本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种能够同时测定蜂蜜中32种吡咯里西啶生物碱的方法。
背景技术：
吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidinealkaloids，pas)是有花植物为防御食草性动物而产生的一种次生代谢产物，世界上约3％的有花植物(6000多种)含有吡咯里西啶生物碱，且以游离的吡咯里西啶生物碱及其氮氧化物两种形式存在。吡咯西啶生物碱对动物和人类有严重的毒性作用，其作用的直接靶器官为肝脏，在体内通过代谢活化而致毒，可引起肝细胞出血性坏死、肝巨红细胞症及静脉闭塞症等，所以又称为肝毒吡咯西啶生物碱，已发现的吡咯里西啶生物碱660种，其中约120种具有肝毒性。并且，某些蜜源植物的花蜜和花粉中也会产生对人类有严重毒性作用的吡咯里西啶生物碱，其通过蜜蜂采集花蜜和花粉而转移至蜂蜜中，从而对蜂蜜造成污染，进而影响食用者的身体健康。
全面且准确地测定蜂蜜中吡咯里西啶生物碱含量，对于评估蜂蜜的食品安全性具有重要作用。目前蜂蜜中吡咯里西啶生物碱的检测方法主要有德国联邦风险评估研究所(bundesinstitutfürrisikobewertung,bfr)制定的《bfr-pa-honey-1.0/2013determinationofpyrrolizidinealkaloids(pa)inhoneybyspe-lc-ms/msmethodprotocol》，该方法中共测定17种吡咯里西啶生物碱(氮氧化物)，其中促黑激素(intermedine)和石松胺(lycopsamine)是同分异构体，两者是蜂蜜中常检出的吡咯里西啶生物碱，而两者没有完全分开，进而影响测定结果准确定量。natashal.hungerford等人采用高分辨静电轨道离子阱质谱(orbitrap)并结合将色谱柱柱温设置为5℃的低温色谱条件进行30种吡咯里西啶生物碱的测定，昂贵的高分辨质谱仍解决不了同分异构体分不开的问题，只能通过设置低柱温，同分异构体才得到分离，且仍有部分同分异构体未分开。
综上所述，目前蜂蜜中吡咯里西啶生物碱测定技术存在测定的吡咯里西啶生物碱种类有限，且有同分异构体分离不完全而影响测定结果准确性的问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中吡咯里西啶生物碱测定种类有限，且有部分同分异构体不能完全分离而影响测定结果准确性的问题；提供一种可同时测定蜂蜜中32种吡咯里西啶生物碱的方法。
其所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实施。
一种可同时测定蜂蜜中32种吡咯里西啶生物碱的方法，用于测定32种吡咯里西啶生物碱中的一种或多种在蜂蜜中的残留量，包括如下步骤：
称取蜂蜜样品，加入稀硫酸溶液溶解，混合均匀，离心，取上清液。
上清液用固相萃取柱净化，氨化甲醇进行洗脱，洗脱液氮吹至干，复溶，过滤膜，用高效液相色谱-质谱联用仪进行32种吡咯里西啶生物碱的检测，外标法定量；其中：
(1)32种吡咯里西啶生物碱为：蓝蓟定、蓝蓟定n-氧化物、芝麻菜叶千里光碱、芝麻菜叶千里光碱n-氧化物、天芥菜碱、天芥菜碱n-氧化物、石松胺、石松胺n-氧化物、欧天芥菜碱、欧天芥菜碱n-氧化物、促黑激素、促黑激素n-氧化物、千里光碱、千里光碱n-氧化物、千里光宁、千里光宁n-氧化物、千里光非灵、千里光非灵n-氧化物、春生千里光碱、春生千里光碱n-氧化物、苦参素、野百合碱、野百合碱n-氧化物、毛果天芥菜碱、毛果天芥菜碱n-氧化物、倒千里光碱、靛红定、瑞氏千里光碱、黄樟素n-氧化物、毛束草碱、大尾摇碱-n-氧化物和克沃任。
(2)高效液相色谱条件为：
色谱柱：watersacquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7μm)；
柱温：30℃～40℃(优选30℃)；
流动相a：0.1％甲酸水(含5mmol/l乙酸铵)，b：甲醇；
