用于将非血体液中的生物标记物与血液中的生物标记物相关联的方法和装置与流程

用于将非血体液中的生物标记物与血液中的生物标记物相关联的方法和装置
1.交叉引用
2.本技术要求于2019年11月6日提交的美国临时专利申请第62/931,609号的权益，其出于所有目的以其整体并入本文。


背景技术：

3.本技术尤其涉及用于将非血体液中的生物标记物与血液中的生物标记物相关联的方法和装置。
4.在许多情况下，测量非血体液中的生物标记物优于测量血液中的生物标记物，因为(a)其可避免切入皮肤或将针插入静脉中，以及(b)其容易、快速且无痛。然而，在非血液流体中的生物标记物浓度与在血液中的生物标记物浓度之间的关系可以因人而异，使得难以并且通常不可能在所有人中使用单一的通用转换关系/常数进行转换。例如，唾液中的葡萄糖浓度与血液中的葡萄糖浓度的关系因人而异，因为每个人的唾液腺具有它们自己的唯一性。然而，对于个人，非体液中的生物标记物与血液中的生物标记物的转换常数/关系通常是固定的。因此，有可能通过测量每个个体的非血体液中的生物标记物浓度与血液中的生物标记物浓度之间的转换常数/关系，然后使用该转换常数/关系将非血体液中的生物标记物的测量转换为该个体的血液中的生物标记物的测量，从而避免进一步使用血液测试。这是本发明的一个方面。


技术实现要素：

5.一种用于使非血体液(例如唾液)中的生物标记物(例如葡萄糖)与个体血液中的相同生物标记物相关联的方法。
6.本发明所公开的方法提供了一种用于医疗保健和医学的常规放血程序的方便且无痛的替代方法。
7.在一个或多个实施例中，本发明提供：
8.一种用于将非血体液中的生物标记物与个体的血液中的相同生物标记物相关联的方法，包含：
9.测量在第一时间段内(i)非血体液中的生物标记物和(ii)相同个体的血液中的相同生物标记物，以确定[nbbf1]所述第一时间段内非血体液中的生物标记物浓度，以及[bb1]所述第一时间段内血液中的相同生物标记物浓度；
[0010]
建立比r，所述比r为[nbbf1]与[bb1]的比；
[0011]
将比r存储在存储器(例如，非瞬态计算机可读介质)中；
[0012]
测量在第二时间段内非血体液中的生物标记物以确定[nbbf2]第二时间段内非血体液中的生物标记物浓度；以及
[0013]
将所测量的[nbbf2]与比r关联以产生关联的或估计的[bb2]第二时间段内个体血液中相同生物标记物的浓度。
[0014]
图1给出了本发明的示例性流程图。
[0015]
在某些实施例中，第一时间段还包括s个第一时间段子段，其中对于s个第一时间段子段，测量(i)非-血液体液中的生物标记物和(ii)相同个体的血液中的相同生物标记物以确定[nbbf1-s]第一时间段内非血体液中的生物标记物浓度，和[bb1-s]第一时间段内血液中的相同生物标记物浓度，以及(b)建立比r，其为[nbbf1-s]与[bb1-s]的比，其中s为；
[0016]
建立s个第一时间段子段的比r，即[nbbf1-s]与[bb1-s]的比；
[0017]
将所述第一时间段子段的比r'存储在存储器(例如，非瞬态计算机可读介质)中；
[0018]
测量在第二时间段内非血体液中的生物标记物以确定[nbbf2]第二时间段内非血体液中的生物标记物浓度；以及
[0019]
将所测量的[nbbf2]与第一时间段子段的比r相关联以产生关联的或估计的[bb2]第二时间段内个体血液中相同生物标记物的浓度。
[0020]
在某些实施例中，用于第一时段测量非血体液中的生物标记物的装置与用于测量血液中的生物标记物的装置处于相同位置。在某些实施例中，两个装置处于不同位置。
[0021]
在某些实施例中，用于测量第一时间段的非血体液中的生物标记物的装置和用于测量血液中的生物标记物的装置是同一装置。
[0022]
在某些实施例中，本发明的相同方法和装置用于不可流动样品(包括难以自己流动的样品)。
[0023]
在某些实施例中，所述血液样品用于
[0024]
术语“比r”、“r比”和“r”可互换。
附图说明
[0025]
如果有的话，下面描述的附图仅用于说明目的。在一些图中，附图是按比例的，而在其它图中不是按比例的。为了清楚起见，一些元件在图中示出时被放大。这些附图并非旨在限制本公开的范围。
[0026]
图1.本发明的示例性流程图。
具体实施方式
[0027]
以下详细描述通过示例而非限制的方式示出了本发明的某些实施例。本文使用的章节标题和任何副标题仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。章节标题和/或副标题下的内容不限于章节标题和/或副标题，而是适用于本发明的整个描述。
[0028]
在一个或多个实施例中，本发明提供例如：
[0029]
一种用于将非血体液中的生物标记物与个体的血液中的相同生物标记物相关联的方法，包含：
[0030]
测量在第一时间段内(i)非血体液中的生物标记物和(ii)相同个体的血液中的相同生物标记物，以确定[nbbf1]所述第一时间段内非血体液中的生物标记物浓度，以及[bb1]所述第一时间段内血液中的相同生物标记物浓度；
[0031]
建立比r，其为[nbbf1]与[bb1]之比；
[0032]
将比r存储在存储器(即，非瞬态计算机可读介质)中；
[0033]
测量在第二时间段内非血体液中的生物标记物以确定[nbbf2]第二时间段内非血体液中的生物标记物浓度；以及
[0034]
将所测量的[nbbf2]与比r关联以产生关联的或估计的[bb2]第二时间段内个体血液中相同生物标记物的浓度。
[0035]
一种装置，包含：用于沉积第一样品的第一区域；以及用于沉积第二样品的第二区域，其中所述第一和第二区域在同一样品卡上的同一表面上物理分离并流体隔离。
[0036]
不同个体的r比可以不同。对于相同的个体，r比可以在一段时间之后变化。本发明的一个方面是为个体建立r比和/或在一段时间之后和/或周期性地重新校准她或他的r比。
[0037]
如任一前述实施例所述的方法，还包括周期性地校准比r以建立重新校准的[nbbfx]/[bbx]比(即，r-x)，其中x是第n个时间段。在一些实施例中，n为3至100。在一些其它实施例中，n大于100。
[0038]
建立r比
[0039]
r比的相关性可以显著取决于以下因素，例如：(i)用于建立r比的成对测量的数量；(ii)在成对测试中，血液生物标记物测试和非血体液生物标记物测试之间的时间间隔(因为个体体内的生物标记物浓度可以随时间变化)；(iii)用于进行测试的仪器和/或方法(因为不同的仪器和/或方法可以给出相同样品的不同读数)；或(iv)其任何组合。
[0040]
如任一前述实施例所述的方法，其中校准选自：一对校准测试；或者数对校准测试，例如2至50对，并且所述校准测试持续一段时间以建立[nbbfa]/[bba]平均比，其中[nbbfa]是非血体液中的平均生物标记物浓度，并且[bba]是所述时间段内个体的血液中的平均生物标记物浓度。
[0041]
在一些实施例中，该方法可以包括例如以下中的一个或多个：
[0042]
确定每个个体的r；
[0043]
重新校准每个个体的r比；
[0044]
建立一天中不同时间的r比；
[0045]
建立一年的r比；
[0046]
其它生物标记物(例如代谢物、核酸、无细胞dna rna等实体)；
[0047]
其它体液(例如，汗液、尿液、泪液等实体)；
[0048]
使用具有血液葡萄糖和唾液葡萄糖能力的qmax卡来在相同时间或同时测量不同样品中的分析物，即，在同一样品卡中同时多路复用实质上不同的样品。对于申请人在类似卡或应用中的复用技术和方法的其他示例，参见esx-103prv、esx-106prv(例如，p.13-17)和esx-029wo(例如，p.140-146)。
[0049]
一种建立r比的方法，包含：在例如1小时或更短、50分钟或更短、40分钟或更短、30分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短的时间间隔，包括中间值或范围内测量一对bb和nbbf样品。
[0050]
一种建立r比的方法，包含：测量bb和nbbf样品对，其中所有bb样品使用相同的仪器测量，并且所有nbbf样品通过另一个或通过相同的仪器和/或方法测量。
[0051]
一种建立r比的方法，包含：在例如1小时或更短、50分钟或更短、40分钟或更短、30分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短的时间间隔内，包括中间值或范围内测量bb和nbbf样品对，，测量bb和nbbf样品对，其中使用相同的仪器测量
所有bb样品，并且通过另一仪器或通过相同的仪器和/或方法测量所有nbbf样品。
[0052]
将nbbf与r比相关联以产生相关bb
[0053]
通过使nbbf与r比相关而产生的相关bb的相关性可显著取决于建立r比和测量nbbf所用的仪器和/或方法。
[0054]
一种使nbbf与r比相关以产生相关bb的方法，包含：使用与用于建立所述r比相同的仪器和/或方法测量nbbf。
[0055]
重新校准r比
[0056]
如任一前述实施例所述的方法，其中周期性地校准在选自例如每小时、每天、每周、每月、每半年、每年或其组合的时间段，包括中间值和范围内完成周期性校准。
[0057]
如任一前述实施例所述的方法，其中建立重新校准的[nbbfx]/[bbx]比在选自以下的至少一个时间段内完成：每分钟、每小时、每天早晨、每天正午、每夜、每半夜、每天、每周、每月、每半年、每年、每两年，包括中间的时间周期和范围。
[0058]
