一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法的制作方法

1.本发明属于血清检测领域，主要涉及串联质谱法检测人体血浆中9种游离氨基酸的技术，具有检测时间短、检测灵敏度高的特点。


背景技术：

2.游离氨基酸是以游离状态在生物体内存在的一组氨基酸，是既含氨基(－nh2)又含羧基(
‑
cooh)的有机化合物。所测的九种氨基酸，根据r基的性质分为：1)含非极性、疏水性r基的氨基酸：缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、甘氨酸(gly)、色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)；2)含极性、中性r基的氨基酸：谷氨酰胺(gln)、酪氨酸(tyr)；3)含酸性r基的氨基酸：谷氨酸(glu)。
3.目前，有关游离氨酸的检测方法有很多，如氨基酸分析仪测定法、液相色谱
‑
串联质谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等方法。氨基酸分析仪测定法适用于测定蛋白质、多肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量，而液相色谱
‑
串联质谱法(lc
‑
ms/ms)能够区分氨基酸及其代谢产物，灵敏度高，特异性强，适用于血浆或血清中多种游离氨基酸的检测。但是，目前的lc
‑
ms/ms技术检测游离氨基酸仍然存在问题，如样本用量大、需要柱前衍生化、前处理方法复杂、检测时间长、且运用多种氨基酸内标定量等。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术中存在的不足，本发明采用一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，所采用的方法具有样本用量少、前处理简便、一种内标即可准确定量、检测时间短、检测灵敏度高等优点。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.超高效液相色谱
‑
串联质谱法检测血浆中的9种游离氨基酸，其中所述氨基酸为：甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸；
7.(1)氨基酸标准品溶液配制为：
8.精确称取每种氨基酸标准品10mg，根据物质溶解性不同，酪氨酸用0.1mol/l稀盐酸水溶液配制成浓度为10mg/ml标准品母液，谷氨酸用纯甲醇溶液配制成浓度为10mg/ml标准品母液，其余7种氨基酸用过滤的超纯水配制即可，再从氨基酸标准品母液各取适量体积用50％(v/v)甲醇水配制得到相应浓度的氨基酸标准品工作液，并稀释成不同的校准曲线工作浓度范围；
9.甘氨酸标准品工作液浓度为150μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为100ng/ml～75μg/ml；
10.谷氨酰胺标准品工作液浓度为25μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为25ng/ml～12.5μg/ml；
11.谷氨酸标准品工作液浓度为100μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为50ng/ml～50μg/ml；
12.缬氨酸标准品工作液浓度为100μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为25ng/ml～50μg/ml；
13.酪氨酸标准品工作液浓度为50μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为25ng/ml～25μg/ml；
14.异亮氨酸标准品工作液浓度为200μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为100ng/ml～100μg/ml；
15.亮氨酸标准品工作液浓度为50μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为25ng/ml～25μg/ml；
16.苯丙氨酸标准品工作液浓度为25μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为25ng/ml～12.5μg/ml；
17.色氨酸标准品工作液浓度为150μg/ml，其校准曲线工作浓度范围为50ng/ml～75μg/ml；
18.各氨基酸标准品工作液，按照校准曲线工作浓度范围稀释为6
‑
10个浓度梯度；
19.(2)内标标准品溶液配制为：
20.精确称取内标标准品10mg，并加入纯甲醇溶液溶解配制成浓度为10mg/ml内标标准品母液，再将内标标准品溶液用纯甲醇稀释成浓度为10μg/ml的内标标准品工作液；
21.内标为2
‑
氯
‑
苯丙氨酸；
22.(3)样品前处理方法为：
23.在样本前处理前，先将血浆样本用生理盐水稀释15倍，再从稀释的样本中吸取10μl，加入10μl浓度为10μg/ml的内标溶液，再加入20μl的含0.1％(v/v)甲酸的甲醇溶液和40μl乙酸乙酯溶液，混匀振荡60～120s，于
‑
20℃静置10～15min后在4℃低温下16000rpm离心10～15min，取60μl上清液氮吹，加入200μl流动相a溶液复溶，混匀振荡60～120s，超声10～20s，在低温条件下以16000rpm离心10～15min，取80μl上清液用于超高效液相色谱