梯度洗脱程序：初始流动相b为5％，保持0.5min；0.5～2.0min,b由5％上升至10％；2.0～4.0min，b由10％上升至15％；4.0～10.0min，b由15％上升至20％；10.0～14.0min，b由20％上升至50％；14.0～16.0min，b由50％上升至90％，16.0～16.1min，b由90％下降至5％，保持到18min。
流速：300～400μl/min(优选300μl/min)；
进样量：1μl。
(3)质谱条件为：
电喷雾离子源，正离子电离模式，多反应监测采集离子；
离子源参数：气帘气：241～276kpa(优选241kpa)；碰撞气：62～83kpa(优选62kpa)；喷雾电压：5000±500v(优选5500v)；雾化温度：450～550℃(优选550℃)；雾化气：276～379kpa(优选379kpa)；辅助气：276～379kpa(优选379kpa)。
进一步，所述稀硫酸溶液为0.05mol/l的h2so4溶液。
进一步，所述固相萃取柱为阳离子交换固相萃取柱。
所述阳离子交换固相萃取柱先依次用5ml甲醇、5ml水和5ml0.05mol/lh2so4溶液活化，样品溶液加载后再分别用5ml0.05mol/lh2so4溶液、5ml水和5ml甲醇淋洗。
进一步，所述氨化甲醇为体积比为5:95的氨水和甲醇混合物。
进一步，所述复溶的溶液为1ml水。
进一步，所述外标法标准曲线范围：质量浓度0.5～20.0μg/l，线性相关系数r2>0.996。
所述32种吡咯里西啶生物碱的检出限为：0.065～2.033μg/kg。
所述方法的平均回收率为66.3％～95.1％，相对标准偏差为：1.6％～10.5％。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果在于：
(1)可测定蜂蜜中32种不同的吡咯里西啶生物碱(氮氧化物)，能够更大程度测定蜂蜜可能含有的吡咯里西啶生物碱，从而为蜂蜜中吡咯里西啶生物碱的污染情况进行监测，评估蜂蜜中吡咯里西啶生物碱的毒性风险。
(2)液相色谱条件中，采用小粒径的色谱柱watersacquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7μm)，可提高32种吡咯里西啶生物碱中同分异构体的分离效果，同时优化梯度洗脱程序，实现了32种吡咯里西啶生物碱中8组同分异构体的基线分离，为其准确定量提供有力保障。
(3)采用阳离子交换固相萃取柱，可有效净化蜂蜜中吡咯里西啶生物碱，从而减少基质效应，使得32种吡咯里西啶生物碱的检出限在0.065～2.033μg/kg氛围内，平均回收率在66.3％～95.1％氛围内。
附图说明
图1至图8分别是8组同分异构体的分离色谱图；
图9是实施例1中吡咯里西啶生物碱检出色谱图；
图10是实施例2中吡咯里西啶生物碱检出色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行进一步的详细说明。
以下具体实施例进一步详细地阐述本发明的技术特点。
仪器与试剂
exionlc-sciex6500+超高效液相色谱-串联质谱仪(美国sciex公司)；multi-tubevortexeradv230v型数显多管漩涡振荡器(美国talbys公司)；tgl-20m台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；visiprepdl24位固相萃取装置固相萃取装置(美国supelco公司)；anpel-efaa-dc24-rt型氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)；明澈-d24uvmilli-q纯水仪(德国默克millipore公司)；acquitybehc18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱(美国waters公司)；mcx小柱(美国waters公司,60mg/3ml)。