如任一前述实施例所述的方法，其中通过求解下式中的[bb2]实现关联：
[0059]
[nbbf2]/[bb2]＝r，
[0060]
或当重排并替换r时：
[0061]
[bb2]＝[bb1]/[nbbf1][nbbf2]。
[0062]
如任一前述实施例所述的方法，其中所述第一时间段与所述第二时间段之间的差值是以下各项中的至少一项：从5分钟至10分钟、从20分钟至30分钟、从30分钟至40分钟、从40分钟至50分钟、从50分钟至60分钟、每小时、每天、每周、每月、每半年、每年，或每两年，包括中间值和范围。
[0063]
如任一前述实施例所述的方法，其中在存储器中存储所述比是用移动通信装置实现的。
[0064]
如任一前述实施例所述的方法，其中所述非血体液是唾液，并且所述周期性地校准在选自每小时、每天、每周、每月、每半年、每年或其组合的至少一个间隔的时段，包括中间值和范围内完成。
[0065]
如任一前述实施例所述的方法，还包括应用机器学习(ml)以通过对例如由当前公开的装置(具有分离的样品沉积区域的卡)和相关成像设备产生的初步结果、二次结果或三次结果进行人工比较来提高所述方法的准确度。
[0066]
一种将非血体液中的葡萄糖浓度与个体血液中的葡萄糖相关联的方法，包含：
[0067]
测量在第一时间段内非血体液中的葡萄糖并测量同一个体的血液中的葡萄糖以建立[gnbf1]/[gb1]比，其中[gnbf1]是第一时间段内非血体液中的葡萄糖浓度，[gb1]为第一时间段内个体血液中的葡萄糖浓度；
[0068]
将[gnbf1]/[gb1]比存储在存储器中；
[0069]
测量在第二时间段内[gnbf2]，非血体液中的葡萄糖浓度；以及
[0070]
将所测量的[gnbf2]与[gnbf1]/[gb1]比相关联以产生在第二时间段内在所述个体血液中的相关的估计[bb2]葡萄糖浓度。
[0071]
如任一前述实施例所述的方法，其中所述非血体液是唾液。
[0072]
如任一前述实施例所述的方法，进一步包含周期性地校准[gnbf1]/[gb1]比以建立重新校准的[gnbfx]/[gbx]比，其中x是第n个时间段，其中n是3到100。
[0073]
如任一前述实施例所述的方法，其中建立重新校准的[nbbfx]/[bbx]比在选自以下的至少一个时间段间隔内完成：每分钟、每小时、每天早晨、每天正午、每夜、每半夜、每天、每周、每月、每半年、每年、每两年，包括中间的时间周期和范围。
[0074]
如任一前述实施例所述的方法，其中将所述[gnbf1]/[gb1]比存储在存储器中是在移动通信装置中完成的并且通过所述移动通信装置中的软件进行分析。
[0075]
括号内浓度如[nbbf2]是非血体液中的生物标记物浓度，并且通常以例如毫克/分升(mg/dl)为单位表达。
[0076]
非血体液
[0077]
本发明的生物标记物的一些示例包含：唾液、汗液、尿液、泪液等实体。
[0078]
在某些实施例中，本发明的相同方法和装置用于不可流动样品(包括难以自己流动的样品)。一个示例是使用qmax，该qmax用于两个板以使不可流动的样品变形为薄层用于测定。
[0079]
适用于本发明的生物样品的示例包括但不限于血液、血清、血浆、鼻拭子、鼻咽洗液、唾液、尿液、胃液、脊髓液、泪液、粪便、粘液、汗液、耳垢、油脂、腺体分泌物、脑脊髓液、组织、精液、阴道分泌物、源自肿瘤组织的间质液、眼液、脊髓液、咽喉拭子、呼吸、毛发、指甲、皮肤、活组织检查、胎盘液、羊水、脐带血、淋巴液、腔液、痰液、脓液、微生物群、胎粪、母乳、呼出的冷凝物和/或其它排泄物。样品可包括鼻咽洗液。鼻拭子、咽喉拭子、粪便样品、毛发、指甲、耳垢、呼吸和其它固体、半固体或气体样品可在其分析之前在提取缓冲液中处理(例如固定或可变量的时间)。如果需要，提取缓冲液或其等分试样然后可以类似于其它流体样品进行处理。对象的组织样品的示例可包括但不限于结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织、软骨、癌样品或骨。
[0080]
在某些实施例中，不可流动物质在被测量之前首先溶解在溶液中。
[0081]
生物标记物
[0082]
可以使用本发明的方法和装置测量的生物标记物包含分子、蛋白质、核酸(例如dna、rna)、细胞或纳米颗粒。
[0083]
本发明的生物标记物的一些示例包括但不限于：
[0084]
脂质组生物标记物：
[0085]
1)总胆固醇-以载体脂蛋白(hdl、ldl和vldl)的形式遍及身体行进的蜡状、脂肪样物质；类固醇激素和胆汁盐的前体。
[0086]
2)甘油三酯-测量脂肪在我们体内的主要储存形式的血液水平；也称为三酰甘油。
[0087]
3)ldl-c-与血液中低密度脂蛋白(ldl)颗粒相关的胆固醇的量。
[0088]
4)hdl-c-与血液中高密度脂蛋白(hdl)颗粒相关的胆固醇的量。
[0089]
综合代谢组生物标记物：
[0090]
(全部包括脂质组：总胆固醇、甘油三酯、ldl-c和hdl-c)
[0091]
1)葡萄糖-血糖浓度；
[0092]
2)bun(血尿素氮)-肾功能标记物。
[0093]
3)肌酸酐-肌酸分解的副产物。
[0094]
4)钠-正电荷电解质，对于肌肉收缩、养分吸收、神经功能、ph平衡是必需的。
[0095]
5)钾-正电荷电解质，对于肌肉收缩、ph平衡、神经信号传导和动作电位是必需的。
[0096]
6)氯化物-带负电的电解质；对于维持跨细胞膜的细胞平衡和胃酸的产生是重要的。
[0097]
7)二氧化碳(co2)-测量血液碳酸氢盐并且是co2气体的替代标记物。
[0098]
8)尿酸-肾脏中dna嘌呤碱基代谢和排泄的终产物；
[0099]
9)白蛋白-血清中最丰富的血浆蛋白，在肝脏中合成，与血液中的其它化合物结合并形成血浆渗透梯度。
[0100]
10)球蛋白-不同亚型的血浆蛋白。
[0101]
11)钙-在体内发挥多种作用，包括牙齿和骨骼健康、凝血、神经递质功能、肌肉收缩和酶活性。
[0102]
12)磷-参与dna和rna合成的矿物质，atp的一部分，帮助激活酶。
[0103]
13)碱性磷酸酶(alp)-在肝、骨、肾、小肠和胎盘中发现的酶。
[0104]
14)丙氨酸氨基转移酶(alt或sgpt)-一种在肝脏中发现浓度最高但在心脏、肌肉和肾脏中也以较少量存在的酶。
[0105]
15)天冬氨酸氨基转移酶(ast或sgot)-一种通常由于活性组织和细胞破坏而升高的胞内酶。
[0106]
16)ldh-乳酸脱氢酶；
[0107]
17)总胆红素-血红细胞分解的副产物和胆汁的重要组分；作为抗氧化剂发挥作用。
[0108]
18)ggt-主要在肝、肾和胰腺中发现的酶。
[0109]
19)铁-测量与转铁蛋白结合的铁，表示转铁蛋白总铁结合能力的～1/3。单独地，是相对较差的铁状态标记物。
[0110]
20)tibc-测量转铁蛋白的铁-结合能力。
[0111]
其他常见和推荐的生物标记物：
[0112]
1)c-反应蛋白
[0113]
2)皮质醇
[0114]
3)dhea
‑‑
硫酸盐
[0115]
4)估计肾小球滤过率(egfr)
[0116]
5)雌二醇
[0117]
6)铁蛋白：身体的铁结合蛋白。
[0118]
7)叶酸
[0119]
8)血红蛋白a1c
[0120]
9)高半胱氨酸
[0121]
10)孕酮
[0122]
11)前列腺特异性抗原(psa)
[0123]
12)睾酮
[0124]
13)促甲状腺激素
[0125]
14)维生素d，25-羟基
[0126]
15)脑利钠肽
[0127]
其他血液测试：
[0128]
1)abo分组(血型)-用于血型分类的测试。
[0129]
2)抗核抗体(ana)-自身免疫性疾病的一般测试
[0130]
3)铝(血液)-该血液测试测量铝水平。
[0131]
4)酒精
[0132]
5)砷(血液)-该血液测试用于测量砷水平。
[0133]
6)性传播疾病(std)-对于所有传染原不存在单一测试。性传播感染(sti)的筛选通常包括梅毒、毛滴虫、淋病、衣原体、疱疹、肝炎和hiv。
[0134]
全血计数(cbc)生物标记物：
[0135]
rbc：红细胞计数(红细胞)；血红蛋白、血细胞比容、mcv：平均红细胞体积；mch：平均红细胞血红蛋白；mchc：平均红细胞血红蛋白浓度；血小板；mpv；rdw：红细胞分布宽度；绝对嗜中性粒细胞；绝对淋巴细胞；绝对单核细胞；绝对嗜酸性粒细胞；绝对嗜碱性粒细胞。
[0136]
贫血生物标记物：
[0137]
促红细胞生成素(epo)、网织红细胞、铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体(strr)、叶酸(叶酸盐)、转铁蛋白、血红蛋白、不饱和铁结合能力(uibc)、铁、维生素b12、铁饱和度。
[0138]
自身免疫性疾病生物标记物：
[0139]
抗-双链dna ab(dsdna)、抗-sjogren综合征ab(ss-b/la)、抗-核ab(ana)、抗-核糖核蛋白ab(rnp)、抗-平滑肌ab(asma)、抗-线粒体ab(ama)、抗-sjogren综合征ab(ss-a/ro)，抗-甲状腺过氧化物酶ab(tpo)。
[0140]
骨病生物标记物：
[0141]
碱性磷酸酶(alp)、骨钙蛋白、氨基端前肽1型胶原(pinp)、甲状旁腺素(pth)、骨特异性碱性磷酸酶(bsap)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tracp5b)、钙(ca)、维生素d、1,25二羟基、c-末端i型胶原端肽(ctx)、维生素d、25羟基、n-末端i型胶原端肽(ntx)。