‑
串联质谱检测；
24.(4)上述方法中，超高效液相色谱的色谱条件为：
25.色谱柱：ace 3 c18
‑
pfp，100
×
2.1mm id，3μm；
26.流动相a：含0.5％(v/v)乙酸、0.025％(v/v)甲酸、0.05％(v/v)七氟丁酸的水溶液；
27.流动相b：纯甲醇溶液；
28.柱温箱：35℃；
29.进样箱：6℃；
30.流速：0.4ml/min；
31.进样体积：2μl；
32.洗针液：50％(v/v)甲醇水溶液；
33.洗脱方式：梯度洗脱；
34.洗脱程序为：
[0035][0036]
(5)上述方法中，串联质谱检测条件为：
[0037]
离子源：电喷雾离子源esi源；
[0038]
极性模式：正离子模式；
[0039]
监测模式：多反应监测模式mrm；
[0040]
雾化帘气压cur：35psi；
[0041]
离子化电压is：5500v；
[0042]
碰撞室强度cad：medium；
[0043]
雾化温度tem：550℃；
[0044]
辅助气压gs1：55psi；
[0045]
辅助气压gs2：55psi；
[0046]
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
[0047]
本发明建立了一种超高效液相色谱
‑
串联质谱检测血浆中的9种游离氨基酸的方法，通过一种内标即可定量测定，减少了方法运行的成本；样品前处理方法能够较好地去除血浆中蛋白质等物质干扰，从而提高检测灵敏度，缩短检测分析时间；
[0048]
本发明采用mrm模式监测母离子q1和子离子q3的质谱信号，以q1/q3的离子对的色谱峰面积比和浓度比进行定量分析，同时校准曲线线性相关系数均大于0.99，为血液中游离氨基酸提供了一种可靠的分析检测方法。
附图说明
[0049]
图1是典型的氨基酸标准品混标的总离子流色谱图；
[0050]
图2是典型的血浆样本的总离子流色谱图；
[0051]
图3是甘氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0052]
图4是谷氨酰胺定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0053]
图5是谷氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0054]
图6是缬氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0055]
图7是酪氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0056]
图8是异亮氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0057]
图9是亮氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0058]
图10是苯丙氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0059]
图11是色氨酸定量离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
[0060]
图12是内标定性离子对q1/q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本。
具体实施方式
[0061]
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
[0062]
1、仪器和试剂
[0063]
超高效液相色谱
‑
串联质谱仪：exion lc ad uplc
‑
qtrap5500，美国ab sciex公司；低温高速离心机：eppendorf 5415r，德国eppendorf公司；氮吹仪：yn
‑
d03
‑
012，上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水仪：milh
‑
qbiocel型，美国millipore公司；漩涡振荡器：mx
‑
s，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；精密电子天平：mm
‑
a
‑
018，瑞士mettler toledo公司；超声波清洗机：sb
‑
5200dtd，宁波新芝生物科技股份有限公司；移液器：10μl、50μl、100μl、200μl和1000μl移液器，德国eppendorf公司。
[0064]
9种氨基酸标准品(甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、内标标准品(2
‑
氯
‑
苯丙氨酸)、甲酸(hplc级)、乙酸(hplc级)、七氟丁酸(hplc级)、盐酸(优级纯)、甲醇(hplc级)、乙酸乙酯(hplc级)均购自美国sigma公司。
[0065]
2、标准品溶液配制
[0066]
精确称取每种氨基酸标准品10mg，根据物质溶解性不同，酪氨酸用0.1mol/l稀盐酸水溶液配制成浓度为10mg/ml标准品母液，谷氨酸用纯甲醇溶液配制成浓度为10mg/ml标准品母液，其余7种氨基酸用过滤的超纯水配制即可，再从氨基酸标准品母液各取适量体积用50％(v/v)甲醇水配制得到相应浓度的氨基酸标准品工作液，并稀释成不同的校准曲线工作浓度范围如下。
[0067]
表1各氨基酸标准品工作液和校准曲线工作浓度范围
