用于癌症免疫疗法的精准医学方法与流程

用于癌症免疫疗法的精准医学方法


背景技术：

1.在过去的五年内，癌症免疫疗法治疗在多种癌症类型中取得了巨大的临床成功，通常无病生存期延长到10年以上。成功的免疫疗法的示例是免疫检查点抑制剂，它们在许多难以治疗的癌症中表现出前所未有的持久反应率。然而，无论受影响的器官和癌症类型如何，只有有限百分比的患者(～20％)从这些方法中受益。因此，越来越需要确定生物标志物，以改进会对疗法有反应的患者的选择。
2.在治疗前和治疗期间都需要生物标志物，以便能够识别可能对免疫疗法治疗有反应的患者，以减少不当的药物使用。客观临床反应被定义为治疗过程中肿瘤尺寸的减小。与疾病预后相关的多种基线因素都与反应率有关。例如，肿瘤尺寸小或血清乳酸脱氢酶(ldh)基线水平低的患者更有可能对抗pd-1治疗产生反应。可能由死亡的肿瘤细胞释放并在一些患者的血清中检测到的循环肿瘤dna(ctdna)与肿瘤的进展密切相关。
3.对抗pd-1治疗的反应可以部分地通过肿瘤微环境中的配体pd-l1的表达来预测。尽管pd-l1的表达与黑色素瘤患者的治疗效果相关，但在患有如鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和默克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)等其他癌症的患者中则不然。
4.肿瘤细胞上新抗原的存在促进了对肿瘤的免疫原性并且提高了治疗效果。因此，肿瘤细胞和宿主细胞之间的高基因变异是检查点抑制剂治疗效果的一个指标。这对于黑色素瘤患者的抗ctla-4治疗和具有高突变率的结直肠癌或非小细胞肺癌患者的抗pd-1治疗尤其如此。
5.其他与免疫疗法治疗前的治疗反应改善相关的免疫学因素包括嗜酸性粒细胞和淋巴细胞计数升高；大量cd8
+
t细胞浸润肿瘤，以及用抗pd-1治疗的黑色素瘤患者血清中tgf-β水平升高。
6.许多治疗后的免疫生物标志物也被认为与对癌症免疫疗法的反应改善相关。例如，更有可能对抗ctla-4治疗产生反应的患者的诱导型共刺激分子(icos)(+)t细胞的数量增加，中性粒细胞/淋巴细胞的比率降低。
7.本文描述了一种治疗癌症的方法，其利用基于受试者的慢性炎症的细胞内或细胞外水平(iage、细胞因子反应评分crs和/或jak-stat反应)的患者分层，然后设计旨在改善对癌症免疫疗法的临床和免疫学反应的个体化疗法。


技术实现要素：

8.本发明描述了一种用免疫疗法治疗癌症患者的方法，其中受试者可基于其炎症年龄水平进行分层；并且可得到个体化干预以降低炎症年龄并改善对癌症免疫疗法治疗的临床和免疫反应。
9.炎症年龄评分系统(iage)可用于将癌症患者分类为会对免疫疗法产生客观临床反应的患者和不会产生客观临床反应的患者。炎症年龄评分系统可用于指导针对炎症的初始疗法，以使那些被分类为无反应者的患者获得最佳的客观反应。细胞因子反应评分(crs)可用于将癌症患者分类为会对免疫疗法产生客观临床反应的患者和不会产生客观临床反
应的患者。
10.基于受试者的iage、crs和/或jak-stat反应，受试者可被分类为对免疫疗法的反应者或无反应者。被分类为无反应者的患者可以通过治疗以降低其iage，增加其crs和/或增加其jak-stat反应，从而使受试者进入反应者类别。通过将受试者的iage、crs和/或jak-stat反应与那些实足年龄相仿的患者进行比较来进行分类。当受试者的iage、crs和/或jak-stat反应使他们在其年龄组中处于较年轻的iage或更具反应性的crs和/或jak-stat评分时，受试者可以是免疫疗法的反应者。年龄组中iage较大和/或crs和/或jak-stat评分较低的受试者可以通过治疗以降低其iage和/或增加其crs和/或jak-stat评分，从而使他们进入免疫疗法的反应者组。
附图说明
11.图1a、1b和1c示出了iage、初始cd8(+)t细胞和jak stat信号传导反应的图。
12.图2示出了通过iage和crs将癌症患者分层为反应者和无反应者。
13.图3示出了使用iage对癌症患者进行的分层。
具体实施方式
14.在描述各个实施例之前，应当理解，本发明的教导不限于所描述的特定实施例，因此当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是旨在限制，因为本教导的范围将仅由所附权利要求限定。
15.除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料也可用于本教导的实施或测试，但现在描述一些示例性方法和材料。
16.应当指出，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指代物。还应指出，权利要求书可以被撰写为排除任何可选的要素。因此，本陈述旨在作为使用如“仅(solely)”、“仅(only)”等与权利要求要素的叙述有关的排他性术语或使用“否定”限制的前题基础。除非上下文另外明确规定，否则关于物质的浓度或水平给出的数值限制是近似的。因此，当浓度表示为(例如)10μg时，意在将所述浓度理解为至少大约或约10μg。
17.如本领域技术人员在阅读本发明后将显而易见，本文描述和示出的每个单独的实施例都具有分立的组件/成分和特征，这些组件/成分和特征可以容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合，而不偏离本教导的范围或精神。任何叙述的方法都可以按照叙述的事件顺序或逻辑上可行的任何其他顺序进行。定义
18.关于本发明，除非另外具体定义，否则本文描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。因此，以下术语旨在具有以下含义。
19.如本文所用，“激活(activation)”被定义为暴露于物质、过敏原、药物、蛋白质、化学品或其他刺激时的生理状况，或去除物质、过敏原、药物、蛋白质、化学品或其他刺激时的生理状况。
20.如本文所用，“抗体”被定义为一种蛋白质，其在功能上定义为配体结合蛋白且在