[0142]
心脏标记物：
[0143]
载脂蛋白e(apo e)、内皮素-1、脑利钠肽(bnp)、ldh、ck、钾、ckmb、pro-b-型利钠肽(pro-bnp)、c-反应蛋白(crp)、肌钙蛋白i、crphs(超敏感性)。
[0144]
糖尿病生物标记物：
[0145]
c-肽、hba1c、胆固醇酯转移蛋白(cetp)、ia-2抗体、游离脂肪酸(ffa)、胰岛素、果糖胺、胰岛素生长因子(igf-1)、胰高血糖素、微量白蛋白、葡萄糖、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶-65(gad-65)抗体。
[0146]
内分泌学生物标记物：
[0147]
α-胎蛋白、生长激素、肾上腺促肾上腺皮质激素(acth)、生长释放因子(grf)、皮质酮、催乳素、皮质醇、睾酮、促卵泡激素(fsh)。
[0148]
胃肠病学生物标记物：
[0149]
胃泌素、脂肪酶。
[0150]
感染性疾病生物标记物：
[0151]
抗hbs、乙型肝炎病毒负荷(定量)、抗-hbc、丙型肝炎基因型、抗-hbe、丙型肝炎病毒负荷(定性)、抗-hcv、丙型肝炎病毒负荷(定量)、抗-hiv i/ii、hiv病毒负荷(定量)、沙眼衣原体、单核细胞增多症、巨细胞病毒(cmv)、结核分枝杆菌、hbsag、淋病奈瑟菌。
[0152]
炎症/免疫生物标记物：
[0153]
cd细胞标记物*、免疫球蛋白(iga、igg、igm)、凝聚素(载脂蛋白j)、细胞内粘附分子-1(icam-1)-2复合物、c-反应蛋白(crp)、ip-10(il-12p70)-2-复合物、crphs(超灵敏)、isg15基因表达、内皮素-1、isg56基因表达、纤维蛋白原、巨噬细胞炎性蛋白(mip1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g-6-pdh),巨噬细胞炎性蛋白(mip1)、hla-a、基质金属蛋白酶-2(mmp-2)、hla-b、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、hla-c、ifn诱导的单核因子(mig/cxcl9)、ifn-α、新蝶呤、ifn(il-2,il-4-il-10)-4-复合物、oas1基因表达、il-10、oas2基因表达、il-10(il-2,il-4,ifn)-4-复合物、oas3基因表达、il-1、rantes/ccl5、il-2(il-4,il-10-ifn)-4-复合物、血清淀粉样蛋白(saa)、il-4(il-2,il-10,ifn)-4-复合物、肿瘤生长因子(tgf-1)、il-6、肿瘤坏死因子(tnf)、il-8、血管粘附分子-1(vcam-1)-2复合物。
[0154]
脂质代谢生物标记物：
[0155]
载脂蛋白ai(apo ai)、胆固醇、载脂蛋白aii(apo aii)、hdl-胆固醇、载脂蛋白b-100(apo b)、ldl-胆固醇(直接)、载脂蛋白b48(apo b48)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lcat)、载脂蛋白cii(apo cii)、对氧磷酶(pon1)、载脂蛋白ciii(apo ciii)、磷脂酰肌醇聚糖f(pigf)、载脂蛋白e(apo e)、甘油三酯。
[0156]
肾病生物标记物：
[0157]
α-gst、肾小球滤过率、β-2-微球蛋白(血清)、微白蛋白、β-2-微球蛋白(尿)、n-乙酰氨基葡糖苷酶(nag)、iv型胶原、pi-gst、肌酸酐。
[0158]
肿瘤学生物标记物：
[0159]
bcl-2/igh、胎盘生长因子(plgf)、糖类抗原19-9(ca19-9)、前列腺特异性抗原(psa)、致癌胚胎抗原(cea)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgfb)。
[0160]
甲状腺标记物：
[0161]
抗-甲状腺过氧化物酶ab(tpo)、促甲状腺激素(tsh)、抗-甲状腺球蛋白ab、总甲状腺素(t4)、游离甲状腺素(ft4)、总三碘甲状腺氨酸(t3)、游离三碘甲状腺原氨酸(ft3)、tsh受体ab、甲状腺球蛋白。
[0162]
药物标记中的药物基因组学生物标记物：
[0163]
hla-b、esr(激素受体)、erbb2(her2)、erbb2(her2)、egfr、alk、gaa、erbb2(her2)、esr(激素受体)、pik3ca、nat2、nat2、cyp2d6、cyp2d6、cyp2d6、esr、pgr(激素受体)、ugt1a1、cyp2d6、cyp2d6、cyp2d6、pml-rara、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、g6pd、cd274(pd-l1)、基因标签(t-效应子)、egfr、alk、cyp2d6、pdgfra、f2(凝血酶原)、f5(因子v leiden)、proc、pros1、serpinc1(抗凝血酶iii)、cyp2c9、cd274(pd-l1)、tpmt、nudt15、ugt1a1、braf、ugt1a1、bcr-abl1(费城染色体)、ifnl3(il28b)、bcr-abl1(费城染色体)、alk、tnfrsf8(cd30)、cyp2d6、alk、cyp2c19、cyp2d6、bcr-abl1(费城染色体)、ret、dpyd、met、hla-b、hla-a、nags、cyp2d6、cyp2c19、cyp2d6、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、cyp2c9、alk、tpp1、egfr、ras、cyp2d6、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、g6pd、g6pd、tpmt、cyp2c19、cyp2d6、cyp2c19、cyp2d6、cyp2c19、cyp2d6、braf、cyp2d6、hbb、alk、ros1、braf、g6pd、ras、ifnl3(il28b)、egfr、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、g6pd、cyp2d6、ifnl3(il28b)、bcr-abl1(费城染色体)、il2ra(cd25抗原)、非特异性(恶性高热的遗传易感性)、cyp2d6、cyp2d6、cyp2d6、cyp2c19、cyp2d6、cyp2c19、mycn、esr、pgr(激素受体)、ugt1a1、cyp2d6、cyp2d6、cyp2c19、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、cd274(pd-l1)、染
色体17p、achr、aqp4、cyp2b6、slco1b1、ifnl3(il28b)、cftr、cyp2d6、galns、f5(因子v leiden)、serpinc1(抗凝血酶iii)、染色体7、染色体13、prf1、rab27a、sh2d1a、stxbp2、stx11、unc13d、xiap(噬血细胞淋巴组织细胞增生症)、idh2、braf、ras、nectin4、ros1、ntrk、fgfr、cyp2c9、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、egfr、g6pd、cyp2d6、cyp2c19、cyp2c19、proc、pros1、serpinc1(抗凝血酶iii)、dmd、erbb2(her2)、esr(激素受体)、esr、pgr(激素受体)、erbb2(her2)、cyp2d6、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、dpyd、dpyd、cyp2d6、cyp2c9、g6pd、cyp2d6、cyp2d6、cyp2c19、hla-b、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、cyp2d6、egfr、cyp2d6、cd33、flt3、cpox、hmbs、ppox(急性肝卟啉症)、g6pd、g6pd、g6pd、dmd、esr、pgr(激素受体)、非特异性(nat)、g6pd、染色体17p、染色体11q、myd88、cyp2d6、kit、bcr-abl1(费城染色体)、pdgfrb、fip1l1-pdgfra、cyp2d6、ugt1a1、aqp4、ttr、bcr-abl1(费城染色体)、hla-a、微卫星不稳定性、错配修复、cd274(pd-l1)、alk、egfr、ugt1a1、染色体17p、染色体4p；14q、染色体14q；16q、非特异性(恶性高热的遗传易感性)、非特异性(nat)、cyb5r、cyb5r、cftr、cftr、cftr、idh1、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、cyp2c19、cyp2c19、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、hla-dqa1、hla-drb1、ntrk、ifnl3(il28b)、染色体5q、微卫星不稳定性、错配修复、cyp2c9、esr、pgr(激素受体)、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、g6pd、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、cyp2d6、alk、ros1、hbb、f2(凝血酶原)、f5(因子v