通过蛋白冠调制构建基于纳米颗粒的药物载体的方法发明领域1.本发明涉及生物
技术领域：
：，具体地，涉及用于构建基于纳米颗粒的药物载体的方法和基于纳米颗粒的药物递送系统，所述药物递送系统能够操控相应的蛋白冠，以对癌细胞进行特异性且有效的药物递送。
背景技术：
：：2.在过去的十年里，纳米技术为生物医学应用带来了巨大的希望，允许对治疗方法进行设计，以治疗各种各样的疾病，具有延长半衰期、改善生物分布、增加循环时间和许多其他益处。然而，许多基于纳米技术的疗法在理论上应该有效，但在实践中却不尽如人意。这主要是因为靶向转化细胞，或者将治疗剂送到需要的地方，是一项非常具有挑战性的任务。3.基于纳米颗粒的疗法缺乏成功的主要原因之一被称为蛋白冠。当药物通过静脉进入人体时，它接触的第一个生理区室是血液。血液中含有大量的数千种蛋白，其中很大一部分会吸附到药物上，并改变其基本上所有的合成特性，包括大小、分散性、聚集状态、生物靶向能力。这些蛋白赋予药物一个全新的生物学特性，不同于其最初的合成特性，这是细胞实际上最终看到的生物学特性。不受控制的蛋白纳米颗粒相互作用阻碍药物到达它应该到达的地方，导致治疗缺乏成功。4.基于纳米粒子的疗法缺乏成功的另一个原因，涉及制造药物载体相关的基本方法。纳米治疗剂由三个主要部分组成：碱基、传感器分子和有效载荷。研究人员通常只是基于理论知识来混合和匹配配置。没有真正系统的测试确定最佳配置。在大多数情况下，这会导致大量的时间、金钱和资源浪费在效果不如最初预期的配置上。5.药物载体开发的非系统方法，结合暴露于生理系统后蛋白的不受控制的吸附的问题，可以清楚地明白为什么基于纳米技术的治疗方法迄今为止尚未广泛实施。某些研究已经尝试使用诸如聚乙二醇化和两性离子纳米颗粒的技术来阻止蛋白吸附；然而，即使有这种轻微的“掩蔽效应”，仍然有一些蛋白吸附发生在载体表面，足以允许使与“生物学特性”相关的蛋白冠层形成，导致纳米粒子的合成特性被掩蔽。此外，到目前为止，除了使用理论知识来预测理想的载体构型，还没有开发任何系统化方法用于构建基于纳米颗粒的药物载体，以确保最理想的结果。6.本发明解决了上述两个问题。通过结合在纳米尺度上的高通量鸟枪法蛋白组学和生物信息学，本发明所提出的方法使人们能够构建基于纳米颗粒的药物载体，这些药物载体能够利用蛋白冠作为优势而不是劣势，以系统的方式控制纳米颗粒-蛋白相互作用，以允许蛋白冠将所得复合物运输到其预期的生物位点。最初，评估了蛋白冠对于一个库的具有不同物理化学性质的石墨烯或氧化石墨烯衍生物的性质。随后，将一种新型数据挖掘算法用于寻找可能的蛋白，以募集到每种石墨烯衍生物的蛋白冠上，从而靶向指定生物位点的特定细胞。最后，设计了核酸-氧化石墨烯-抗体复合物，用于识别这些靶蛋白并利用其生理载体功能，然后对其在体外基因转染、细胞活力和细胞摄取方面的性能进行评估。总的来说，实现了一个基因载体开发的全新工作流程，并对其整体有效性进行了评估。所提出的工作流程在其应用中是通用的，因为其可以应用于任何纳米粒子库。这种新型、简化的过程需要4天来完成，并且相对便宜，其中得到的载体优于细胞内药物递送的常规黄金标准。技术实现要素：7.本发明包括用于构建基于纳米颗粒的药物载体的方法，所述药物载体能够利用内源性蛋白(即人血清中天然的蛋白)的生理载体功能，用于癌细胞的位点特异性靶向。该方法包括首先将合成纳米粒子库的成分暴露于10％人血清的pbs溶液，然后在37摄氏度下培养90分钟，然后重复离心以分离和洗涤蛋白冠层。在蛋白冠分离之后，使用纳米级液相色谱串联质谱(纳米lc-ms)分析每个蛋白冠分离物，用于描绘每个纳米颗粒制剂上吸附的蛋白的特性和数量。然后，将对应于每个纳米颗粒制剂的蛋白输入到计算机算法中，在该算法中，使用一种新的生物信息学筛选策略，对吸附到每个纳米颗粒制剂的数百种蛋白基于其被癌细胞中过表达的细胞受体识别的能力进行排序。