结构上定义为包含被技术人员识别为来源于免疫球蛋白的可变区的氨基酸序列。抗体可以由基本上由免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因片段、杂交免疫球蛋白基因(通过组合来自不同动物的遗传信息制成)或合成免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成。公认的原生免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因和多个d区段和j区段。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其转而分别定义了免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。抗体以完整的免疫球蛋白、通过用各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段或通过重组dna技术制成的各种片段形式存在。抗体可以来源于许多不同的物种(例如兔子、绵羊、骆驼、人类或啮齿动物，如小鼠或大鼠)，或者可以是合成的。抗体可以是嵌合的、人源化的或人源工程化的。抗体可以是单克隆或多克隆、多链或单链、片段或完整免疫球蛋白。
21.如本文所用，“抗体片段”被定义为完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且指抗原结合域，例如完整抗体的抗原决定可变区，足以赋予抗体片段对目标如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的示例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、scfv抗体片段、线性抗体、单域抗体如sdab(v
l
或vh)、骆驼科vhh域以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scfv”被定义为包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scfv保留其来源的完整抗体的特异性。除非说明，否则如本文所用，scfv可以具有按任一顺序的v
l
和vh可变区，例如，相对于多肽的n端和c端，scfv可以包含v
l-接头-vh或可以包含v
h-接头-v
l
。
22.如本文所用，“抗原”被定义为引发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫能力细胞的激活，或两者兼而有之。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括但不限于几乎所有的蛋白质或肽，包括糖基化多肽、磷酸化多肽和其他翻译后修饰的多肽，包括用脂质修饰的多肽，都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组dna。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用一个以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫反应的多肽。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以是合成的或可以来源于生物样本，或者可以是除多肽之外的大分子。所述生物样本可以包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或具有其他生物成分的体液。
23.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”和术语“car”可互换使用。如本文所用，“car”被定义为包含抗原识别部分和细胞激活元件的融合蛋白。
24.如本文所用，“car t细胞”或“car t淋巴细胞”可互换使用，并且被定义为含有产生car多肽能力的t细胞，无论实际表达水平如何。例如，能够表达car的细胞是含有在细胞中表达car的核酸序列的t细胞。
25.如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”可互换使用，并定义为如本文所述的化合物、配方/制剂、材料或组合物有效实现特定生物学结果的量。
26.如本文所用，“表位”被定义为能够引发免疫反应的抗原的部分，或与抗体结合的抗原的部分。表位可以是被抗体识别的蛋白质序列或子序列。
27.如本文所用，“表达载体”和“表达构建体”可互换使用，并且均被定义为设计用于细胞中蛋白质表达的质粒、病毒或其他核酸。载体或构建体用于将基因引入宿主细胞，由此载体将与细胞中的聚合酶相互作用以表达载体/构建体中编码的蛋白质。表达载体和/或表达构建体可以染色体外的方式存在于细胞中或整合到染色体中。当整合到染色体中时，包含表达载体或表达构建体的核酸将是表达载体或表达构建体。
28.如本文所用，“异源”被定义为指核酸和/或多肽与宿主细胞不同源。例如，如果构建体含有一些以宿主细胞中未发现的方式排列的同源序列和/或构建体含有宿主细胞中未发现的一些异源序列，则所述构建体对于宿主细胞是异源的。
29.如本文所用，术语“免疫功能受损”被定义为与完全健康的个体相比，个体中免疫功能的任何降低。免疫功能受损的个体很容易通过cd8+cd28-细胞丰度的大幅增加或更广泛地通过细胞因子反应减少、基线磷蛋白水平增加和其他共存量度来识别。
30.如本文所用，术语“炎性小体”被定义为细胞溶质多蛋白复合物，由炎性小体启动传感器、含有card(胱天蛋白酶激活和募集域)的凋亡相关斑点样蛋白充当衔接蛋白和蛋白酶-胱天蛋白酶-1组成。炎性小体启动传感器包括nlr、含pyrin和hin域(也称为pyhin、aim 2样受体或alr；例如aim2)或trim(例如pyrin)家族的成员。复合物的组装导致胱天蛋白酶-1依赖性地将细胞因子前白细胞介素1β(pro-il-1β)和pro-il-18裂解为分泌的成熟形式。此外，炎性小体启动细胞焦亡。