leiden)、proc、pros1、serpinc1(抗凝血酶iii)、sstr、g6pd、cyp2d6、cyp2c9、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、tpmt、nudt15、g6pd、cyb5r、g6pd、cyp2d6、cyp2d6、flt3、npm1、kit、gla、cyp2d6、bche、cyp2d6、hprt1、g6pd、cyp2d6、cyp2d6、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、bcr-abl1(费城染色体)、ugt1a1、brca、基因组不稳定性(同源重组缺陷)、g6pd、braf、cd274(pd-l1)、微卫星不稳定性、错配修复、egfr、alk、cyp2d6、smn2、ms4a1(cd20抗原)、brca、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、brca、基因组不稳定性(同源重组缺陷)、同源重组修复、ppp2r2a、pdgfra、bcr-abl1(费城染色体)、ifnl3(il28b)、cyp2c19、cyp2d6、egfr、cyp2c9、cyp2b6、hla-b、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、esr(激素受体)、erbb2(her2)、cyp2d6、cyp2d6、egfr、ras、cyp2c19、casr、cyp2d6、ttr、ugt1a1、hla-b、ifnl3(il28b)、g6pd、braf、cd274(pd-l1)、微卫星不稳定性、错配修复、egfr、alk、肿瘤突变负荷、fgfr2、cyp2d6、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、cyp2c9、cyp2c19、hla-b、cyp2d6、cyp2c9、cyp2d6、bcr-abl1(费城染色体)、cyp2c19、cyp2c9、cyp3a5、cyp2b6、g6pd、cyb5r、g6pd、非特异性(nat)、cyp2d6、cyp2d6、cyp2d6、cyp2d6、g6pd、cyp2d6、cyp2c19、esr(激素受体)、ugt1a1、egfr、ras、g6pd、cyb5r、ras、esr、pgr(激素受体)、erbb2(her2)、cyp2c9、cyp2d6、ms4a1(cd20抗原)、f5(因子v leiden)、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、slco1b1、brca、cyp2d6、cyp1a2、brca、杂合性缺失(同源重组缺陷)、ugt1a1、ret、ryr1、ifnl3(il28b)、cyp2c9、g6pd、非特异性(先天性高铁血红蛋白血症)、ass1、cps1、otc(尿素循环代谢障碍)、ifnl3(il28b)、ifnl3(il28b)、ifnl3(il28b)、g6pd、bche、g6pd、g6pd、非特异性(nat)、g6pd、非特异性(nat)、ttr、g6pd、brca、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、f5(因子v leiden)、f2(凝血酶原)、cyp2d6、cyp2d6、ifnl3(il28b)、cyp2d6、tpmt、nudt15、cyp2d6、cyp2c19、erbb2(her2)、ras、g6pd、g6pd、cyp2d6、esr(激素受体)、cyp2d6、braf、g6pd、ras、erbb2(her2)、esr、pgr(激素受体)、pml-rara、acadvl、cpt2、hadha、hadhb(长链脂肪酸氧化障碍)、cyp2d6、erbb2(her2)、cyp2d6、cyp2d6、
il12a、il12b、il23a、cyp2d6、polg、非特异性(尿素循环代谢障碍)、braf、ras、染色体17p、染色体11q、tp53、idh1、idh2、igh、npm1、flt3、cyp2d6、bcr-abl1(费城染色体)、cyp2c19、cyp2d6、hbb、cyp2c9、vkorc1、pros1、proc。
[0164]
药物测试标记物：
[0165]
酒精、苯异丙胺(除甲基苯丙胺外)、甲基苯丙胺、mdma(摇头丸)、巴比妥酸盐(除苯巴比妥外)、苯巴比妥、苯并二氮卓类、大麻素类、可卡因、可待因、可替宁(尼古丁的分解产物)、吗啡、三环抗抑郁药(tca's)、lsd、美沙酮、类固醇、pcp。
[0166]
实施例的其它示例是：
[0167]
1.一种用于将非血体液中的生物标记物与个体的血液中的相同生物标记物相关联的方法，包含：
[0168]
测量在第一时间段内非血体液中的生物标记物并测量相同个体的血液中的相同生物标记物以建立等于[nbbf1]/[bb1]的r比，其中[nbbf1]是第一时间段内非血体液中的生物标记物浓度，和[bb1]是在第一时间段内血液中的生物标记物浓度；
[0169]
将r比存储在存储器中；
[0170]
测量在第二时间段内非血体液中的生物标记物以确定[nbbf2]，其中[nbbf2]是第二时间段内非血体液中的生物标记物浓度；以及
[0171]
将所测量的[nbbf2]与所述r比相关联以产生在所述第二时间段内在所述个体的血液中相关的[bb2]生物标记物浓度。
[0172]
2.如实施例1所述的方法，进一步包含周期性地校准比r以建立重新校准的[nbbfx]/[bbx]比，其中x是第n个时间段，其中n是3到100。
[0173]
3.如实施例2所述的方法，其中校准选自：一对校准测试；或者数对校准测试，并且所述校准测试持续一段时间以建立[nbbfa]/[bba]平均比，其中[nbbfa]是非血体液中的平均生物标记物浓度，并且[bba]是所述时间段内个体的血液中的平均生物标记物浓度。
[0174]
4.如实施例2所述的方法，其中在选自每小时、每天、每周、每月、每半年、每年或其组合的时间段，包括中间值和范围内完成周期性校准。
[0175]
5.如实施例2所述的方法，其中建立重新校准的[nbbfx]/[bbx]比在选自以下的至少一个时间段内完成：每分钟、每小时、每天早晨、每天正午、每夜、每半夜、每天、每周、每月、每半年、每年、每两年，包括中间的时间周期和范围。
[0176]
6.如实施例1所述的方法，其中通过求解下式中的[bb2]实现关联：
[0177]
[nbbf2]/[bb2]＝r，
[0178]
或重排并替换r：
[0179]
[bb2]＝[bb1]/[nbbf1][nbbf2]。
[0180]
7.如实施例1所述的方法，其中所述第一时间段与所述第二时间段之间的差值是以下各项中的至少一项：从5分钟至10分钟、从20分钟至30分钟、从30分钟至40分钟、从40分钟至50分钟、从50分钟至60分钟、每小时、每天、每周、每月、每半年、每年，或每两年，包括中间值和范围。
[0181]
8.如实施例1所述的方法，其中在存储器中存储所述r比是用移动通信装置实现的。
[0182]
9.如实施例1所述的方法，其中所述非血体液是唾液，并且所述周期性地校准在选
自每小时、每天、每周、每月、每半年、每年或其组合的至少一个间隔的时段，包括中间值和范围内完成。
[0183]
10.如实施例1所述的方法，进一步包含应用机器学习(ml)以通过人工比较以下中的至少一个来提高所述方法的准确度：初步结果；二次结果；或三次结果，其由具有分离的样品沉积区域的装置和相关的成像装置或分析物浓度测量设备产生。
[0184]
11.一种将非血体液中的葡萄糖浓度与个体血液中的葡萄糖相关联的方法，包含：
[0185]
测量在第一时间段内非血体液中的葡萄糖并测量同一个体的血液中的葡萄糖以建立[gnbf1]/[gb1]比(r)，其中[gnbf1]是第一时间段内非血体液中的葡萄糖浓度，[gb1]为第一时间段内个体血液中的葡萄糖浓度；
[0186]
将[gnbf1]/[gb1]比存储在存储器中；
[0187]
测量在第二时间段内非血体液中的葡萄糖浓度，其中[gnbf2]为第二时间段内非血体液中的葡萄糖浓度；以及
[0188]
将所测量的[gnbf2]与[gnbf1]/[gb1]比相关联以产生在第二时间段内在所述个体血液中的相关的估计[bb2]葡萄糖浓度。
[0189]
12.如实施例11所述的方法，其中所述非血体液是唾液。
[0190]
13.如实施例11所述的方法，进一步包含周期性地校准[gnbf1]/[gb1]比以建立重新校准的[gnbfx]/[gbx]比，其中x是第n个时间段，其中n是3到100。
[0191]
14.如实施例13所述的方法，其中建立重新校准的[gnbfx]/[gbx]比在选自以下的至少一个时间段内完成：每分钟、每小时、每天早晨、每天正午、每夜、每半夜、每天、每周、每月、每半年、每年、每两年，包括中间的时间周期和范围。
[0192]
15.如实施例11所述的方法，其中将所述[gnbf1]/[gb1]比存储在存储器中是在移动通信装置中完成的并且通过所述移动通信装置中的软件进行分析。
[0193]
16.一种装置，包含：
[0194]
用于沉积第一样品的第一区域；和
[0195]
用于沉积第二样品的第二区域，
[0196]
其中所述第一和第二区域在同一表面上物理分离并流体隔离。
