(fitzgerald公司制，单克隆抗体)的0.1％水溶液，通过涡旋进行搅拌。接着，在25℃下边控制温度边搅拌10分钟。在上述悬浮液中添加1％的peg水溶液300μl、10％的bsa水溶液(ph9.0、含有50mm硼酸)600μl，通过涡旋进行搅拌。然后，进行离心分离操作(10000g、30分钟)，去除了上清液。在该残渣中添加1％bsa水溶液(含有0.05％peg、150mm nacl、ph8.2、20mm tris)11000μl，通过涡旋进行搅拌。然后，进行离心分离操作(10000g、30分钟)，去除了上清液。在该残渣中添加1％bsa水溶液(含有0.05％peg、150mm nacl、ph8.2、20mm tris)900μl，进行30秒超声波处理。
[0122]
<标记试剂向结合垫中的浸渗、干燥>
[0123]
将玻璃纤维制结合垫(ahlstrom公司制，#8951)切割成高度10mm、长度300mm的形状。然后，将抗体敏感性金胶体颗粒分散液均等地涂布1020μl，在50℃下干燥60分钟。
[0124]
<样品垫的预处理>
[0125]
将样品垫((millipore公司制，c048)浸渍于含有大量过量的2.0重量％的bsa(sigma
‑
aldrich co.llc.制，a7906)和2.0重量％的tween
‑
20(注册商标)的pbs缓冲液
(66mm、ph7.4)中，去除多余的液体后在50℃下干燥60分钟。接着切割成高度18mm、长度300mm的形状。
[0126]
<捕捉抗体涂布硝酸纤维素膜的制备>
[0127]
将硝酸纤维素膜(millipore公司制、shf0900425)切割成高度25mm、长度300mm的形状。使用液体涂布装置(musashi engineering co.,ltd制、300ds)，将含有0.1重量％抗hcg
‑
β小鼠抗体(medixbiochemica公司制、6601)的pbs溶液(66mm、ph7.4)以0.1μl/mm的比率涂布于高度7mm的部分。接着将含有0.1重量％的抗小鼠
‑
兔抗体(daco公司制、z0259)的pbs溶液(66mm、ph7.4)以0.1μl/mm的比率涂布于高度12mm的部分，接着在37℃下干燥30分钟。
[0128]
<免疫层析诊断试剂盒的制备>
[0129]
将制备的捕捉抗体涂布硝酸纤维素膜、吸收垫、含有标记试剂的结合垫、样品垫粘贴于衬垫卡片(adhesives reserch公司制，ar9020)上。接着利用切裁机切割成5mm的宽度，得到宽度5mm、高度60mm的免疫层析诊断试剂盒。
[0130]
<免疫层析诊断试剂盒的性能评价>
[0131]
评价了得到的免疫层析诊断试剂盒的性能。将结果示于以下的表1。
[0132]
需要说明的是，在实施例、比较例中，在使用了免疫层析诊断试剂盒宽度为5mm并且厚度为0.2mm以上的吸收垫的性能评价中，展开液的可扩展量为大约80～120μl，因此如表1所示，实际展开100μl并进行了评价。另外，使用了将试剂盒宽度设为2.5mm的吸收垫、或使用了厚度低于0.2mm的吸收垫的情况，展开液的可扩展量为约30～80μl，因此这些也如表1所示，实际展开50μl并进行了评价。
[0133]
[实施例2]
[0134]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为90g/m2、并且平均纤维直径为2.1μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0135]
[实施例3]
[0136]
制造成热塑性无纺布的平均纤维直径为4.7μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0137]
[实施例4]
[0138]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为120g/m2，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0139]
[实施例5]
[0140]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为185g/m2，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0141]
[实施例6]
[0142]
调整对热塑性无纺布进行亲水化处理时的亲水化剂的浓度，制造成亲水化度为171mm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0143]
[实施例7]
[0144]
将热塑性无纺布与实施例6同样地制造成亲水化度为72mm，除此以外利用与实施例1同样的方法制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0145]
[实施例8]
[0146]
调整热塑性无纺布的单位面积重量和厚度，制造成质地指数为95，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0147]
[实施例9]
[0148]
使用聚丙烯而制造热塑性无纺布，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0149]
[实施例10]
[0150]
使用了层叠实施例2中使用的亲水化的热塑性无纺布而成者，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0151]
[实施例11]
[0152]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为45g/m2、厚度为0.14mm、平均纤维直径为1.6μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，将各待检体滴加量设为50μl，评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0153]
[实施例12]
[0154]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为40g/m2、厚度为0.10mm、平均纤维直径为1.0μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0155]
