TIMP1作为胆管癌的标志物的制作方法

本发明涉及用于评定患者样品中胆管癌的体外方法和用于执行所述方法的试剂盒。此外，本发明涉及作为标志物分子的timp1以及包含timp1和mmp2的标志物组合分别在胆管癌的体外评定中的用途。

背景技术：

1、胆管癌(缩写为cca或ccc)是一种起源于胆管上皮细胞的高度致命的恶性胆道肿瘤。cca占所有消化道肿瘤的约3％，是仅次于肝细胞癌(缩写为hcc)的第二常见的原发性肝脏肿瘤。基于其解剖起源，cca分类为肝内(缩写为icca)、肝门部(缩写为pcca)或远端(缩写为dcca)cca(rimola j.等人，hepatology，2009，50(3)：791-798)。cca(特别是icca)的发病率似乎在增加，在西方国家可能高达每年每100,000人中2.1例，泰国东北部的已知发病率最高(每100,000人中＞80例；martha m.kirstein，arndt vogel，epidemiology and riskfactors 0f cholangiocarcinoma，visc med 2016；32：395-400)。

2、cca与hcc具有相似的风险因素，包括肝硬化、慢性病毒性肝炎、酒精过量、糖尿病和肥胖症。其他公认的cca风险因素与慢性胆系炎症有关，例如肝胆吸虫、原发性硬化性胆管炎(缩写为psc)、胆道囊肿、肝石病和毒素(bridgewater j.等人，j hepatol.2014，6：1268-893，8-14；khan s.a.等人，consensus document.gut.，2002，51 suppl 6：vi1-9；khan s.a.等人，gut.2012，61(12)：1657-1669；alvaro d.等人，dig liver dis.，2010，42：831-838；benavides m.等人，clin transl oncol.，2015，17：982-987；benson iii a.b.等人，j natl compr canc netw.，2009，7：350-391；cai j.q.等人，j huazhong univ scitechnolog med sci.，2014，34：469-475；rerknimitr r.等人，j gastroenterolhepatol.，2013，28：593-607)。

3、cca诊断通常很复杂，并且需要使用多种诊断方式在良性与恶性结构之间进行区别，以将cca与其他原发性肝肿瘤(主要是hcc和混合型hcc-cca)区分开来并对肿瘤进行分期和分级。cca(特别是icca)与hcc之间的区分对于手术计划和预后评定至关重要。成像方法，如动态计算机断层扫描，可以基于异质性造影剂摄取以及胆管癌延迟期不存在造影剂清除来区分hcc与cca(rimola j.等人，hepatology 2009，50(3)：791-798)。然而，肝内胆管癌的这些经典特征并不普遍存在于所有cca病例中(iavarone m.等人，j hepatol.，2013，58：1188-93；kim s.h.等人，j comput assist tomogr.，2012，36：704-09)。

4、迄今为止，没有可用于cca特异性诊断的特异性血液测试。糖类抗原ca19-9和ca-125以及癌胚抗原cea是关于疑似cca的最广泛使用的标志物，但它们的诊断性能非常有限。ca19-9在胰腺癌、结直肠癌和胃癌以及非恶性病症(诸如psc(原发性硬化性胆管炎)和阻塞性黄疸)中升高。此外，缺乏lewis抗原的患者(占总人口的10％)不能产生ca19-9，因此无法从检测中获益。ca19-9在cca患者中的敏感性和特异性分别为40％至70％和50％至80％，其中阳性预测值为16％至40％。cea在20％至30％的cca患者中升高，而ca-125在大约40％至50％的患者中升高，这不足以进行准确诊断(alsaleh m.等人，int j gen med.，2018，12：13-23；khan s.a.等人，gut.，2002，51suppl 6：vi1-9；patela.h.等人，am jgastroenterol，2000，95：204-207；hultcrantz r.等人，j hepatol，1999，30：669-673)。这些局限性得到了主要国际指南的认可，建议仅将cea和ca19-9测量作为胆管癌管理中的支持性而非诊断性工具(khan s.a.等人，consensus document.gut.，2002，51 supp1 6：vi1-9；khan s.a.等人，gut.2012，61(12)：1657-1669；alvaro d.等人，dig liver dis.，2010，42：831-838；benavides m.等人，clin trans1 oncol.，2015，17：982-987；benson iiia.b.等人，j natl compr canc netw.，2009，7：350-391；cai j.q.等人，j huazhong univ scitechnolog med sci.，2014，34：469-475；rerknimitr r.等人，j gastroenterolhepatol.，2013，28：593-607)。

5、因此，根据当前关于肝内胆管癌诊断和管理的easl指南，鉴定新型生物标志物以用于更具体的cca诊断和分层被认为是未满足的医疗需求之一(bridgewater j.，jhepatol.，2014，6：1268-89)。

6、如上所述，目前所有用于胆管癌的诊断和鉴别诊断的方法都存在较大的不足：

7、超声：超声检查(缩写为us)对于排除胆结石是可靠的，但依赖于操作者，并且单独使用时不足以调查研究疑似cca。us可能遗漏小肿瘤并且无法准确界定肿瘤范围(khans.a.等人，gut.，2002，51 suppl 6：vi 1-9；khan s.a.等人，gut.2012，61(12)：1657-1669)。只有日本指南和2002年版的bsg指南推荐将用于初步检查的us包括在诊断算法中(khan s.a.等人，gut.，2002，51suppl 6：vi 1-9；khan s.a.等人，gut.，2012，61(12)：1657-1669)。