[0197]
17.如实施例16所述的装置，其中所述第一和第二区域由空间分离。
[0198]
18.如实施例16所述的装置，其中所述第一和所述第二区域被可见屏障分离。
[0199]
19.如实施例16所述的装置，其中所述第一样品是唾液，并且所述第二样品是血液。
[0200]
20.如实施例16所述的装置，进一步包括以下各项中的至少一项：用于沉积第三样品的第三区域、用于沉积第四样品的第四区域、用于沉积第五样品的第五区域，或用于沉积第六样品的第六区域。
[0201]
装置示例
[0202]
用于本发明的装置的示例包括但不限于：imost、qmax样品保持器，以及在chou和ding的美国专利第10,324,009号中描述的其它装置。
[0203]
在某些实施例中，样品形成薄层，其中细胞是彼此没有显著重叠的单层。
[0204]
在某些实施例中，样品保持器具有刻度标记物、图像标记物、监测标记物等。
[0205]
在某些实施例中，样品保持器包含具有间隔件/柱的x-板，所述间隔件/柱具有基
本上均匀的高度和几乎均匀的横截面，所述横截面彼此分开一致的、限定的距离。
[0206]
例如，x-板为175um厚的pmma，具有30
×
40um柱尺寸，10um柱高度和80um空间间距的柱阵列，或者imost q卡包含175um厚的pmma的x板，具有40um直径柱尺寸，10um柱高度和120um空间间距的柱阵列。
[0207]
在某些实施例中，样品保持器使用样品的横向流。样品负载在一个位置并且在两个板之间横向流动到另一个位置。
[0208]
i.板
[0209]
在本发明中，通常，crof板由任何材料制成，所述材料(i)能够与间隔件一起用于调节部分或全部体积的样品的厚度，和(ii)对样品、测定或板打算实现的目标没有显著的不利影响。然而，在某些实施例中，特定材料(因此它们的特性)被用于该板以实现某些目的。
[0210]
在某些实施例中，对于以下参数中的每一个，两个板具有相同或不同的参数：板材料、板厚度、板形状、板面积、板柔性、板表面性质和板光学透明度。
[0211]
(i)板材料。所述板由单一材料、复合材料、多种材料、多层材料、合金或其组合制成。用于板的每种材料是无机材料、有机材料或混合物，其中材料的示例在mat-1和mat-2的段落中给出。
[0212]
mat-1：用于板的无机材料包括但不限于玻璃、石英、氧化物、二氧化硅、氮化硅、氧化铪(hfo)、氧化铝(aio)、半导体：(硅、gaas、gan等)、金属(例如，金、银、铜、铝、ti、ni等)、陶瓷，或其任何组合。
[0213]
mat-2：用于间隔件的有机材料包括但不限于聚合物(例如塑料)或无定形有机材料。用于间隔件的聚合物材料包括但不限于丙烯酸酯聚合物、乙烯基聚合物、烯烃聚合物、纤维素聚合物、非纤维素聚合物、聚酯聚合物、尼龙、环烯烃共聚物(coc)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚碳酸酯(pc)、环烯烃聚合物(cop)、液晶聚合物(lcp)、聚酰胺(pa)、聚乙烯(pe)、聚酰亚胺(pi)、聚丙烯(pp)、聚苯醚(ppe)、聚苯乙烯(ps)、聚甲醛(pom)、聚醚醚酮(peek)、聚醚砜(pes)、聚邻苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚氯乙烯(pvc)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、氟化乙烯丙烯(fep)、全氟烷氧基烷烃(pfa)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、橡胶或其任何组合。
[0214]
在某些实施例中，板各自独立地由玻璃、塑料、陶瓷和金属中的至少一种制成。在某些实施例中，每个板独立地包括玻璃、塑料、陶瓷和金属中的至少一种。
[0215]
在某些实施例中，一个板在横向面积、厚度、形状、材料或表面处理方面不同于另一个板。在某些实施例中，一个板在横向面积、厚度、形状、材料或表面处理方面与另一个板相同。
[0216]
用于板的材料是刚性的、柔性的或两者之间的任何柔性。刚性(例如，刚性)或柔性与用于使板进入闭合构造的给定按压力有关。
[0217]
在某些实施例中，刚性或柔性板的选择由在闭合构造下控制样品厚度的均匀性的要求确定。
[0218]
在某些实施例中，两个板中的至少一个是透明的(对光)。在某些实施例中，一个板或两个板的至少一部分或几个部分是透明的。在某些实施例中，所述板是不透明的。
[0219]
(ii)板厚度。在某些实施例中，板中的至少一个的平均厚度是2nm或以下、10nm或
以下、100nm或以下、500nm或以下、1000nm或以下、2um(微米)或以下、5um或以下、10um或以下、20um或以下、50um或以下、100um或以下、150um或以下、200um或以下、300um或以下、500um或以下、800um或以下、1mm(毫米)或以下、2mm或以下、3mm或以下，或任何两个值之间的范围。
[0220]
在某些实施例中，至少一个板的平均厚度是至多3mm(毫米)、至多5mm、至多10mm、至多20mm、至多50mm、至多100mm、至多500mm，或任何两个值之间的范围。
[0221]
在某些实施例中，板中的任一个的厚度在整个板上是不均匀的。在不同位置使用不同的板厚可用于控制板弯曲、折叠、样品厚度调节等。
[0222]
(iii)板形状和面积。通常，板可以具有任何形状，只要该形状允许样品的压缩开放流和样品厚度的调节。然而，在某些实施例中，特定形状可以是有利的。板的形状可以是圆形、椭圆形、矩形、三角形、多边形、环形或这些形状的任何叠加。
[0223]
在某些实施例中，这两个板可以具有相同的尺寸或形状，或不同的尺寸或形状。板的面积取决于应用。所述板的面积为至多1mm2(平方毫米)、至多10mm2、至多100mm2、至多1cm2(平方厘米)、至多5cm2、至多10cm2、至多100cm2、至多500cm2、至多1000cm2、至多5000cm2、至多10,000cm2，或超过10,000cm2，或任何两个值之间的范围。板的形状可以是矩形、方形、圆形等。
[0224]
在某些实施例中，所述板中的至少一个是具有宽度、厚度和长度的带(或条带)的形式。宽度是至多0.1cm(厘米)、至多0.5cm、至多1cm、至多5cm、至多10cm、至多50cm、至多100cm、至多500cm、至多1000cm，或任何两个值之间的范围。长度可以是需要的长度。带可以卷成卷。
[0225]
(iv)板表面平坦度。在许多实施例中，这些板的内表面是平坦的或显著平坦的、平面的。在某些实施例中，这两个内表面在该闭合构造下是彼此平行的。平坦的内表面有助于通过在闭合构造下简单地使用预定间隔件高度来量化和/或控制样品厚度。对于板的非平坦内表面，不仅需要知道间隔件高度，还需要知道内表面的确切拓扑，以量化和/或控制闭合构造下的样品厚度。为了知道表面拓扑，需要额外的测量和/或校正，这可能是复杂的、耗时的和昂贵的。
[0226]
板表面的平坦度相对于最终样品厚度(最终厚度是在闭合构造下的厚度)，并且通常由术语“相对表面平坦度”来表征，术语“相对表面平坦度”是板表面平坦度变化与最终样品厚度的比。
[0227]
在某些实施例中，相对表面小于0.01％、0.1％、小于0.5％、小于1％、小于2％、小于5％、小于10％、小于20％、小于30％、小于50％、小于70％、小于80％、小于100％，或这些值中任何两个之间的范围。
[0228]
(v)板表面平行度。在某些实施例中，板的两个表面显著地彼此平行。在某些实施例中，板的两个表面彼此不平行。
[0229]
(vi)板柔性。在某些实施例中，板在crof工艺的压缩下是柔性的。在某些实施例中，两个板在crof工艺的压缩下是柔性的。在某些实施例中，一个板是刚性的并且另一个板在crof工艺的压缩下是柔性的。在某些实施例中，两个板都是刚性的。在某些实施例中，两个板都是柔性的但具有不同的柔性。
[0230]
(vii)平板光学透明度。在某些实施例中，板是光学透明的。在某些实施例中，两个
板都是光学透明的。在某些实施例中，一个板是光学透明的，而另一个板是不透明的。在某些实施例中，两个板都是不透明的。在某些实施例中，两个板都是光学透明的但具有不同的光学透明度。板的光学透明度可以指板的部分或整个区域。
[0231]
(viii)表面润湿特性。在某些实施例中，板具有润湿(例如接触角小于90度)样品、转移液体或两者的内表面。在某些实施例中，两个板都具有润湿样品、转移液体或两者的内表面；具有相同或不同的润湿性。在某些实施例中，板具有润湿样品、转移液体或两者的内表面；并且另一个板具有不润湿的内表面(例如，等于或大于90度的接触角)。板内表面的润湿可以指板的一部分或整个区域。
[0232]
在某些实施例中，板的内表面具有其它纳米结构或微结构以在crof中控制样品的横向流动。纳米结构或微结构包括但不限于通道、泵等。纳米和微结构也用于控制内表面的润湿性能。
[0233]
ii.间隔件
[0234]
(i)间隔件功能。在本发明中，这些间隔件被配置为具有以下功能和特性中的一种或任何组合：这些间隔件被配置为(1)与这些板一起控制该样品的厚度或该样品的相关体积(优选地，该厚度控制在相关区域上是精确的，或均匀的或两者)；(2)使样品在板表面上具有压缩的调节开放流(crof)；(3)在给定的样品面积(体积)中不占用显著的表面积(体积)；(4)减少或增加样品中颗粒或分析物的沉降效应；(5)改变和/或控制所述板的内表面的润湿性质；(6)识别板的位置、尺寸刻度，和/或与板相关的信息，或(7)进行上述的任何组合。