31.如本文所用，“单链抗体”(scfv)被定义为具有抗原结合活性功能的免疫球蛋白分子。scfv(单链可变片段)形式的抗体由重链(vh)和轻链(v
l
)的可变区组成，它们通过柔性肽接头连接在一起。免疫学年龄
32.jak/stat信号传导通路对于应对免疫系统遇到的多种攻击至关重要，从对抗感染到维持免疫耐受。显然，stat也参与了人类免疫系统的发育和功能，并在维持对癌症的免疫监测中发挥了关键作用(nature.2007；450(7171):903-7；nat rev cancer(2009)9:798-809)。
33.jak-stat通路会随着年龄的增长而发生极大的改变，这是导致老年人免疫功能障碍的一个主要原因。细胞因子反应评分(crs)可用于预测免疫力下降和对癌症的免疫监测减少。
34.炎症年龄评分系统(iage)也可用于预测与年龄相关的共病和死亡率。iage作为心血管健康的生物标志物可能非常敏感，因为即使在没有临床或实验室心血管风险因素的非常健康的老年受试者中，其水平升高也可预测左心室重塑和动脉硬化。iage还可以识别亚临床免疫缺陷的年轻患者(占16-35岁受试者的10％)，他们在研究的任何一年(长达6年的随访)都不能对任何流感疫苗株产生反应。这些受试者的特征是在其免疫细胞组成、对多种急性刺激的离体反应以及与高龄相关的基因模块的表达方面具有类似老年人的免疫学表型。
35.由于细胞因子反应评分crs和iage是对炎症、t细胞中jak-stat信号传导通路的减弱和低初始cd8(+)t细胞计数的独立量度(图1a-c)，这些量度可用于根据对免疫疗法的临床反应来对癌症患者进行分层。本文描述的方法使用血液炎症标志物crs和iage将癌症患者分层为免疫疗法的反应者组和无反应者组。可以对无反应者进行治疗，以降低其iage和/
或增加其crs(和/或jak-stat评分)，从而使无反应者获得使其进入反应者组的iage和/或crs(和/或jak-stat评分)。
36.所述程序涉及在输注免疫疗法治疗之前，通过静脉穿刺或任何适当的方法从候选癌症患者身上提取外周血液样本(图2)。免疫疗法治疗可包括使用某些分子，包括针对抑制性免疫受体的抗体、小分子等。通过对凝结的血液进行离心分离，或通过任何其他适当的方法将血清与血细胞分离(图2)。
37.iage的构建：对于血清蛋白测定，可将所得血清与抗体连接的磁珠在96孔过滤底板上混合，可在室温下培育2小时，然后在4℃下培育过夜。室温培育步骤可以在定轨振荡器上以500-600rpm进行。板可被真空过滤并用洗涤缓冲液洗涤两次，然后与生物素化的检测抗体在室温下培育2小时。然后可以将样本如上所述过滤和洗涤两次，并重新悬浮在链霉亲和素-pe中。在室温下培育40分钟后，可以再进行两次真空洗涤，并且可以将样本重新悬浮在阅读缓冲液(reading buffer)中。每个样本可以一式两份或一式三份地测量。可以使用luminex 200仪器读取(各)板，每个样本每个细胞因子的下限为100个珠子，并记录平均荧光强度(mfi)。
38.为了推导出炎症年龄(iage)(图2)，可以将平均荧光强度归一化并用于多元回归分析，使用以下回归系数计算：mig：0.6357，trail：-0.3760，ifng：-0.3235，eotaxin：0.2912，groa：-0.2723，il2：-0.2063，tgfa：-0.1978，pai1：-0.1587，lif：-0.1587，leptin：0.1549、mip1a：0.1547，il1b：0.1471。mfi可以乘以蛋白质的回归系数，并且这些数值可以全部加在一起，得出受试者的iage。下表1列出了实足年龄十年段内的iage范围。表1.iage范围实足年龄(岁)iage范围10-1918.1-58.320-2918.5-78.930-3916.9-70.240-4921.5-74.150-5923.1-74.460-6928.1-76.670-7935.6-77.680-9637.9-78.5
39.那些回归系数为正的标志物的血清浓度随年龄增长而增加(mig、eotaxin、leptin、mip1a和il1b)，那些回归系数为负的标志物的血清浓度随年龄增长而下降(trail、ifng、groa、il2、tgfa、pai1和lif)。
40.mig(γ干扰素诱导的单核因子)是一种属于cxc趋化因子家族的小细胞因子。mig是趋化因子之一，起着诱导趋化性，促进白细胞的分化和增殖，并引起组织外渗的作用。mig调节免疫细胞的迁移、分化和激活。肿瘤浸润淋巴细胞是临床结果和预测对检查点抑制剂反应的关键。体内研究表明，轴线通过增加肿瘤的增殖和转移发挥致瘤作用。mig主要介导淋巴细胞向病灶部位浸润并抑制肿瘤生长。
41.trail(tnf相关凋亡诱导配体)是一种由大多数正常组织细胞产生和分泌的细胞因子。它被认为主要通过与某些死亡受体结合而引起肿瘤细胞的凋亡。trail也被命名为
cd253(分化簇253)和tnfsf1o(肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10)。trail披露于wiley等人immunity 1005 3:673-82以及pitti j.biol.chem.1996 271:12687-90中。
42.infg(又称为干扰素γ、ifny或ii型干扰素)是一种二聚化可溶性细胞因子，是ii型干扰素类的唯一成员。ifng对于针对病毒、一些细菌和原生动物感染的先天性和适应性免疫至关重要。infg是巨噬细胞的重要激活因子和ii类主要组织相容性复合体(mhc)分子表达的诱导因子。infg披露于schoenborn等人adv.immunol.2007 96:4i-ioi以及gray nature.1982 298:859-63中。