然后，通过常规的edc-nhs交联，将针对输出的“最佳”蛋白冠蛋白的抗体功能化到输出的“最佳”纳米颗粒制剂上。然后将由针对bcl-2癌基因的sirna组成的治疗有效载荷通过被动吸附经由简单的混合过程吸附到纳米颗粒制剂上。产生的缀合物现在能够将有益的内源性蛋白募集到蛋白冠层中，促进癌细胞的位点特异性靶向，将相关的蛋白冠转化为优势而不是劣势。该方法本身需要四天来完成，并且可以应用于任何纳米颗粒类型和任何治疗有效载荷，只要有效载荷和纳米颗粒之间的相互作用机制是被动吸附即可。根据设计的算法中的输入参数，也可以将多种疾病作为目标。8.具体而言，在一个方面，本发明涉及一种构建基于纳米颗粒的药物载体的方法，该药物载体用于通过以下的组合操控纳米颗粒蛋白冠来进行药物的受控的细胞内给药：a.针对由纳米颗粒制剂制备的蛋白冠提取物的纳米级液相色谱串联质谱分析；b.高通量数据挖掘，用于确定与所述蛋白冠提取物相关的数万种蛋白-蛋白相互作用，从而确定所述蛋白冠蛋白中的哪种具有最理想地内源募集以增加细胞特异性摄取的可能性；c.抗体缀合，其中通过所述算法确定抗所述理想蛋白冠蛋白的抗体；d.将药物掺入所述纳米颗粒-抗体缀合物中。9.在一个实施方案中，其中所述药物由sirna治疗剂组成。10.在一个实施方案中，其中所述sirna是针对bcl-2癌基因的。11.在一个实施方案中，其中所述纳米颗粒制剂由氧化石墨烯或石墨烯的衍生物组成。12.在一个实施例中，其中所述高通量数据挖掘是由通过现有基因本体论go、蛋白-蛋白相互作用和mrna转录组数据库进行挖掘、写入主mysql数据库的python脚本的组合来实现的。13.在一个实施方案中，其中所述抗体由单克隆抗体组成。14.在一个实施方案中，其中所述细胞对应于癌细胞。15.在另一方面，本文提供了一种用于构建基于纳米颗粒的药物载体的方法，所述药物载体用于通过以下的组合操控纳米颗粒蛋白冠来进行药物的受控的细胞内给药：a.在设定的培养时间内将纳米颗粒制剂暴露于按照归一化的表面积(纳米颗粒的表面积)与体积(培养体积)比暴露于人血清，然后进行蛋白冠分离以进行纳米lc-ms/ms分析；b.在一系列预先存在的蛋白组学数据库上部署一系列脚本，以用于区分用于内源性募集的理想蛋白冠蛋白；c.采用edc-nhs交联将针对理想蛋白冠蛋白的抗体缀合到理想纳米颗粒制剂上；d.采用被动吸附以将sirna缀合到纳米颗粒表面。16.在一个实施方案中，其中所述表面积与体积比设定为1cm2/ul至10cm2/ul。17.在一个实施方案中，其中暴露于人血清的时间是1-2小时。18.另一方面，本公开提供了一种基于纳米颗粒的药物递送系统，其能够操控相应的蛋白冠以用于向癌细胞进行特异性和有效的药物递送，该系统包括以下的组合：a.一系列单克隆抗体，其束缚于纳米颗粒表面以增加蛋白冠中用于癌细胞特异性摄取的特定蛋白的丰度；和b.一系列具有乙基和氧化物官能团的聚合物，用以提高溶解度。19.在一个实施方案中，其中所述单克隆抗体是抗人血清转铁蛋白的。20.在一个实施方案中，其中所述单克隆抗体被缀合以产生25-50ug/ml的最终浓度。附图说明21.从下面参考附图和方案的描述中，本公开的实施例的这些和其他方面和优点将变得明显和更容易理解，其中：22.图1显示了用cytoscape制作的转铁蛋白(单个蛋白冠蛋白)的蛋白-蛋白相互作用网络示例。23.图2显示了根据肺癌差异表达值排序的ngo200c蛋白冠分离物-5000蛋白冠蛋白-受体对的高通量mrna转录组分析结果。血清转铁蛋白(和相关的转铁蛋白受体)排名第一。24.图3显示go-ab与go-tf缀合物的细胞内定位的定量比较。蓝线代表go-ab缀合物，红线代表go-tf。25.图4显示了共聚焦显微镜图像，在人血清环境中对比观察go-tf与go-ab缀合物的摄取。