蓝蓟定、蓝蓟定n-氧化物、芝麻菜叶千里光碱、芝麻菜叶千里光碱n-氧化物、天芥菜碱、天芥菜碱n-氧化物、石松胺、石松胺n-氧化物、欧天芥菜碱、欧天芥菜碱n-氧化物、促黑激素、促黑激素n-氧化物、千里光碱、千里光碱n-氧化物、千里光宁、千里光宁n-氧化物、千里光非灵、千里光非灵n-氧化物、春生千里光碱、春生千里光碱n-氧化物、苦参素、野百合碱、野百合碱n-氧化物、毛果天芥菜碱、毛果天芥菜碱n-氧化物、倒千里光碱、靛红定、瑞氏千里光碱、黄樟素n-氧化物、毛束草碱、大尾摇碱-n-氧化物标准品均购于北京振翔公司，克沃任购于chemfaces(武汉天植生物技术有限公司)；乙腈(色谱纯，美国默克公司)，甲酸(色谱纯，美国赛默飞公司)；乙酸铵(色谱纯，麦克林公司)；试验用水为超纯水。
标准溶液配制
分别称取一定量的32种pas固体标准品用甲醇溶解并定容，得100μg/ml的32种吡咯里西啶生物碱标准溶液；混合标准中间液：分别准确吸取32种pas标准溶液各100μl，用甲醇定容至10ml，得1μg/ml的混合标准中间液。
高效液相色谱条件
色谱柱：watersacquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7μm)；
柱温：30℃；
流动相a：0.1％甲酸水(含5mmol/l乙酸铵)，b：甲醇；
梯度洗脱程序：按体积比，初始流动相b为5％，保持0.5min；0.5～2.0min，b由5％上升至10％；2.0～4.0min，b由10％上升至15％；4.0～10.0min，b由15％上升至20％；10.0～14.0min，b由20％上升至50％；14.0～16.0min，b由50％上升至90％，16.0～16.1min，b由90％下降至5％，保持到18min。
流速：300μl/min；
进样量：1μl。
质谱条件：
电喷雾离子源，正离子电离模式，多反应监测采集离子，离子源参数：气帘气：241kpa；碰撞气：62kpa；喷雾电压：5500v；雾化温度：550℃；雾化气：379kpa；辅助气：379kpa；
32种吡咯里西啶生物碱的质谱参数见下表1。
表1：32种吡咯里西啶生物碱的质谱参数
其中，“*”为定量离子。
将质量浓度为20μg/l的32种吡咯里西啶生物碱混合标准溶液在所述高效液相色谱条件和质谱条件下进行测定。32种吡咯里西啶生物碱在所述条件下具有很好的响应值，其中8组同分异构体能有效分离，见图1至图8。并且32种吡咯里西啶生物碱在18min内出峰完毕。
标准曲线绘制
将质量浓度分别为0.5，1，2，5，10，20μg/l的32种吡咯里西啶生物碱标准工作溶液系列进行测定，以32种吡咯里西啶生物碱的峰面积为纵坐标，以其相应质量浓度为横坐标绘制标准曲线，结果表明，32种吡咯里西啶生物碱在0.5～20μg/l范围内与相应峰面积呈线性关系，线性方程和相关系数(r2)见表2。
表2：32种吡咯里西啶生物碱的线性方程和相关系数
检出限和定量限
取不含32种吡咯里西啶生物碱的蜂蜜为空白样品基质，按照所述步骤进行处理得到样品溶液，添加质量浓度为1、2、10μg/l的32种吡咯里西啶生物碱混合标准溶液，每个浓度6个平行样，按照高效液相色谱条件和质谱条件进行测定，外标法定量，以3倍标准偏差计算方法的检出限，10倍标准偏差计算方法的定量限，结果见下表3。
表3：32种吡咯里西啶生物碱的检出限和定量限
精密度和回收率
取不含32种吡咯里西啶生物碱的蜂蜜为空白样品基质，按照所述步骤进行处理得到样品溶液，添加质量浓度为1、2、10μg/l的32种吡咯里西啶生物碱混合标准溶液，每个浓度6个平行样，按照高效液相色谱条件和质谱条件进行测定，外标法定量，32种吡咯里西啶生物碱的平均加标回收率和相对标准偏差(rsd)见表4。该方法平均加标回收率和rsd分别在66.3％～95.1％和3.3％～8.0％范围内，具有较好的准确度和精密度，满足gb/t27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录f中所列的定量要求。