43.eotaxin(也称为c-c基序趋化因子i i或嗜酸性粒细胞趋化蛋白)是一种属于cc趋化因子家族的小细胞因子。eotaxin通过诱导嗜酸性粒细胞的趋化性而选择性地募集它们，因此与过敏反应有关。eotaxin的作用是由其与g蛋白连接受体结合而介导的，所述受体被称为趋化因子受体。cclii是配体的趋化因子受体包括ccr2、ccr3和ccr5。eotaxin披露于kitaura等人the journal of biological chemistry i 996 271:7725-30和jose等人the journal of experimental medicine 1994i 79:881-7中。
44.groa(也称为cxcli、groi致癌基因、groa、kc、中性粒细胞激活蛋白3(nap-3)和黑色素瘤生长刺激活性α(msga-a))由人类黑色素瘤细胞分泌，具有促有丝分裂特性并且与黑色素瘤发病机制有关。groa由巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞表达，并且具有中性粒细胞趋化活性。这种趋化因子通过趋化因子受体cxcr2的信号传导来引发其效应。groa披露于haskill等人proc.natl.acad.sci.u.s.a.190 87(i9):7732-6中。
45.il-2是对免疫系统具有多效作用的关键细胞因子之一。它是一种15.5-16kda的蛋白质，可调节负责免疫的白血细胞(白血球，通常是淋巴细胞)的活性。il-2的主要来源是激活的cd4+t细胞、激活的cd8+t细胞、nk细胞、树突状细胞和巨噬细胞。il-2是维持cd4+调节性t细胞的重要因子，并在cd4+t细胞分化为各种亚群中起着关键作用。它可以促进cd8+t细胞和nk细胞的细胞毒性活性，并响应于抗原调节t细胞分化程序，促进初始cd4+t细胞分化为t辅助细胞1(th1)和t辅助细胞2(th2)，同时抑制t辅助细胞17(th17)的分化。
46.tgfa(转化生长因子α)是一种5.7kda的多肽，与egf部分同源。tgfa是一种生长因子，是表皮生长因子受体的配体，可激活细胞增殖、分化和发育的信号传导通路。tgfa也是细胞迁移的有力刺激因子。tgfa可在巨噬细胞、脑细胞和角质细胞中产生。tgfa可以诱导上皮发育。tgfa还可以上调tlr的表达和功能，增强上皮表面的宿主细胞防御机制。tgfa可以充当跨膜结合配体或可溶性配体。tgfa与许多类型的癌症有关，并且它也可能与某些唇/腭裂病例有关。已发现此基因的编码不同同种型的选择性剪接转录变体。
47.pai1(纤溶酶原激活物抑制剂-1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的成员。pai1是组织纤溶酶原激活剂(tpa)和尿激酶(upa)的主要抑制剂，因此是纤维蛋白溶解的抑制剂。pai1也是细胞迁移的调节剂。pai1可以在许多与年龄有关的病况中发挥作用，包括例如炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抗性、肥胖、合并症和维尔纳综合征(werner syndrome)。pai1在感染的急性期可以通过调节干扰素γ的释放发挥宿主保护作用。ifng调节pai-1的表达，这表明pai-1与ifng之间存在复杂的相互作用。pai1还可以通过toll样受体4(tlr4)激活巨噬细胞，并可以促进促癌m2巨噬细胞迁移到肿瘤中。
48.lif(白血病抑制因子)是白细胞介素6类细胞因子，具有影响若干不同系统的多效作用。lif参与诱导正常和骨髓性白血病细胞的造血分化，诱导神经元细胞分化，调节肾脏
发育过程中间充质向上皮的转化，并且还可能在母胎界面的免疫耐受中发挥作用。lif可以在细胞基因组内引入和/或维持表观遗传可塑性，即lif允许表观遗传灵活性。这种灵活性在干细胞中是最大的，其中lif与nanog协同作用，在胚胎干细胞中编排多能性和自我更新。lif还在t细胞发育为treg与th17细胞中发挥作用。干细胞(包括间充质干细胞)由lif维持在多能状态，并在lif而非il-6促进干细胞扩增的情况下具有免疫特权。已观察到此基因的编码多种同种型的选择性剪接转录变体。
49.leptin由白色脂肪细胞分泌到循环中，在能量稳态调节中发挥重要作用。leptin与大脑中的瘦素受体结合，激活下游信号传导通路，抑制进食并促进能量消耗。leptin还具有若干内分泌功能，并参与调节免疫和炎症反应、造血、血管生成、生殖、骨形成和伤口愈合。leptin可以直接将营养状况和促炎性t辅助细胞1免疫反应联系起来，在食物匮乏期间，leptin血浆浓度的降低可导致免疫功能受损。leptin与慢性炎症的发病机制有关，肥胖症中循环leptin水平的升高似乎有助于低度炎症，这使肥胖个体更容易增加患心血管疾病、ii型糖尿病和包括自身免疫和癌症的退化性疾病的风险。leptin水平降低，如在营养不良个体中发现的，与感染风险增加和细胞介导的免疫反应降低有关。此基因及其调控区的突变导致人类患者出现严重肥胖和病态肥胖并伴有性腺功能减退。此基因的突变也与2型糖尿病的发展有关。
50.mip1a(巨噬细胞炎症蛋白)是cc或β趋化因子亚家族的成员。mip1a调节白细胞的激活和运输。mip1a充当多种细胞的趋化因子，包括单核细胞、t细胞、b细胞和嗜酸性粒细胞。mip1a通过与受体ccr1、ccr4和ccr5结合在炎症反应中发挥作用。
51.il-1b(白细胞介素-1β)是白细胞介素1细胞因子家族的成员。il-1b是炎症反应的重要介质，并参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。li-1b由激活的巨噬细胞作为前蛋白产生，所述前蛋白被胱天蛋白酶1(casp1/ice)蛋白水解加工成其活性形式。
52.crs的构建：免疫细胞的分离可以包含通过密度梯度对血液进行差速离心的使用(图2)。所得细胞离心块可以悬浮在温热的培养基中，洗涤两次，并以0.5
×