绿色代表fitc报道基因(go-tf或go-ab)，蓝色代表dapi(细胞核)，红色与罗丹明鬼笔环肽染色(细胞膜)相关。26.图5显示了从被鉴定为与血清转铁蛋白相关的肽中提取的离子电流。上图对应于序列iecvsaettedciak。用于比较go与go-ab缀合物中血清转铁蛋白丰度的其他分析序列包括asyldcir、edpqtfyyavavvk和dchlaqvp。27.图6显示了肺癌细胞中go、go-tf、lipofectamine2000和go-抗-tf偶联的sirna复合物的bcl-2敲除效率。具体实施方式28.本发明包括一种新型多步骤方法，该方法可用于构建基于纳米颗粒的药物载体，该药物载体能够控制蛋白冠形成，以增加对某些细胞群体的靶向能力。因此，在描述本发明时，将详细阐述每个单独的步骤。29.初始步骤包括将纳米颗粒制剂置于含10％人血清的磷酸盐缓冲盐水中。最初，通过化学剥离法从原料石墨纳米片合成氧化石墨烯纳米颗粒。通过剧烈涡旋和探针超声的组合，将干燥的纳米颗粒溶解在浓度为1mg/ml的miliq水中。生成稳定悬浮液后，使用通过原子力显微镜法获得的包含纳米粒子特性的表格进行数学计算，以确保每种纳米颗粒制剂的(人血清的)体积与(纳米颗粒制剂的)表面积之比相同。计算结果可用于确定从制备好的贮备液中取出并转移到10％人血清的pbs溶液中的石墨烯溶液的比体积。30.暴露于血清溶液后，将纳米颗粒在37摄氏度下培养2小时，然后在4摄氏度下以16000rpm的速度离心半小时，并重新悬浮在pbsedta中。进行三次此类清洗步骤，然后去除上清液，直至每个样本中只剩下15ul液体。然后将样本置于dtt和10％sds，接着在70摄氏度下培养1小时。以16000rpm转速在4摄氏度下将样本离心半小时，然后重新悬浮在10％tca丙酮溶液中，然后在-80摄氏度下培养过夜。31.然后将蛋白分离物在4℃下以16000g离心30分钟，随后加入500ul的0.05％脱氧胆酸钠和100ul的72％tca。随后将它们在冰上培养30分钟，随后在4℃下以16000g离心30分钟，并重新悬浮在1ml丙酮中。将蛋白分离物在丙酮中洗涤1小时，之后在通风橱中干燥沉淀，并重新溶解在50mm碳酸氢铵中。32.然后，使用c18反相液相色谱柱，通过纳米级的液相色谱串联质谱对所得蛋白冠分离物进行分析。将样本烷基化以去除半胱氨酸残基，然后暴露于胰蛋白酶以将蛋白质分解为肽，以便于lc-ms分析。支架用于分析纳米lc-ms数据，得到每种纳米颗粒制剂的数百种蛋白质的列表。然后将相应的列表导出到excel中，以便通过生物信息筛选过程进行后续分析。33.下面是算法的简要说明。通过基因本体筛选查看每种纳米颗粒蛋白冠提取物的数百种蛋白的生理功能后，可以使用蛋白-蛋白相互作用数据库来筛选这些蛋白冠蛋白可参与的数万种潜在相互作用。然后，可以将得到的蛋白交互子(interactor)列表进行修剪，直至只包括那些具有细胞表面受体功能的蛋白。然后，可以对能够识别和/或内在化输入的蛋白冠蛋白的细胞表面受体的最终列表进行数千个细胞系的高通量mrna转录组分析，以基于差异表达值对它们进行排序。在数千个蛋白冠蛋白-细胞受体对的最终列表中，排名第一的蛋白最终被认为是最适合内源性募集的蛋白。34.该算法本身包括四个主要步骤。每个步骤的性质和结果将在下面的节段中详细解释。35.基因本体剖析36.作为开始步骤，使用python脚本(附在本文件末尾)对照quickgo数据库搜索每个单独纳米颗粒蛋白冠提取物中鉴定的所有蛋白，以鉴定相应的生理功能。这导致创建了一个作为mysql数据库一部分的表(table)，其中包含一些参数，例如对应于每种蛋白冠蛋白的uniprotkbid形式的唯一交互子id、对应于与该蛋白冠蛋白相关的特定生理功能的基因本体论(go)类别编号，以及表示由go类别编号列举的生理功能的文本标签。