[0235]
(ii)间隔件结构和形状。为了实现期望的样品厚度减小和控制，在某些实施例中，间隔件固定在其相应的板上。通常，间隔件可以具有任何形状，只要间隔件能够在crof工艺中调节样品厚度，但是优选某些形状以实现某些功能，例如更好的均匀性、在按压中过冲更小等。
[0236]
这些间隔件是单个间隔件或多个间隔件。(例如阵列)。多个间隔件的某些实施例是间隔件(例如柱)的阵列，其中间隔距离是周期性的或非周期性的，或者在板的某些区域中是周期性的或非周期性的，或者在板的不同区域中具有不同的距离。
[0237]
存在两种类型的间隔件：开放间隔件和封闭间隔件。开放间隔件是允许样品流过间隔件的间隔件(例如样品在间隔件周围流动并通过间隔件。例如作为间隔件的柱)，封闭间隔件是阻止样品流动的间隔件(例如样品不能流过间隔件。例如环形间隔件，并且样品在环内)。两种类型的间隔件使用它们的高度以在闭合构造下调整最终样品厚度。
[0238]
在某些实施例中，间隔件仅是开放间隔件。在某些实施例中，间隔件仅是封闭间隔件。在某些实施例中，间隔件是开放间隔件和封闭间隔件的组合。
[0239]
术语“柱间隔件”意指间隔件具有柱形状并且柱形状可以是指具有允许样品在压缩开放流动期间围绕其流动的高度和横向形状的物体。
[0240]
在某些实施例中，柱状间隔件的横向形状是从以下组中选择的形状：(i)圆形、椭圆形、矩形、三角形、多边形、环形、星形、字母形状(例如l形、c形、字母从a到z)、数字形状(例如，如0、1、2、3、4、...到9的形状)；(ii)具有至少一个圆角的组(i)中的形状；(iii)具有锯齿形或粗糙边缘的来自组(i)的形状；和(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何叠加。对于多个间隔件，不同的间隔件可具有不同的横向形状和尺寸以及与相邻间隔件的不同距离。
[0241]
在某些实施例中，间隔件可以是和/或可以包括柱、列、珠、球和/或其他合适的几何形状。间隔件的横向形状和尺寸(例如，横向于相应的板表面)可以是任何，除了在某些实施例中的以下限制：(i)间隔件几何形状不会引起测量样品厚度和体积的显著误差；或(ii)间隔件几何形状将不阻止样品在板之间的流出(例如，其不处于封闭形式)。但在某些实施例中，它们需要一些间隔件作为闭合的间隔件来限制样品流动。
[0242]
在某些实施例中，间隔件的形状具有圆角。例如，矩形间隔件具有一个、几个或所有圆角(像圆而不是90度角)。圆角通常使间隔件的制造更容易，并且在一些情况下对生物材料的损坏更小。
[0243]
柱的侧壁在侧壁的不同部分可以是直的、弯曲的、倾斜的或不同形状的。在某些实施例中，间隔件是各种横向形状、侧壁和柱高与柱横向面积比的柱。在优选实施例中，间隔件具有用于允许开放流动的柱的形状。
[0244]
(iii)间隔件材料。在本发明中，间隔件通常由能够与两个板一起用于调节样品的相关体积的厚度的任何材料制成。在某些实施例中，用于间隔件的材料不同于用于板的材料。在某些实施例中，用于空间的材料至少与用于至少一个板的材料的一部分相同。
[0245]
间隔件由单一材料、复合材料、多种材料、多层材料、合金，或其组合制成。用于间隔件的每种材料是无机材料、有机材料或混合物，其中材料的示例在mat-1和mat-2的段落中给出。在优选实施例中，间隔件由与crof中使用的板相同的材料制成。
[0246]
(iv)间隔件机械强度和柔性。在某些实施例中，间隔件的机械强度足够强，使得在压缩期间和在板的闭合构造下，间隔件的高度与板处于开放构造时的高度相同或显著相同。在某些实施例中，可以表征和预先确定开放构造与闭合构造之间的间隔件的差异。
[0247]
用于这些间隔件的材料是刚性的、柔性的或两者之间的任何柔性。该刚性与用于使板进入闭合构造的给定按压力有关：如果该空间在按压力下在其高度上不变形大于1％，则该间隔件材料被认为是刚性的，否则是柔性的。当间隔件由柔性材料制成时，仍可根据按压力和间隔件的机械特性来预定处于闭合构造的最终样品厚度。
[0248]
(v)样品内部间隔件。为了实现减小和控制所希望的样品厚度，特别是为了实现良好的样品厚度均匀性，在某些实施例中，将这些间隔件放置在该样品内部，或该样品的相关体积内。在某些实施例中，在样品或样品的相关体积内存在一个或多个间隔件，具有适当的间隔距离。在某些实施例中，间隔件中的至少一个在样品内，间隔件中的至少两个在样品内或样品的相关体积内，或至少“n”个间隔件在样品内或样品的相关体积内，其中“n”可通过样品厚度均匀性或crof期间所需的样品流动特性来确定。
[0249]
(vi)间隔件高度。在某些实施例中，所有间隔件具有相同的预定高度。在某些实施例中，间隔件具有不同的预定高度。在某些实施例中，间隔件可以被分成组或区域，其中每个组或区域具有其自己的间隔件高度。并且在某些实施例中，间隔件的预定高度是间隔件的平均高度。在某些实施例中，间隔件具有大致相同的高度。在某些实施例中，某个百分比数量的间隔件具有相同的高度。
[0250]
通过期望的调整的最终样品厚度和剩余样品厚度来选择间隔件的高度。间隔件高度(预定间隔件高度)和/或样品厚度为3nm或以下、10nm或以下、50nm或以下、100nm或以下、200nm或以下、500nm或以下、800nm或以下、1000nm或以下、1um或以下、2um或以下、3um或以下、5um或以下、10um或以下、20um或以下、30um或以下、50um或以下、100um或以下、150um或
以下、200um或以下、300um或以下、500um或以下、800um或以下、1mm或以下、2mm或以下、4mm或以下，或这些值中的任何两个之间的范围。
[0251]
间隔件高度和/或样品厚度在一个优选实施例中在1nm到100nm之间，在另一优选实施例中在100nm到500nm之间，在单独的优选实施例中在500nm到1000nm之间，在另一优选实施例中在1um(例如1000nm)到2um之间，在单独的优选实施例中在2um到3um之间，在另一优选实施例中在3um到5um之间，在单独的优选实施例中在5um到10um之间，在另一优选实施例中在10um到50um之间，在单独的优选实施例中在50um到100um之间。
[0252]
在某些实施例中，间隔件高度和/或样品厚度(i)等于或略大于分析物的最小尺寸，或(ii)等于或略大于分析物的最大尺寸。“稍大”意指它大大约1％至5％并且是两个值之间的任何数。
[0253]
在某些实施例中，间隔件高度和/或样品厚度大于分析物的最小尺寸(例如，分析物具有各向异性形状)，但小于分析物的最大尺寸。
[0254]
例如，红细胞具有圆盘形状，其最小尺寸为2um(盘厚度)且最大尺寸为11um(盘直径)。在本发明的一个实施例中，选择间隔件使得相关区域中板的内表面间距在一个实施例中是2um(等于最小尺寸)，在另一个实施例中是2.2um，或在其它实施例中是3(比最小尺寸大50％)，但小于红细胞的最大尺寸。这种实施例在血细胞计数方面具有某些优点。在一个实施例中，对于红细胞计数，通过使内表面间距为2um或3um以及两个值之间的任何数字，将未稀释的全血样品限定在该间距中，平均而言，每个红细胞(rbc)不与其它红细胞重叠，从而允许视觉上准确地计数红细胞。(rbc之间的重叠过多可能导致计数的严重错误)。
[0255]
在本发明中，在某些实施例中，使用板和间隔件不仅调节样品的厚度，而且当板处于闭合构造时调节样品中分析物/实体的方向和/或表面密度。当板处于闭合构造时，较薄的样品厚度给出每表面积较少的分析物/实体(例如较小的表面浓度)。
[0256]
(vii)间隔件横向尺寸。对于开放间隔件，横向尺寸可以通过其在x和y两个正交方向上的横向尺寸(有时称为宽度)来表征。间隔件在每个方向上的横向尺寸相同或不同。在某些实施例中，每个方向(x或y)的横向尺寸是...。
[0257]
在某些实施例中，x方向与y方向的横向尺寸的比是1、1.5、2、5、10、100、500、1000、10,000，或任何两个值之间的范围。在某些实施例中，使用不同的比调节样品流动方向；比越大，流动沿一个方向(较大的尺寸方向)。
[0258]
在某些实施例中，间隔件在x和y方向上的不同横向尺寸被用作(a)使用间隔件作为刻度标记来指示板的方向，(b)使用间隔件在优选方向上产生更多的样品流，或两者。
[0259]
在优选实施例中，周期、宽度和高度。
[0260]
在某些实施例中，所有间隔件具有相同的形状和尺寸。在某些实施例中，间隔件中的每一者具有不同的横向尺寸。
[0261]
对于封闭的间隔件，在某些实施例中，基于被封闭间隔件封闭的样品的总体积选择内部横向形状和尺寸，其中体积尺寸已经在本公开中描述；并且在某些实施例中，该外侧形状和尺寸是基于支撑该液体抵靠该间隔件的压力所需的强度以及按压这些板的压缩压力来选择的。
[0262]
(viii)柱间隔件的高度与平均横向尺寸的纵横比。在某些实施例中，柱间隔件的高度与平均横向尺寸的纵横比是100,000、10,000、1,000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、
0.0001、0.00001或任何两个值之间的范围。
[0263]
(ix)间隔件高度精度。间隔件高度应精确控制。间隔件的相对精度(例如偏差与期望的间隔件高度的比)为0.001％以下、0.01％以下、0.1％以下；0.5％或以下、1％或以下、2％或以下、5％或以下、8％或以下、10％或以下、15％或以下、20％或以下、30％或以下、40％或以下、50％或以下、60％或以下、70％或以下、80％或以下、90％或以下、99.9％或以下，或任何两个值之间的范围。