106个活细胞/毫升重新悬浮。在96孔深孔板中，每孔可以接种200μl的细胞样本。在37℃下静置1小时后，可以通过添加50μl细胞因子(ifna、ifng、il-6、il-7、il-10、il-2或il-21)刺激细胞(图2)，并在37℃下培育15分钟。细胞可以用多聚甲醛固定，用甲醇透化，并在-80℃下保持过夜。然后可以使用pacific orange和alexa-750染料(invitrogen,carlsbad,ca)的组合对每个孔进行条形码编码，并汇集到试管中。细胞可以用facs缓冲液(补充有2％fbs和0.1％叠氮化钠的pbs)洗涤，并用以下抗体(均来自bd biosciences,san jose,ca)进行染色：cd3 pacific blue、cd4 percp-cy5.5、cd20 percp-cy5.5、cd33 pe-cy7、cd45ra qdot 605、pstat-1 alexafluor488、pstat-3 alexafluor647、pstat-5 pe。可以洗涤样本并重新悬浮在facs缓冲液中。使用diva 6.0软件在lsrii流式细胞仪(bd biosciences)上收集每一刺激条件100,000个细胞。数据分析可使用flowjo v9.3进行，基于前向与侧向散射谱对活细胞进行门控，然后使用前向散射面积与高度对单细胞群进行门控，接着进行细胞亚群特定门控。
53.由于刺激引起的倍数变化差异可以计算为细胞、细胞因子刺激、磷蛋白测量值与同一板上测量的原始、未归一化、细胞-磷蛋白匹配基线的比率。数据可以通过将个体的数据按其测量当天测定的平均数进行缩放来归一化。
54.为了构建细胞因子反应评分(crs)(图2)，15个可再现的年龄相关的归一化细胞因
子反应可表示为超过基线(未刺激)的倍数增加，并且可以对以下的倍数增加进行求和：cd8+细胞，用ifna刺激并测量pstat1、3和5；cd8+细胞，用il6刺激并测量pstat1、3和5；cd8+细胞，用ifng刺激并测量pstat1；cd8+细胞，用il21刺激并测量pstat1；cd4+细胞，用ifna刺激并测量pstat5；cd4+细胞，用il6刺激并测量pstat5；cd20+细胞，用ifna刺激并测量pstat1；单核细胞用il10刺激并测量pstat3；单核细胞用ifng刺激并测量pstat3；单核细胞用ifna刺激并测量pstat3；以及单核细胞用il6刺激并测量pstat3。
55.ifna(干扰素α)是i型干扰素类的成员。并且在人类中有十三(13)个变体。ifna由造血细胞分泌，主要是浆细胞样树突状细胞。ifna可以具有保护作用或有害作用。ifna可由来自病毒或细菌的ssrna、dsrna和胞质dna诱导。ifna可诱导胱天蛋白酶-11的表达，这有助于激活非典型炎性小体。使用重组ifna已被证明可有效减少普通感冒的症状和持续时间。
56.infg(干扰素γ)是ii型干扰素类的成员。编码的蛋白由先天性和适应性免疫系统的细胞分泌。活性蛋白是一种同型二聚体，与干扰素γ受体结合，触发对病毒和微生物感染的细胞反应。此基因的突变与对病毒、细菌和寄生虫感染以及几种自身免疫性疾病的易感性增加有关。
57.il6是一种对炎症、免疫反应和造血具有多效作用的细胞因子。il6响应于感染和组织损伤而迅速且短暂地产生，通过刺激急性期反应、造血和免疫反应促成宿主防御。il6在炎症和b细胞成熟中起作用。此外，il6已被证明是一种内源性热原，能够在患有自身免疫性疾病或感染的人中诱发发烧。il6主要在急性和慢性炎症部位产生，它被分泌到血清中，并通过白细胞介素6受体α诱发转录炎症反应。il6与多种炎症相关的疾病状态有关，包括对糖尿病和全身性幼年类风湿性关节炎的易感性。il-6的失调、持续合成对慢性炎症和自身免疫具有病理作用。选择性剪接产生多个转录变体。
58.il10是一种在免疫调节和炎症中具有多效作用的细胞因子。il-10是一种抗炎细胞因子，在感染期间，它抑制th1细胞、nk细胞和巨噬细胞的活性，所有这些细胞对于最佳病原体清除是所需的，但也会造成组织损伤。il10可以通过限制淋巴结中t细胞的激活和分化以及抑制组织中的促炎性反应来直接调节先天性和适应性th1和th2反应。它还增强b细胞的存活、增殖和抗体产生。这种细胞因子可以阻断nf-κb的活性，并参与调节jak-stat信号传导通路。在小鼠中进行的基因敲除研究表明，这种细胞因子的功能是肠道中必不可少的免疫调节剂。
59.il21是具有免疫调节活性的细胞因子的共同γ链家族的成员。il21通过诱导多种目标细胞(包括巨噬细胞、自然杀伤细胞、b细胞、细胞毒性t细胞和上皮细胞)的分化、增殖和活性，在先天性和适应性免疫反应中发挥作用。il21对抗肿瘤和抗病毒反应很重要，并且对促进自身免疫性疾病和炎症性疾病发展的炎症反应也有重要影响。
60.pstat1(磷酸化信号转导和转录激活因子1)介导细胞对干扰素(ifn)、细胞因子kitlg/scf和其他细胞因子和其他生长因子的反应。在i型ifn(ifn-α和ifn-β)与细胞表面受体结合后，通过蛋白激酶的信号传导导致jak激酶(tyk2和jak1)的激活以及stat1和stat2的酪氨酸磷酸化。磷酸化的stat二聚化并与isgf3g/irf-9缔合，形成称为isgf3转录因子的复合物，进入细胞核(pubmed:28753426)。isgf3与ifn刺激反应元件(isre)结合以激活ifn刺激基因(isg)的转录，驱动细胞处于抗病毒状态。响应于ii型ifn(ifn-γ)，stat1被酪氨酸和丝氨酸磷酸化(pubmed:26479788)。然后它形成一种称为ifn-γ激活因子(gaf)的
同型二聚体，迁移到细胞核中并与ifnγ激活序列(gas)结合，以驱动目标基因的表达，诱导细胞抗病毒状态。
61.pstat 3(磷酸化信号转导和转录激活因子3)介导细胞对白细胞介素、kitlg/scf、lep和其他生长因子的反应。一旦被激活，就会将共激活因子如ncoa1或med1募集到目标基因的启动子区域。与各种急性期蛋白基因启动子中确定的白细胞介素-6(il-6)反应性元件结合。由il31通过il3 ira激活。通过调节初始cd4+t细胞分化为t辅助细胞th17或调节性t细胞(treg)，作为炎症反应的调节剂：loxl3对赖氨酸残基进行脱乙酰化和氧化，破坏stat3二聚化并抑制其转录活性。