8、与基线超声相比，对比增强超声(缩写为ceus)显著改良了在肝内胆管癌(icca)於hcc之间进行区分的诊断性能，但其性能强烈依赖于读出程序，其中auc从0.650到0.933不等，如chen l.d.等人，eur radiol.，2010，20(3)：743-53中的报道。此外，ceus在诊断小icc中的作用尚不清楚。

9、高分辨率/螺旋计算机断层扫描(缩写为ct)：对比ct对cca检测的灵敏度高于us(高达80％)，可提供肝内肿块病灶、扩张的肝内导管、局部淋巴结肿大和肝外转移的良好视野。然而，与hcc(sun h.和song t.，drug discov ther.，2015，9：310-318)不同，ct或磁共振成像(简称mri)的放射学标准对cca的诊断不灵敏。因此，明确诊断cca需要进行病理学诊断。此外，ct/mri可能会漏掉小病灶(chen l.d.等人，eur radiol.，2010，20(3)：743-53；hanninen e.l.等人，acta radiol.，2005，46：462-470)。

10、血清肿瘤标志物：糖类抗原ca19-9和ca-125以及癌胚抗原cea是最常用的血清肿瘤标志物。它们全部与其他良性疾病有明显的重叠并且对早期疾病的灵敏度低，这限制了它们在诊断中的应用。ca 19-9对icca的灵敏度和特异性分别仅为62％和63％。cea的诊断性能甚至更低，因为它仅在20％至30％的cca患者中升高，而ca-125在大约40％至50％的患者中升高，这不足以进行准确诊断(alsaleh m.等人，int j gen med.，2018，12：13-23；khan s.a.等人，gut.，2002，51 suppl 6：vi1-9；patel a.h.等人，am j gastroenterol，2000，95：204-207；hultcrantz r.等人，j hepatol，1999，30：669-673)。

11、全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的患者样品来源。鉴定有助于可靠的cca检测或提供早期预后信息的早期cca标志物可能会产生一种极大地有助于诊断和管理该疾病的方法。

12、因此，临床迫切需要改良cca的体外评定。改良cca的早期诊断尤为重要，因为对于在cca早期诊断的患者，与在疾病更晚期诊断的患者相比，胆管损伤可逆性的可能性要高得多。

13、本领域强烈需要鉴定cca疾病状态的可靠且直接的指标，以便可靠地区别cca的症状与上述其他呼吸系统疾病的症状，以预测疾病严重程度、疾病进展和对药物的应答方面的变化。

14、本发明的一个目的是提供一种简单且具有成本效益的cca评定程序，例如以鉴定疑似患有cca的个体。特别地，本发明的一个目的是提供用于评定患者样品中胆管癌的体外方法和用于执行所述方法的试剂盒。此外，本发明的一个目的涉及作为标志物分子的timp1以及包含timp1和mmp2的标志物组合分别在胆管癌的体外评定中的用途。

15、该目的或这些目的通过独立权利要求的主题来解决。其他实施例服从于从属权利要求。

技术实现思路

1、现已发现，使用组织金属蛋白酶抑制剂-1(timp1)至少可以部分地克服目前已知的可用于评定cca的方法的一些问题。

2、令人惊讶地，在本发明中发现包括确定患者样品中timp1水平的步骤的体外方法允许进行cca的评定。在这种情况下，发现与timp1的参考水平相比，从个体获得的此类样品中升高的所述timp1水平指示cca的存在。

3、在第一方面，本发明涉及用于评定患者样品中胆管癌的体外方法，该方法包括：

4、a)确定患者样品中组织金属蛋白酶抑制剂-1(timp1)的水平，其中该患者样品选自由以下项组成的组：来自个体的血清、血浆和全血样品，

5、b)将在步骤(a)中确定的timp1的水平与timp1的参考水平进行比较，以及

6、c)通过将在步骤(a)中确定的水平与timp1的参考水平进行比较来评定患者样品中的胆管癌，其中与timp1的参考水平相比timp1的增加水平指示该患者样品中的胆管癌。

7、在第二方面，本发明涉及timp1作为标志物分子在个体的血清、血浆或全血样品中胆管癌的体外评定中的用途，其中高于timp1的参考水平的timp1水平指示胆管癌。

8、在第三方面，本发明涉及包含timp1和mmp2的标志物组合在个体血清、血浆或全血样品中胆管癌的体外评定中的用途，其中timp1和mmp2的水平指示胆管癌。根据本发明的第三方面，tipm1和mmp2的水平可以特别地意为timp1和mmp2的检测水平或timp1和mmp2的检测。

9、在第四方面，本发明涉及一种用于评定患者样品中胆管癌的体外方法，该方法包括：

10、(a′)确定患者样品中组织金属蛋白酶抑制剂-1(timp1)的水平，其中该患者样品选自由以下项组成的组：来自个体的血清、血浆和全血样品，

11、(b′)确定该患者样品中胆管癌的基质金属蛋白酶-2(mmp2)的水平，以及

12、(c′)通过将步骤(a′)和(b′)的确定结果进行比较来评定胆管癌，其中timp1和mmp2的水平指示cca。根据本发明的第四方面，tipm1和mmp2的水平可以特别地意为timp1和mmp2的检测水平或timp1和mmp2的检测。

13、在第五方面，本发明涉及一种用于执行至少一种所述方法的试剂盒，该试剂盒包含确定在步骤(a)或步骤(a′)中确定的timp1水平并且任选地确定在步骤(b′)中确定的mmp2水平所必需的试剂。