表4：32种吡咯里西啶生物碱的平均加标回收率和精密度(n＝6)
样品测定
实施例1
称取1g(精确0.0001g)岩蜂蜜于50ml塑料离心管中，加入10ml0.05mol/lh2so4溶液，涡旋振荡，10000rmp/min离心5min，取上清液。mcx小柱分别用5ml甲醇、5ml水和5ml0.05mh2so4溶液活化，加载样品上清液，再分别用5ml0.05mol/lh2so4溶液、5ml水和5ml甲醇淋洗，最后用5％氨化甲醇进行洗脱。
洗脱液在40℃水浴下氮吹至干，用1ml水复溶，过0.22μm滤膜至1ml进样小瓶，然后在高效液相色谱条件和质谱条件下进行测定，外标法定量。结果表明，该蜂蜜中含有促黑激素和石松胺，提取离子流色谱图见图9，定量结果为促黑激素108.5μg/kg，石松胺98.5μg/kg。德国联邦风险评估研究所规定蜂蜜中吡咯里西啶生物碱日摄入量不超过0.007μg每kg体重，对于一个体重为60kg的消费者来说，日摄入量不超过0.42μg，即一勺(约20g)蜂蜜中吡咯里西啶生物碱不超过21μg/kg；欧洲食品安全局规定蜂蜜中吡咯里西啶生物碱日摄入量不超过0.0237μg每kg体重，对于一个体重为60kg的消费者来说，日摄入量不超过1.42μg，即一勺(约20g)蜂蜜中吡咯里西啶生物碱不超过71μg/kg。由此可知，该岩蜂蜜中所含吡咯里西啶生物碱含量(残留量)为207μg/kg，具有较高的食用安全风险。
实施例2
称取1g(精确0.0001g)土蜂蜜于50ml塑料离心管中，加入10ml0.05mol/lh2so4溶液，涡旋振荡，10000rmp/min离心5min，取上清液。mcx小柱分别用5ml甲醇、5ml水和5ml0.05mh2so4溶液活化，加载样品上清液，再分别用5ml0.05mol/lh2so4溶液、5ml水和5ml甲醇淋洗，最后用5％氨化甲醇进行洗脱。
洗脱液在40℃水浴下氮吹至干，用1ml水复溶，过0.22μm滤膜至1ml进样小瓶，然后在高效液相色谱条件和质谱条件下进行测定，外标法定量。结果表明，该蜂蜜中含有促黑激素和石松胺，提取离子流色谱图见图10，定量结果为促黑激素36.9μg/kg，石松胺46.9μg/kg，总量为83.8μg/kg，超过德国联邦风险评估研究所和欧洲食品安全局规定的推荐性日摄入量，具有食用安全风险。
本发明方法中共可测定32种吡咯里西啶生物碱，可全面了解蜂蜜所含的吡咯里西啶生物碱种类。吡咯里西啶生物碱的毒性与其结构密切相关，不同种类的吡咯里西啶生物碱毒性不同，蜂蜜中吡咯里西啶生物碱测定种类越多，越有利于评估蜂蜜的食用安全性。同时吡咯里西啶生物碱的种类与蜜源植物密切相关，从而利于对有毒蜜源植物进行相应控制，可预防食用野生蜂蜜中毒等事件的发生。
本发明方法与德国联邦风险评估研究所(bundesinstitutfürrisikobewertung,bfr)制定的《bfr-pa-honey-1.0/2013determinationofpyrrolizidinealkaloids(pa)inhoneybyspe-lc-ms/msmethodprotocol》方法中柱温相同情况下，采用小粒径色谱柱和优化的梯度洗脱程序，从而使得32种吡咯里西啶生物碱中8组同分异构体有效分离，提高了分析的准确性，对于准确评估蜂蜜中吡咯里西啶生物碱的毒性具有重要意义。
本发明的方法采用阳离子交换固相萃取柱净化蜂蜜样品，有效去除蜂蜜中的杂质，获得较低的检出限和定量限，方法回收率和精密度均满足定量分析要求。本发明增加了蜂蜜中吡咯里西啶生物碱的测定种类，优化了高效液相色谱条件，有效分离了8组同分异构体，适用于蜂蜜中多组分吡咯里西啶生物碱的测定，从而有利于蜂蜜中吡咯里西啶生物碱毒性风险评估。
显然，上述实施例仅仅是为了清楚地说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。任何本领域技术人员，在上述说明的基础上还可以做出各种改动，因此本发明的保护范围应当以权利要求限定的范围为准。