62.pstat 5(磷酸化信号转导和转录激活因子5)由细胞因子受体下游的janus激活激酶(jak)激活。stat5蛋白被多种造血和非造血细胞因子和生长因子激活，所有这些因子都使用jak-stat信号传导通路作为其信号转导的主要模式。stat5蛋白关键性地调节重要的细胞功能，如增殖、分化和存活。stat5在维持正常的免疫功能和稳态方面发挥重要作用，这两者都由il-2细胞因子家族的特定成员调节，这些细胞因子的受体复合物有共同的γ链(γ(c))。stat5关键性地介导免疫系统中γ(c)细胞因子家族成员的生物作用。本质上，stat5在treg的功能和发育中发挥关键作用，持续激活的stat5与抗肿瘤免疫的抑制和肿瘤细胞增殖、侵袭和存活的增加有关。免疫疗法
63.近年来，针对癌症的癌症免疫疗法的开发和实施急剧增加。抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)和抗程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)抗体的批准，使各种癌症的疾病结果得到了显著改善。与旨在干扰肿瘤细胞生长和存活的化学疗法和放射疗法不同，免疫疗法通过提高患者的抗肿瘤免疫反应来间接靶向肿瘤。尽管这些疗法在许多形式的癌症中取得了巨大的成功，但成功率普遍较低，并且仍然缺乏定义客观临床反应的生物标志物。
64.目前癌症免疫疗法的生物学基础是癌症免疫监测的概念，它提出免疫系统会消除肿瘤细胞，因为这些细胞拥有新的抗原并触发免疫反应，使得肿瘤消退并且没有其存在的临床迹象。在检验这一理论的一项开创性研究中，表明化学诱发的肉瘤在免疫功能不全的小鼠中比在野生型动物中生长得更快、更具侵袭性，因为前者缺乏淋巴细胞(有重组激活(rag)基因的工程突变)或它们不能对ifnγ作出反应，这是因为ifnγ受体基因或stat-1基因的丢失。通过使用具有rag2-/-/stat1-/-双重突变的小鼠来显示免疫监测，这些小鼠自发地形成了肿瘤。这些肿瘤类似于人类的一些主要恶性肿瘤，如乳腺、肺或结肠。通过在小鼠之间移植肿瘤，显示了癌症免疫编辑。当肿瘤从免疫功能不全的小鼠移植到免疫功能正常的小鼠时，40％的肿瘤被排斥。而当使用来自同基因免疫功能正常的小鼠的肿瘤进行移植时，没有发生排斥反应。这清楚地表明，免疫功能正常的动物发生了免疫编辑，即使它们不能排斥自己的肿瘤，仍能够逃避免疫监测。经过数十年的后续工作，引入了一种新的肿瘤免疫理论。所述理论提出了三个步骤：1)在早期阶段消除(elimination)肿瘤(免疫监测假说)，2)平衡(equilibrium)，指的是免疫系统控制肿瘤的状态，以及3)逃避(escape)，此时肿瘤细胞被免疫编辑并在没有免疫控制的情况下生长。这三个e的理论仍然是全世界公认的理论，作为理解癌细胞与免疫系统相互作用的基础。所述理论也为爆炸性的癌症免疫疗法领域铺平了道路。
65.癌症的免疫疗法提高了身体的自然防御能力以对抗癌症。它使用由人体或实验室
制造的物质来改善或恢复免疫系统功能。癌症免疫疗法包括例如单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、用例如嵌合抗原受体修饰的免疫细胞以及其他非特异性免疫疗法，所述疗法通过例如特异性靶向癌细胞、克服对免疫系统的抑制(例如通过骨髓抑制细胞)等来提高免疫系统的功能或作用。
66.治疗癌症的单克隆抗体包括例如抗cd20抗体(例如治疗癌症的单克隆抗体包括例如抗cd20抗体(例如)、抗her2抗体(例如)、抗her2抗体(例如)、抗cd30抗体(例如)、抗cd19和抗cd3双特异性抗体(例如)、抗vegf抗体(例如)、抗egfr抗体(例如)、抗pdgfr-α抗体(例如)、抗cd38抗体(例如)、抗slamf7抗体(例如)、抗gd2抗体(例如)、抗cd19抗体(例如)、抗rankl抗体(例如)、抗epcam和抗cd3抗体(例如)、抗epcam抗体(例如)、抗cd52抗体(例如)和抗cd33抗体(例如)。
67.治疗癌症的检查点抑制剂包括例如纳武单抗(nivolumab)(opdivo)、派姆单抗(pembrolizumab)(keytruda)、阿特珠单抗(atezolizumab)(tecentriq)、伊匹单抗(ipilimumab)(yervoy)、度伐利尤单抗(durvalumab)阿维鲁单抗(avelumab)利瑞鲁单抗(lirilumab)和bms-986016(瑞拉利单抗(relatlimab))。纳武单抗、阿特珠单抗、派姆单抗、度伐利尤单抗和阿维鲁单抗作用于检查点蛋白pd-1/pd-l1并抑制抗肿瘤免疫细胞的凋亡。伊匹单抗作用于ctla4并防止ctla4下调肿瘤中激活的t细胞。利瑞鲁单抗作用于kir并促进自然杀伤细胞的激活。bms-986016作用于lag3，激活抗原特异性t淋巴细胞并增强细胞毒性t细胞介导的肿瘤细胞裂解。
68.治疗癌症的嵌合抗原受体包括例如t细胞中的抗cd19 car(例如和)。car疗法还可以针对多种肿瘤相关抗原，包括例如4-1bb、5t4、腺癌抗原、甲胎蛋白、baff、b淋巴瘤细胞、c242抗原、ca-125、碳酸酐酶9(ca-ix)、c-met、ccr4、cd152、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23(ige受体)、cd28、cd30(tnfrsf8)、cd33、cd4、cd40、cd44 v6、cd51、cd52、cd56、cd74、cd80、cea、cnto888、ctla-4、dr5、egfr、epcam、cd3、fap、纤连蛋白额外结构域-b、叶酸受体1、gd2、gd3神经节苷脂、糖蛋白75、gpnmb、her2/neu、hgf、人类分散因子受体激酶、igf-1受体、igf-i、igg1、l1-cam、il-13、il-6、胰岛素样生长因子i受体、α5β1-整合素、整合素αvβ3、morab-009、ms4a1、muc1、粘蛋白canag、n-羟乙酰基神经氨酸、npc-1c、pdgf-rα、pdl192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、rankl、ron、ror1、sch 