[实施例13]
[0156]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为20g/m2、厚度为0.06mm、平均纤维直径为0.9μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0157]
[实施例14]
[0158]
与实施例2同样地制备免疫层析诊断试剂盒，对于将其切割成2.5mm宽度的吸收垫，与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。
[0159]
〔实施例1～14的说明〕
[0160]
实施例1～14中，均将具有权利要求1中规定的规定范围的物性的热塑性树脂亲水化而成者用于吸收垫，由此如以下的表1所示，可以得到在5分钟后绝对没有bg着色(低于20mabs)、tl显色强度的偏差小且制品之间偏差小的免疫层析诊断试剂盒。
[0161]
[比较例1]
[0162]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为220g/m2、厚度为0.55mm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，由于成为非常堵塞的无纺布，无法充分地吸水，因此5分钟后bg也会着色，并且tl显色强度的％cv上升。
[0163]
[比较例2]
[0164]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为80g/m2、厚度为1.30mm，除此以外利用与实施例1同样的方法制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，由于厚度相对于单位面积重量过厚，因此成为相对粗糙的结构，因此质地指数变差，tl显色强度的％cv大幅上升。
[0165]
[比较例3]
[0166]
制造成热塑性无纺布的平均纤维直径为5.5μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，与比较例2同样地纤维直径过粗而质地指数变差，且tl显色强度的％cv大幅上升。
[0167]
[比较例4]
[0168]
制造成热塑性无纺布的亲水化度为48mm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。由表1所示的结果可明确地那样，与比较例1同样地5分钟后的bg有着色，tl显色时间也大幅变慢。另外，tl显色强度的％cv大幅上升。
[0169]
[比较例5]
[0170]
使用较厚的纤维素制吸收垫，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，5分钟后的bg有着色，tl显色强度的％cv也大幅上升。
[0171]
[比较例6]
[0172]
使用较厚的纤维素制吸收垫，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，5分钟后的bg有着色，tl显色强度的％cv也大幅上升。
[0173]
[比较例7]
[0174]
使用玻璃纤维制吸收垫，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，与比较例1同样地5分钟后的bg有着色，tl显色强度的％cv也大幅上升。另外，在制作免疫层析诊断试剂盒时，尤其在切割加工时产生了明显可见量的粉尘。
[0175]
[比较例8]
[0176]
制造成热塑性无纺布的单位面积重量为15g/m2、厚度为0.05mm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，相对于所展开的液量，吸收垫的吸液量不足而未展开。
[0177]
[比较例9]
[0178]
制造成热塑性无纺布的平均纤维直径为0.6μm，除此以外与实施例1同样地制备免疫层析诊断试剂盒，与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，与比较例8同样地吸液量不足而未展开。
[0179]
[比较例10]
[0180]
使用较厚的纤维素制吸收垫，将试剂盒宽度设为2.5mm宽度而制备免疫层析诊断试剂盒，与实施例11同样地评价了其性能，但由于厚度过厚而无法切割成2.5mm那样的宽窄，未能制作试剂盒，因此也未能进行性能评价。
[0181]
[比较例11]
[0182]
使用较厚的纤维素制吸收垫，将试剂盒宽度设为2.5mm宽度而制备免疫层析诊断试剂盒，与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，5分钟后的bg有着色，tl显色强度的％cv大幅上升。
[0183]
[比较例12]
[0184]
使用玻璃纤维制吸收垫，将试剂盒宽度设为2.5mm宽而制备免疫层析诊断试剂盒，
与实施例11同样地评价了其性能。将结果示于以下的表1。由表1所示的结果可明确地那样，与比较例1同样地5分钟后的bg有着色，tl显色强度的％cv大幅上升，与5mm宽度时的％cv(比较例7)相比进一步恶化。另外，在制作免疫层析诊断试剂盒时，尤其在切割加工时产生了明显可见量的粉尘。
[0185]
[表1]
[0186][0187]
产业上的可利用性
[0188]
使用了本发明的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫的免疫层析诊断试剂盒的显色强度的偏差少且再现性优异。本发明中，通过使用疏水性的热塑性无纺布来进行亲水化处理，
从而能够控制本发明的吸水力，从而改善本底，进而，在免疫层析诊断试剂盒的制造工序中，与玻璃纤维相比脱嵌纤维也少、切割/整形也容易，因此对于厚度、宽度等垫、试剂盒的尺寸设计具有高度的自由度，且也能够确保工序上的稳定性。因此，本发明的免疫层析诊断试剂盒用吸收垫能够适宜地用作各种免疫层析诊断试剂盒的吸收垫。
[0189]
附图标记说明
[0190]
(a)吸收垫
[0191]
(b)硝酸纤维素膜
[0192]
(c)结合垫(包含抗体敏感性标记试剂)
[0193]
(d)样品垫
[0194]
(e)衬纸