[0264]
(x)间隔距离。间隔件可以是板上或样品的相关区域中的单个间隔件或多个间隔件。在某些实施例中，板上的间隔件以阵列形式配置和/或布置，且阵列是周期性、非周期性阵列或在板的一些位置中是周期性的，而在其它位置是非周期性的。
[0265]
在某些实施例中，间隔件的周期性阵列具有方形、矩形、三角形、六边形、多边形或其任何组合的点阵，其中组合意味着板的不同位置具有不同的间隔件点阵。
[0266]
在某些实施例中，间隔件阵列的间隔距离在阵列的至少一个方向上是周期性的(例如，均匀的间隔距离)。在某些实施例中，所述间隔距离被配置为在闭合构造下改进所述板间距之间的均匀性。
[0267]
相邻间隔件之间的距离(即，间隔距离)是1um或以下、5um或以下、10um或以下、20um或以下、30um或以下、40um或以下、50um或以下、60um或以下、70um或以下、80um或以下、90um或以下、100um或以下、200um或以下、300um或以下、400um或以下，或任何两个值之间的范围。
[0268]
在某些实施例中，该间隔距离是400或以下、500或以下、1mm或以下、2mm或以下、3mm或以下、5mm或以下、7mm或以下、10mm或以下，或这些值之间的任何范围。在某些实施例中，间隔距离是10mm或以下、20mm或以下、30mm或以下、50mm或以下、70mm或以下、100mm或以下，或这些值之间的任何范围。
[0269]
选择相邻间隔件之间的距离(例如间隔距离)，使得对于板和样品的给定性质，在板的闭合构造下，在某些实施例中，两个相邻间隔件之间的样品厚度变化为至多0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、50％、80％，或这些值之间的任何范围；或在某些实施例中，至多80％、100％、200％、400％，或任何两个值之间的范围。
[0270]
显然，为了在两个相邻间隔件之间保持给定的样品厚度变化，当使用更柔性的板时，需要更靠近的间隔距离。
[0271]
指定间隔距离的准确度。
[0272]
在优选实施例中，间隔件是周期性方形阵列，其中间隔件是高度为2至4um，平均横向尺寸为5至20um并且间隔距离为1um至100um的柱。
[0273]
在优选实施例中，间隔件是周期性方形阵列，其中间隔件是高度为2至4um，平均横向尺寸为5至20um并且间隔距离为100um至250um的柱。
[0274]
在优选实施例中，间隔件是周期性方形阵列，其中间隔件是高度为4至50um，平均横向尺寸为5至20um并且间隔距离为1um至100um的柱。
[0275]
在优选实施例中，间隔件是周期性方形阵列，其中间隔件是高度为4至50um，平均横向尺寸为5至20um并且间隔距离为100um至250um的柱。
[0276]
间隔阵列的周期在一个优选实施例中在1nm到100nm之间，在另一个优选实施例中在100nm到500nm之间，在单独的优选实施例中在500nm到1000nm之间，在另一个优选实施例
中在1um(例如1000nm)到2um之间，在单独的优选实施例中在2um到3um之间，在另一个优选实施例中在3um到5um之间，在单独的优选实施例中在5um到10um之间，并且在另一个优选实施例中在10um到50um之间，在单独的优选实施例中在50um到100um之间，在单独的优选实施例中在100um到175um之间，并且在单独的优选实施例中在175um到300um之间。
[0277]
(xi)间隔件密度。间隔件以大于1个/um2、大于1个/10um2、大于1个/100um2、大于1个/500um2、大于1个/1000um2、大于1个/5000um2、大于1个/0.01mm2、大于1个/0.1mm2、大于1个/1mm2、大于1个/5mm2、大于1个/10mm2、大于1个/100mm2、大于1个/1000mm2、大于1个/10000mm2或在任何两个值之间的范围内的表面密度布置在相应的板上。
[0278]
(3)这些间隔件被配置为不占用给定样品区域(体积)中的显著表区域(体积)；
[0279]
(xii)间隔件体积与样品体积的比。在许多实施例中，控制间隔件体积(例如，间隔件的体积)与样品体积(例如，样品的体积)的比，和/或在样品的相关体积内的间隔件的体积与样品的相关体积的比，以实现某些优点。优点包括但不限于样品厚度控制的均匀性、分析物的均匀性、样品流动性质(例如流速、流动方向等)。
[0280]
在某些实施例中，间隔件体积r)与样品体积的比，和/或在样品的相关体积内的间隔件的体积与样品的相关体积的比小于100％、至多99％、至多70％、至多50％、至多30％、至多10％、至多5％、至多3％、至多1％、至多0.1％、至多0.01％、至多0.001％，或这些值之间的任何范围。
[0281]
(xiii)固定至板的间隔件。在本发明中起关键作用的间隔距离和间隔件的方向优选地在将板从开放构造带到闭合构造的过程期间保持，和/或优选地在从开放构造到闭合构造的过程之前预先确定。
[0282]
在本公开的某些实施例中，在将这些板带到闭合构造之前将间隔件固定在这些板之一上。术语“间隔件与其相应的板固定”意指间隔件附接到板并且在板的使用期间保持附接。“间隔件与其相应的板固定在一起”的示例是间隔件由板的一件材料整体地制成，并且间隔件相对于板表面的位置不改变。“间隔件与其相应的板不固定”的示例是间隔件通过粘合剂粘合到板上，但是在板的使用期间，粘合剂不能将间隔件保持在其在板表面上的原始位置(例如，间隔件移动离开其在板表面上的原始位置)。
[0283]
在某些实施例中，这些间隔件中的至少一个被固定到其相应的板上。在某些实施例中，两个间隔件固定到其相应的板。在某些实施例中，间隔件的大部分与其相应的板固定。在某些实施例中，所有间隔件与其相应的板固定。
[0284]
在某些实施例中，间隔件整体地固定到板。
[0285]
在某些实施例中，间隔件通过以下方法和/或配置中的一者或任何组合固定到其相应板：附接到、结合到、熔合到、压印和蚀刻。
[0286]
术语“压印”是指通过压印(例如，压纹)一片材料以在板表面上形成间隔件来整体地固定间隔件和板。材料可以是单层材料或多层材料。
[0287]
术语“蚀刻的”意指通过蚀刻一片材料以在板表面上形成间隔件来整体地固定间隔件和板。材料可以是单层材料或多层材料。
[0288]
术语“熔合到”是指间隔件和板通过将间隔件和板附接在一起而整体地固定，间隔件和板的原始材料彼此熔合，并且在熔合之后在两种材料之间存在清晰的材料边界。
[0289]
术语“结合到”意指间隔件和板通过粘合结合间隔件和板而整体地固定。
[0290]
术语“附接到”意指间隔件和板连接在一起。
[0291]
在某些实施例中，间隔件和板由相同的材料制成。在其他实施例中，间隔件和板由不同的材料制成。在其他实施例中，间隔件和板形成为一体。在另一实施例中，间隔件具有固定到其相应板的一端，同时该端是开放的以容纳两个板的不同构造。
[0292]
在其它实施例中，间隔件中的每一者独立地附接到、结合到、熔合到、压印到和蚀刻到相应板中的至少一者。术语“独立地”意指通过相同或不同的方法将一个间隔件与其相应的板固定，所述方法选自在相应的板中附接、结合、熔合、压印和蚀刻的方法。
[0293]
在某些实施例中，至少两个间隔件之间的距离是预定的(“预定间隔距离”意指当使用者使用板时已知该距离)。
[0294]
在本文所述的所有方法和装置的某些实施例中，除固定间隔件之外还存在额外间隔件。
[0295]
(xiv)特定样品厚度。在本发明中，观察到通过使用较小的板间距(对于给定的样品面积)或较大的样品面积(对于给定的板间距)或两者可以获得较大的板保持力(例如将两个板保持在一起的力)。
[0296]
在某些实施例中，这些板中的至少一个在包围该相关区域的区域中是透明的，每个板具有被配置为用于在该闭合构造中接触该样品的内表面；在闭合构造中，这些板的内表面是基本上彼此平行的；除了具有间隔件的位置之外，板的内表面基本上是平面的；或其任何组合。
[0297]
可使用光刻、蚀刻、压纹(纳米压印)、沉积、剥离、熔合或其组合以各种方式在板上制造间隔件。在某些实施例中，间隔件直接压纹或压印在板上。在某些实施例中，间隔件压印到沉积在板上的材料(例如塑料)中。在某些实施例中，通过直接压纹crof板的表面来制造间隔件。纳米压印可以使用辊压印器通过辊对辊技术进行，或者辊对平面纳米压印。这种方法具有巨大的经济优势，因此降低了成本。
[0298]
在某些实施例中，间隔件沉积在板上。沉积可以是蒸发、粘贴或剥离。在粘贴中，首先在载体上制造间隔件，然后将间隔件从载体转移到板。在剥离中，首先将可移除材料沉积在板上并且在材料中产生孔；孔底使板表面暴露，然后将间隔件材料沉积到孔中，之后去除可去除材料，仅在板表面上留下间隔件。在某些实施例中，沉积在板上的间隔件与板熔合。在某些实施例中，间隔件和板在单一工艺中制造。该单一过程包括压印(例如，压纹、模制)或合成。
[0299]
在某些实施例中，间隔件中的至少两个通过不同制造方法固定到相应板，且任选地其中所述不同制造方法包括沉积、结合、熔合、压印和蚀刻中的至少一个。
[0300]
在某些实施例中，间隔件中的一个或多个通过结合、熔合、压印或蚀刻或其任何组合的制造方法固定到相应板。
[0301]
在某些实施例中，用于在板上形成此类单片间隔件的制造方法包括结合、熔合、压印或蚀刻或其任何组合的方法。
[0302]
机器学习
[0303]