900105、sdc1、slamf7、tag-72、肌腱蛋白c、tgfβ2、tgf-β、trail-r1、trail-r2、肿瘤抗原ctaa16.88、vegf-a、vegfr-1、vegfr2、707-ap、art-4、b7h4、bage、β-连环蛋白/m、bcr-abl、mn/c ix抗体、camel、cap-1、casp-8、cd25、cdc27/m、cdk4/m、ct、cyp-b、dam、erbb3、elf2m、emmprin、etv6-aml1、g250、gage、gnt-v、gp100、hage、hla-a*0201-r170i、hpv-e7、hsp70-2m、hst-2、htert(或htrt)、ice、il-2r、il-5、kiaa0205、lage、ldlr/fut、mage、mart-1/melan-a、mart-2/ski、mc1r、肌球蛋白/m、mum-1、mum-2、mum-3、na88-a、pap、蛋白酶-3、pl90次要bcr-abl、pml/rarα、prame、psa、psm、psma、rage、ru1或ru2、sage、sart-1或sart-3、存活素、tpi/m、trp-1、trp-2、trp-2/int2、wt1、ny-eso-1或ny-eso-b或波形蛋白。
69.癌症疫苗包括例如人类乳头瘤病毒(hpv)疫苗、树突状细胞疫苗(例如用于前列腺癌的)、肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、溶瘤病毒疫苗(例如imlygic
tm
)、非霍奇金淋巴瘤和套细胞淋巴瘤疫苗(例如biovaxid
tm
)、乳腺癌疫苗(例如neuvax
tm
)、脑癌疫苗(例如dcvax
tm
、cdx-110
tm
)、胰腺癌疫苗(例如gvax pancreas、hyperacute
tm pancreas)、结直肠癌疫苗(例如imprime)、膀胱癌疫苗(例如bcg
tm
)、实体瘤疫苗(例如ok432
tm
)、肺癌和胃肠道癌疫苗(例如psk
tm
)、宫颈癌疫苗(例如schizophyllan
tm
)和胃癌疫苗(例如lentinan
tm
)。
70.治疗癌症的其他免疫疗法包括例如il-2白喉毒素融合蛋白(例如)。癌症的类型
71.可以用本文所述方法治疗的癌症包括例如fda批准的免疫疗法的批准适应症，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星不稳定性高的癌症、胃癌、宫颈癌、肝细胞癌、默克尔细胞癌、肾细胞癌晚期或转移性尿路上皮癌、不可切除的iii期非小细胞肺癌不可切除或转移性黑色素瘤、转移性非小细胞肺癌、晚期肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、复发性或转移性鳞状细胞癌、晚期或转移性尿路上皮癌、微卫星不稳定性高或错配修复缺陷的转移性结直肠癌、肝细胞癌尿路上皮癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、小细胞肺癌转移性默克尔细胞癌不可切除的转移性黑色素瘤、晚期肾细胞癌、微卫星不稳定性高或错配修复缺陷的转移性结直肠癌难治性弥漫性b细胞淋巴瘤、复发性或难治性急性淋巴细胞白血病或弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、高等级b细胞淋巴瘤
72.可以用本文所述方法治疗的癌症还包括例如正在研发的适应症，如急性骨髓性白血病、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、转移性实体恶性肿瘤(lirilumab
tm
)；或黑色素瘤、晚期结直肠癌、晚期脊索瘤、转移性黑色素瘤、胃/食道癌、实体瘤、胃癌、晚期肾细胞癌、晚期非小细胞肺癌(relatlimab
tm
)。
73.可以用本文方法治疗的其他癌症包括例如肉瘤、癌瘤、黑色素瘤、脊索瘤、恶性组织细胞瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、骨髓增生性疾病。在一些实施例中，癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合症和/或骨髓增生性疾病。使用iage进行癌症治疗
74.作为免疫疗法候选者的患有癌症的受试者(如上所述)需要抽血，并如上所述计算iage和crs。如果受试者的iage在其年龄组中处于最年轻的iage四分位数(参见表1)，则他们可以被归类为反应者并继续进行免疫疗法。如果受试者的iage处于中间两个四分位数，则受试者的血细胞(例如cd4+和cd8+细胞)受到刺激，并测量jak-stat活性(参见例如下面的实例1)。jak-stat活性处于最高四分位数的受试者可以被归类为反应者，并且可以用免疫疗法进行治疗。jak-stat活性处于较低三个四分位数的受试者可以被归类为无反应者，并接受治疗以降低iage(并增加其jak-stat评分)，进入反应者组。如果受试者的iage处于最年长的四分位数，则他们可以被归类为无反应者，并接受治疗以降低其iage(参见下文)，进入更年轻的iage四分位数的反应者组。
75.可替换的，如果受试者的iage处于其年龄组中最年轻的iage五分位数(参见表1)，则他们可以被归类为反应者并继续进行免疫疗法。如果受试者的iage处于中间三个五分位数，则受试者的血细胞(例如cd4+和cd8+细胞)受到刺激，并测量jak-stat活性(参见例如下面的实例1)。jak-stat活性处于最高四分位数的受试者可以被归类为反应者，并且可以用免疫疗法进行治疗。jak-stat活性处于下三个四分位数的受试者可以被归类为无反应者，并接受治疗以降低iage(并增加其jak-stat评分)，进入反应者组。如果受试者的iage处于最年长的五分位数，则他们可以被归类为无反应者，并接受治疗以降低其iage(参见下文)，进入更年轻的iage五分位数的反应者组。