[0068]
氨基酸标准品工作液浓度校准曲线工作浓度范围甘氨酸150μg/ml100ng/ml～75μg/ml谷氨酰胺25μg/ml25ng/ml～12.5μg/ml谷氨酸100μg/ml50ng/ml～50μg/ml缬氨酸100μg/ml25ng/ml～50μg/ml酪氨酸50μg/ml25ng/ml～25μg/ml异亮氨酸200μg/ml100ng/ml～100μg/ml亮氨酸50μg/ml25ng/ml～25μg/ml苯丙氨酸25μg/ml25ng/ml～12.5μg/ml色氨酸150μg/ml50ng/ml～75μg/ml
[0069]
精确称取内标标准品10mg，加入纯甲醇溶液溶解配制成浓度为10mg/ml内标标准品母液，再将内标标准品溶液用纯甲醇溶液稀释成浓度为10μg/ml的内标标准品工作液；
[0070]
内标为2
‑
氯
‑
苯丙氨酸；
[0071]
各氨基酸标准品工作液，按照校准曲线工作浓度范围稀释为6
‑
10个浓度梯度。
[0072]
3、血浆样品的前处理：
[0073]
在样本前处理前，先将血浆样本用生理盐水稀释15倍，再从稀释的样本中吸取10μl，加入10μl浓度为10μg/ml的内标溶液，再加入20μl的0.1％(v/v)甲酸的甲醇溶液和40μl乙酸乙酯溶液，混匀振荡60s，于
‑
20℃静置10min后，在4℃低温下16000rpm离心15min，取60μl上清液氮吹，加入200μl流动相a溶液复溶，混匀振荡60s，超声20s，在4℃低温条件下以16000rpm离心15min，取80μl上清液用于超高效液相色谱
‑
串联质谱检测；
[0074]
4、超高效液相色谱的色谱条件
[0075]
色谱柱：ace 3 c18
‑
pfp，100
×
2.1mm id，3μm；
[0076]
流动相a：含0.5％(v/v)乙酸、0.025％(v/v)甲酸、0.05％(v/v)七氟丁酸的水溶液；
[0077]
流动相b：纯甲醇溶液；
[0078]
柱温箱：35℃；
[0079]
进样箱：6℃；
[0080]
流速：0.4ml/min；
[0081]
进样体积：2μl；
[0082]
洗针液：50％(v/v)甲醇水溶液；
[0083]
洗脱方式：梯度洗脱；
[0084]
洗脱程序为：
[0085][0086]
5、串联质谱检测条件
[0087]
离子源：电喷雾离子源esi源；极性模式：正离子模式；监测模式：多反应监测模式mrm；雾化帘气压cur：35psi；离子化电压is：5500v；碰撞室强度cad：medium；雾化温度tem：550℃；辅助气压gs1：55psi；辅助气压gs2：55psi；同时检测目标氨基酸离子对以及同位素内标氨基酸离子对q1/q3，mrm监测参数包括：各离子对及其对应的驻留时间(time)、保留时间(rt)、去簇电压(dp)、引入电压(ep)、碰撞电压(ce)和碰撞池出口电压(cxp)；mrm监测参
数如下。
[0088]
表2 mrm监测参数
[0089][0090][0091]
下面对本实施例的检测结果进一步分析，以验证本发明专利提供方法的可行性：采用内标定量法制作校准曲线，以氨基酸标准品浓度与内标浓度之比为x轴，氨基酸标准品的色谱峰面积与内标的色谱峰面积比为y轴，建立标准曲线。根据该校准曲线计算血浆中各氨基酸的浓度。依据特征离子mrm色谱峰的信噪比大于10为检测限，信噪比大于20为定量限。各氨基酸的校准曲线结果如下。
[0092]
表3各氨基酸的校准曲线结果
[0093]
氨基酸线性方程相关系数线性范围检测限定量限甘氨酸y＝0.24264x+0.001170.99565100ng/ml～75μg/ml50ng/ml100ng/ml谷氨酰胺y＝7.28904x
‑
7.60768e
‑
40.9968325ng/ml～12.5μg/ml12ng/ml25ng/ml谷氨酸y＝1.48170x+0.003590.9981750ng/ml～50μg/ml25ng/ml50ng/ml缬氨酸y＝12.74285x+0.007150.9977625ng/ml～50μg/ml12ng/ml25ng/ml酪氨酸y＝3.32622x+0.006590.9984825ng/ml～25μg/ml12ng/ml25ng/ml异亮氨酸y＝18.12127x+0.006240.99817100ng/ml～100μg/ml50ng/ml100ng/ml亮氨酸y＝18.77192x+0.015060.9976625ng/ml～25μg/ml12ng/ml25ng/ml苯丙氨酸y＝16.86975x+0.055750.9988325ng/ml～12.5μg/ml12ng/ml25ng/ml色氨酸y＝4.94705x+0.004620.9981650ng/ml～75μg/ml25ng/ml50ng/ml
[0094]
9种氨基酸在各自浓度线性范围内呈良好的线性关系，满足定量要求，且能快速、
稳定、准确地定量检测血浆中的氨基酸。
[0095]
本发明建立了一种超高效液相色谱
‑
串联质谱检测血浆中的9种游离氨基酸的方法，通过一种内标即可定量测定，减少了方法运行的成本；样品前处理方法能够较好地去除血浆中蛋白质等物质干扰，从而提高检测灵敏度，缩短检测分析时间；
[0096]
本发明采用mrm模式监测母离子q1和子离子q3的质谱信号，以q1/q3的离子对的色谱峰面积比和浓度比进行定量分析，同时校准曲线线性相关系数均大于0.99，为血液中游离氨基酸提供了一种可靠的分析检测方法。
[0097]
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。