网络的详细信息在各种出版物中详细描述，包括2018年2月8日提交的国际申请(ia)第pct/us2018/017504号和2018年10月26日提交的第pct/us2018/057877号，出于所有目的将其各自通过引用并入本文。
[0304]
本发明的一个方面提供了用于分析物检测和定位的机器学习和深度学习的框架。机器学习算法是能够从数据中学习以从样品的图像中检测、分割和分类分析物的算法。机器学习的更严格定义是“如果其在t中的任务处的性能如由p所测量的那样随着经验e而改进的话，计算机程序被说成从关于某类任务t和性能测量p的经验e学习。”它探索能够学习和预测数据的算法-这种算法通过根据样品输入构建模型，通过进行数据驱动的预测或决策来克服静态的程序指令。
[0305]
深度学习是一种基于一组试图对数据中的高级抽象建模的算法的特定类型的机器学习。在简单的情况下，可能存在两组神经元：接收输入信号的神经元和发送输出信号的神经元。当输入层接收到输入时，它将输入的修改版本传递给下一层。在深度网络中，在输入和输出之间存在许多层(并且这些层不由神经元构成，但是这样想会有帮助)，从而允许算法使用由多个线性和非线性变换组成的多个处理层。
[0306]
本发明的一个方面是两种基于机器学习的分析物检测和定位方法。第一种方法是深度学习方法，第二种方法是深度学习和计算机视觉方法的组合。
[0307]
(i)深度学习方法。在第一种方法中，所公开的分析物检测和定位工作流程由训练和预测两个阶段组成。我们在以下段落中描述训练和预测阶段。
[0308]
(a)训练阶段
[0309]
在训练阶段，将带有注释的训练数据馈入卷积神经网络。卷积神经网络是用于处理数据的专用神经网络，其具有网格状、前馈和分层网络拓扑。数据的示例包括时间序列数据和图像数据，时间序列数据可以被认为是以规则的时间间隔进行采样的1d网格，图像数据可以被认为是像素的2d网格。卷积网络在实际应用中取得了成功。名称“卷积神经网络”表示该网络采用称为卷积的数学运算。卷积是一种专用的线性运算。卷积网络仅仅是神经网络，其使用卷积来代替其至少一层中的一般矩阵乘法。
[0310]
机器学习模型接收含有由成像器在样品保持qmax装置上获取的分析物的样品的一个或多个图像作为训练数据。为要测定的分析物注释训练数据，其中注释指示分析物是否在训练数据中以及它们在图像中的位置。注释可以以完全含有分析物或分析物中心位置的紧密边界框的形式进行。在后一种情况下，中心位置进一步转化为覆盖分析物的圆圈或点图中的高斯核。
[0311]
当训练数据量较大时，训练机器学习模型面临两个挑战：注释(通常由人完成)耗时，以及训练在计算上是昂贵的。为了克服这些挑战，可以将训练数据分割成小尺寸的补丁，然后注释并训练这些补丁或这些补丁的一部分。术语“机器学习”是指人工智能领域中的算法、系统和设备，其通常使用统计技术和从数据训练的人工神经网络而无需明确编程。
[0312]
经注释的图像被馈送到机器学习(ml)训练模块，并且机器学习模块中的模型训练器将根据训练数据(经注释的样品图像)来训练ml模型。将所述输入数据多次迭代地馈送到所述模型训练器，直到满足特定停止条件。ml训练模块的输出是ml模型-根据机器学习中的训练过程从数据建立的计算模型，该数据给予计算机独立地执行某些任务(例如，检测和分类物体)的能力。
[0313]
在预测(或推理)阶段期间由计算机应用经训练的机器学习模型。机器学习模型的示例有resnet、densenet等，由于其网络结构中连通层的深度，其也被称为“深度学习模型”。在某些实施例中，使用具有全卷积网络(fcn)的caffe库进行模型训练和预测，并且还
可以使用其他卷积神经网络架构和库，诸如tensorflow。
[0314]
训练阶段产生将在预测阶段中使用的模型。该模型可在预测阶段重复使用，用于测定输入。因此，计算单元只需要访问所产生的模型。它不需要访问训练数据，也不需要在计算单元上再次运行训练阶段。
[0315]
(b)预测阶段
[0316]
在预测/推理阶段，检测组件被应用于输入图像，并且输入图像被馈送到预加载有从训练阶段生成的训练模型的预测(推理)模块。预测阶段的输出可以是含有检测到的分析物及其中心位置的边界框，或指示每个分析物的位置的点图，或含有检测到的分析物的信息的热图。
[0317]
当预测阶段的输出是边界框的列表时，用于测定的样品的图像中的分析物的数量由检测到的边界框的数量来表征。当预测阶段的输出是点图时，用于测定的样品的图像中的分析物的数量通过点图的积分来表征。当预测的输出是热图时，定位组件用于识别位置，并且从该位置，检测的分析物的数量通过热图的条目来表征。
[0318]
定位算法的一个实施例是将热图值从最高值到最低值排序成一维有序列表。然后挑选具有最高值的像素，将该像素连同其相邻者一起从列表中除去。重复该过程以挑选列表中具有最高值的像素，直到从列表中除去了所有像素。
[0319]
在使用热图的检测组件中，输入图像连同从训练阶段生成的模型一起被馈送到卷积神经网络，并且检测阶段的输出是以热图的形式的像素级预测。热图可以具有与输入图像相同的尺寸，或者它可以是输入图像的按比例缩小的版本，并且它是定位组件的输入。我们公开了一种定位分析物中心的算法。主要思想是根据热图迭代地检测局部峰值。在峰被定位之后，我们计算围绕峰但具有较小值的局部区域。我们从热图中去除这个区域并且从剩余像素中找到下一个峰值。重复该过程，直到从热图中去除所有像素。
[0320]
在某些实施例中，本发明提供了定位算法以将热图值从最高值到最低值排序成一维有序列表。然后挑选具有最高值的像素，将该像素连同其相邻者一起从列表中除去。重复该过程以挑选列表中具有最高值的像素，直到从列表中除去了所有像素。
[0321][0322][0323]
排序后，热图为一维有序列表，其中热图值从高到低排序。每个热图值与其对应的
像素坐标相关联。热图中的第一项是具有最高值的项，即弹出(热图)函数的输出。创建一个盘，其中中心是具有最高热图值的盘的像素坐标。然后从热图中除去像素坐标位于盘内的所有热图值。该算法反复弹出当前热图中的最高值，除去其周围的盘，直到所有项目均从热图中移除。
[0324]
在有序列表热图中，每个项目都知道继续进行项目和以下项目。从有序列表中移除项目时，我们进行以下更改：
[0325]
·
假设移除项目是xr，其进行项目是xp，其后续项目是xf。
[0326]
·
对于进行项目xp，将其后续项目重新定义为移除项目中的后续项目。因此，xp的后续项目现在是xf。
[0327]
·
对于移除项目xr，取消定义其进行项目和后续项目，从有序列表中将其移除。
[0328]
·
对于后续项目xf，将其进行项目重新定义为移除项目中的进行项目。因此，xf的进行项目现在是xp。
[0329]
从有序列表中除去所有项目后，定位算法结束。集合基因座中元素的数目将是分析物的计数，位置信息是集合基因座中每个s的像素坐标。
[0330]
另一个实施例搜索局部峰值，该局部峰值不一定是具有最高热图值的峰值。为了检测每个局部峰值，我们从随机起始点开始，并搜索局部最大值。发现局部峰后，计算围绕峰但具有较小值的局部区域。我们从热图中去除这个区域并且从剩余像素中找到下一个峰值。重复该过程，直到从热图中去除所有像素。
[0331][0332][0333]
这是一种从s开始的广度优先搜索算法，具有访问点的条件有所改变：仅在heatmap[p]》0且heatmap[p]《＝heatmap[q]的情况下添加当前位置q的相邻者p以进行覆盖。因此，cover中的每一个像素都具有通向局部峰值s的非下降路径。
[0334]
(ii)深度学习和计算机视觉方法的混合。在第二种方法中，检测和定位通过计算机视觉算法实现，并且分类通过深度学习算法实现，其中计算机视觉算法检测并定位分析物的可能候选物，并且深度学习算法将每个可能候选物分类为真分析物和假分析物。所有真实分析物的位置(连同真实分析物的总计数)将被记录为输出。
[0335]
(a)检测。计算机视觉算法基于分析物的特性来检测可能的候选物，所述特性包括但不限于强度、颜色、尺寸、形状、分布等。预处理方案可以改善检测。预处理方案包括对比度增强、直方图调整、颜色增强、去噪声、平滑、散焦等。预处理后的输入图像送入检测器。检测器告诉分析物的可能候选者的存在并给出其位置的估计。检测可以基于分析物结构(例如边缘检测、线检测、圆检测等)、连通性(例如斑点检测、连接分量、轮廓检测等)、强度、颜色、形状等，使用诸如自适应阈值处理等方案。
[0336]
(b)定位。在检测之后，计算机视觉算法通过提供其边界或含有其的紧密边界框定位分析物的每个可能的候选物。这可以通过物体分割算法来实现，诸如自适应阈值处理、背景减除、漫水填充、均值偏移、流域等。通常，定位可与检测组合以产生检测结果以及分析物的每个可能候选物的位置。
[0337]
(c)分类。如卷积神经网络等深度学习算法，实现了最先进的视觉分类。我们采用深度学习算法对分析物的每种可能的候选物进行分类。各种卷积神经网络可用于分析物分类，例如vggnet、resnet,、mobilenet、densenet等。
[0338]
给定分析物的每个可能的候选者，深度学习算法通过神经元层经由卷积过滤器和非线性过滤器计算以提取将分析物与非分析物区分开的高级特征。一层完全卷积网络将高级特征结合到分类结果中，其告诉它是否是真实的分析物，或者是分析物的概率。
[0339]
此外，对于本领域技术人员来说，这两种方式可以进一步扩展和混合。通过仅对图像的预处理应用计算机视觉算法，深度学习和计算机视觉的混合可以变得更加面向深度学习，而检测、定位和分类中的每个步骤都基于专用的深度学习模型或者使用一个深度学习模型(例如retinanet)来进行一步检测和分类。