76.仍旧可替换的，如果受试者的iage在其年龄组中处于最年轻的iage三分位数(参见表1)，则他们可以被归类为反应者并继续进行免疫疗法。如果受试者的iage处于中间的三分位数，则受试者的血细胞(例如cd4+和cd8+细胞)受到刺激，并测量jak-stat活性(参见例如下面的实例1)。jak-stat活性处于最高四分位数的受试者可以被归类为反应者，并且可以用免疫疗法进行治疗。jak-stat活性处于下三个四分位数的受试者可以被归类为无反应者，并接受治疗以降低iage(并增加其jak-stat评分)，进入反应者组。如果受试者的iage处于最年长的三分位数，则他们可以被归类为无反应者，并接受治疗以降低其iage(参见下文)，进入更年轻的iage三分位数的反应者组。降低iage的手段/媒介
77.除了使用iage对患者进行分类(图3)之外，还可以用于通过比较受试者的个体蛋白质水平与人群(例如实足年龄相仿)的蛋白质水平，得出个体炎症特征。所得标记/特征(或条形码)用于使用药物库数据库(www.drugbank.ca)进行蛋白质-化合物关联(pci)分析，并且可以生成降低iage的个性化初始疗法(图3)。可以每周监测遵循个性化建议的患者的iage变化，直到他们达到最佳水平(低于给定年龄段的组平均水平)，并且他们转变为治疗表型的反应者(图3)。然后，患者被归类为反应者并适合免疫疗法治疗。
78.受试者可以通过将trail、ifng、groa、il2、tgfa、pai1和/或lif的水平降低到个人实足年龄的最佳水平的治疗来降低他们的iage。受试者还可以通过将mig、eotaxin、leptin、il-1b或mip1a的水平提高到个人年龄的最佳水平的治疗来降低他们的iage。
79.受试者还可以通过单独或组合使用以下任何一种减少任何全身性慢性炎症来降低他们的iage：(1)药物治疗，包括但不限于消炎药(nsaid，例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、塞来昔布、奥沙普嗪、吡罗昔康、吲哚美辛、美洛昔康、非诺洛芬、二氟尼柳、依托度酸、酮咯酸、甲氯芬那酸、萘丁美酮)或皮质类固醇(例如糖皮质激素、盐皮质激素)；(2)保健营养品或营养补充剂，包括但不限于鱼油、硫辛酸和姜黄素，或香料/草药，如姜、大蒜、姜黄、牛膝草、大麻、南非钩麻和辣椒；(3)饮食改变，包括但不限于增加高抗氧化剂和多酚类食物的摄入，如橄榄油、绿叶蔬菜(例如甘蓝和菠菜)、西兰花、鳄梨、绿茶、甜椒、辣椒、蘑菇、黑巧克力、可可、西红柿、多脂鱼(例如鲑鱼、沙丁鱼、鲱鱼、凤尾鱼和鲭鱼)、坚果(核桃和杏仁)和水果(例如樱桃、黑莓、蓝莓、覆盆子、草莓、葡萄和橙子)，和/或减少可能增加炎症的食物的摄入，如精制碳水化合物(例如白面包和糕点)、高果糖玉米糖浆、精制糖、加工和包装食品、油炸食品、红肉、过量酒精和加工肉类；以及(4)生活方式改变，包括但不限于消除或减少吸烟和酒精摄入，保持健康体重和降低压力水平。
80.从下面的实验细节将更好地理解本文公开的发明。不过，本领域技术人员会容易
理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是对随后的权利要求书中更全面描述的本发明的说明。除非另有说明，本公开不限于特定的程序、材料等，因此可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。实例实例1：iage与初始cd8(+)t细胞和对刺激的离体jak-stat信号传导反应相关
81.循环初始cd8(+)t细胞的频率随着高iage而下降(a)，iage可以预测对刺激的离体jak-stat信号传导反应不良(b和c)。关于受试者的iage，分析了总共96种细胞因子-细胞-stat组合。这些包括八种细胞类型：b细胞、cd4(+)t细胞(及其cd45(+)和(-)亚群)、cd8(+)t细胞(及其cd45(+)和(-)亚群)和单核细胞；四种细胞因子：白细胞介素-6(il-6)、il-10、il-21和干扰素-α；和三种stat蛋白(stat1、3和5)。图1b：火山图，在调整了年龄、性别和巨细胞病毒状态后，用置换检验估计错误发现率(benjamini-hochberg fdr)(y轴)的多元回归分析结果，作为针对iage获得的回归系数的函数。图1c：归一化的离体cd8(+)t细胞对白细胞介素-6的磷酸-stat-1反应。iage的较低三分位数比iage的较高三分位数显示出显著更稳固的反应(c)。
82.iage与初始cd8(+)t细胞和对刺激的离体jak-stat信号传导反应呈负相关关系。实例2：使用iage和crs对癌症患者进行分层
83.在进行免疫疗法治疗之前，从患者获得血液样本。通过标准方法分离血清和免疫细胞。血清样本用于测量蛋白质浓度，以确定炎症年龄(iage)；细胞离体受到细胞因子刺激，以测量细胞内信号转导和转录激活因子(stat)蛋白的磷酸化，得出细胞因子反应评分(crs)。iage和crs可以独立地预测患者对免疫疗法治疗的反应。图2显示了该过程的流程图。
84.iage和crs可用于在治疗前将癌症患者分层为免疫疗法的反应者和无反应者。实例3：使用iage对癌症患者进行分层
85.iage可用于将癌症患者分类为对免疫疗法治疗有反应者和无反应者(a)，并得出iage个体炎症蛋白标记/特征(条形码)，将其输入iage个性化推荐引擎，以创建旨在降低iage的个体化初始疗法，为医疗决策提供信息，从而将那些无反应的患者转变为有反应的患者(适合免疫疗法)(b)。图3显示了该过程的流程图。
86.iage被用于对患者进行分层以进行癌症免疫疗法，并帮助将对免疫疗法的无反应者转变为反应者。
87.本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请都通过以其全文形式被援引加入本文。应当理解，所公开的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明仅受所附权利要求的限制。
88.本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施例的许多等同物。这些等同物旨在被所附权利要求所涵盖。