某些蛋白与数万种功能相关，而其他蛋白与数百种功能相关。总之，该步骤通常导致每个蛋白冠分离物的100000种生理功能的识别。37.蛋白-蛋白相互作用筛选38.然后使用irefindexaggregator虚拟工具箱，在超过20个不同的蛋白-蛋白相互作用数据库(apidinteractomes、bindingdb、dip-imex、genemania、innatedb、irefindex、mint、spike、zinc、bar、biogrid、drugbank、hpidb、innatedb-all、matrixdb、mpidb、chembl、ebi-goa-mirna、i2d、intact、mbinfo、reactome、uniprot、bind、dip、ebi-goa-non-intact、mentha)中搜索蛋白冠蛋白。由此创建另一个表作为mysql数据库的一部分，其中的表对应于与特定蛋白冠蛋白相对应的基因或蛋白符号、与该蛋白冠蛋白的现有的数据库相关联的唯一标识符、可与输入的蛋白冠蛋白相互作用的蛋白的特定交互子符号、以及与该交互子蛋白的现有的数据库相关联的唯一标识符。通常超过40000种蛋白被鉴定为能够与每个蛋白冠分离物相互作用。39.受体修剪40.然后再次对照quickgo搜索输出的交互子蛋白，仅返回那些对应于基于受体功能的go类别术语的蛋白，对应于细胞表面受体。在40000种蛋白冠蛋白的初始列表中，成千上万的go类别术语被过滤下来，仅包括对应于127个术语的类和亚类，与细胞表面受体功能相关。结果如图1所示。41.高通量mrna转录组分析42.然后对得到的细胞表面受体进行高通量mrna转录组分析，并根据拟靶向细胞群体中的差异表达进行排序(如图2所示)。在对应于作为初始模型的肺癌细胞的数百个细胞系上分析来自受体修剪过程的结果的每种受体的表达值，并根据mrna表达与每百万转录本(tpkm)中的正常细胞相关的表达值进行比较。从癌性表达值中减去这些正常表达值，以确定每种受体的每百万转录本的差异表达值。最终根据这些差异受体表达值对受体进行排序，得到每种蛋白冠提取物约5000个潜在候选物(分别用于肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌)。43.现在已知排第1的蛋白冠蛋白被靶细胞群中过表达的细胞受体内化。因此，增加其在蛋白冠中的丰度将增加由该细胞群内化的可能性。为了增加蛋白冠蛋白的丰度，通过简单的edcnhs交联，用抗该蛋白冠蛋白的单克隆抗体对在相应蛋白冠中发现具有最高量的该蛋白的合成纳米颗粒进行功能化。所得缀合物通过离心过滤柱过滤。现在可以在冰浴中通过简单的被动吸附将针对bcl-2的sirna功能化到所得缀合物上，随后搅拌2小时，并离心以获得产生的载体。44.将缀合物溶液置于冰浴中，然后暴露sirna并随后在冰上搅拌2小时。将缀合物离心分离得到的复合物，然后可立即用于转染目的。除了易于制备之外，所得缀合物的优点包括成本低，因为氧化石墨烯几乎比作为sirna转染的金标准的lipofectamine便宜100倍。由于相应纳米颗粒制剂的高的表面积与体积比，与最初暴露于缀合物的相比，吸附到石墨烯表面上的sirna的总收率超过90％。lc-ms和流式细胞术实验证实了氧化石墨烯-抗转铁蛋白单克隆抗体-bcl-2sirna复合物募集转铁蛋白的能力比未用抗转铁蛋白抗体功能化的氧化石墨烯制剂多2-3倍。结果如图3所示。在肺、乳腺和结肠直肠癌细胞中，缀合物还表现出与非功能化对应物相比显著更高的内化作用(如图4所示)，特别是当转铁蛋白受体已被预阻断时，内化最小至无内化(如图5所示)，这表明内化作用确实是转铁蛋白受体辅助的。构建这种基于纳米颗粒的药物载体所采用的间接靶向方法是同类方法中的第一(如图6所示)。当前第1页12当前第1页12