一种比率可任意调节的比率荧光检测方法

本发明涉及检测领域，具体涉及一种比率可任意调节的比率荧光检测方法。

背景技术：

上转换发光纳米材料(upconversionnanoparticles，ucnps)主要由氧化物、氟化物、卤氧化物等无机基质通过掺杂三价稀土离子(如er³⁺、eu³⁺、yb³⁺、tm³⁺、ho³⁺等)得到，其上转换过程可将连续吸收的两个或者多个泵浦光子，经过无辐射驰豫达到发光能级，然后跃迁至基态产生一个高能量的发射光子，是一个非线性光学的反斯托克斯过程。其独特的变频能力使ucnps具备很多的优点，如信噪比高、荧光寿命长、无光闪烁和光漂白、毒性低发射带窄以及有较大的穿透深度、对生物组织几乎无损伤等显著优点，使其在生物医学领域里相应的诊断、治疗、成像、生物监测等获得了变革性的机遇和发展。因此，致力于研究上转换发光纳米材料在生物方向的应用极具科学价值。

比率荧光是通过测量两个不同波长处的荧光强度比值作为信号参量，以此来测定目标物的一种分析方法。现有用作比率荧光测量的探针都属于单激发材料，主要是将两个不同的荧光团组合在一个纳米颗粒上，一个荧光团作为参考单元、另一个荧光团作为信号单元，通过测量两个波长的荧光强度比值的变化来检测分析物。目前已经开发的大多数上转换发光纳米材料也都属于单激发材料。

单激发上转换材料能在单激发条件下产生一种或多种发射，而当激发能量发生改变时，所有的发射会同时发生相应的变化。但是这种变化仅仅体现在发射强度上的统一改变，而不同发射峰之间的强度比率始终是固定不变的。研究表明，同一激发下不同发射的比率是由纳米材料的结构和元素掺比等自身条件所决定的固有属性。因此，比率不可协调的缺陷造成了上转换纳米材料用作检测探针方面的巨大限制。在先前的报道中，研究人员为了降低检测极限，就必须尽可能地将检测信号调低，但是由于比率固定，随之作为参比的信号也会大幅降低强度，使得参比精准度下降，无法保证有效性和准确度，加大了探针实际使用的困难，不利于发展检测应用。

技术实现要素：

基于上述现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供一种比率可任意调节的比率荧光检测方法，以期提高比率荧光检测的灵敏度。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种比率可任意调节的比率荧光检测方法，其包括如下步骤：

步骤1、设置激发光调控的纳米探针，所述纳米探针中含有可识别待测物的特异性分子；

所述纳米探针在第一激发光激发下的发射波长为a，在第二激发光激发下的发射波长为b；通过调节第一激发光和/或第二激发光的强度，可以任意调节纳米探针在相同条件下的荧光比率i，所述荧光比率为纳米探针在第一激发光激发下所产生的发射波长为a的荧光的强度ia与在第二激发光激发下所产生的发射波长为b的荧光的强度ib的比值，i＝ia/ib；

步骤2、将纳米探针加入到待测样本中，使待测物与纳米探针中的特异性分子反应，从改变纳米探针在第一激发光激发下所产生荧光的强度ia；

步骤3、根据所需荧光比率确定第一激发光和第二激发光的强度，然后按照所确定的强度依次用第二激发光和第一激发光对反应后纳米探针进行激发，并收集相应荧光信号的强度；

步骤4、根据步骤3所收集到的两荧光信号的强度，计算获得荧光比率，用于表征待测样本中待测物的浓度。

进一步地，本发明所述的纳米探针由激发光调控的稀土上转换纳米颗粒和包覆在所述稀土上转换纳米颗粒外的介孔二氧化硅层构成；所述介孔二氧化硅层的介孔内部负载有可识别待测物的特异性分子。所述激发光调控的稀土上转换纳米颗粒在980nm激光激发下发射出红色荧光，在808nm激光激发下发射出绿色荧光。

更进一步地，所述稀土上转换纳米颗粒为3层壳核结构，从内向外依次为激活剂层、能量传递剂层和敏化剂层，其化学表达式为：naerf4:yb,tm@nayf4:yb@nandf4:yb，即是以yb和tm共掺杂的naerf4纳米颗粒内核naerf4:yb,tm为激活剂层，在所述内核外依次包覆有作为能量传递剂层的yb掺杂的nayf4第一壳层nayf4:yb、作为敏化剂层的yb掺杂的nandf4第二壳层nandf4:yb。

进一步地，本发明通过替换纳米探针中的特异性分子，可实现与特异性分子有对应识别关系的不同待测物的检测。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明的比率荧光检测方法利用的是双激发上转换材料，其在两种不同激发光的激发下会产生相互独立、互不干扰的两种发射，以这两波长处的荧光强度比值作为信号参量来检测目标物，二者的荧光比率可任意调节，在降低检测信号强度的同时，仍可保留高强度的参比信号，因此可以同时降低检测限并保证参比的准确性，极大提高检测方法的综合适用性。

附图说明

图1为实施例1步骤1所得稀土上转换纳米颗粒在980nm激光激发下的荧光图谱；

图2为实施例1步骤1所得稀土上转换纳米颗粒在808nm激光激发下的荧光图谱；

图3为实施例1步骤1所得稀土上转换纳米颗粒的电镜图；

图4为实施例1所得纳米探针的tem图；

图5为实施例1中通过分别调节808nm、980nm激发光瓦数并通过手机系统拍摄获得的发光比率r的五种比率(分别为4：1、2：1、1:1、1:2、1:4的)照片(转为灰度照片)；

图6为实施例1在相同no浓度变化梯度下三种比率相对猝灭对比图；

图7为实施例1以1:4(图7(a))和1:2(图7(b))比率建立的0-25ppb浓度no与比率变化的对应关系；

图8为实施例1根据1:2比率条件检测哮喘病人呼出气的结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，下述实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例提供一种用于检测no的纳米探针及其检测方法：

一、纳米探针

本实施例的纳米探针，由激发光调控的稀土上转换纳米颗粒和包覆在稀土上转换纳米颗粒外的介孔二氧化硅层构成；其中：激发光调控的稀土上转换纳米颗粒在980nm激光激发下的发射波长为660nm(红色荧光)，在808nm激光激发下的发射波长为540nm(绿色荧光)；介孔二氧化硅层的介孔内部负载有光敏分子罗丹明螺环内酰胺rdms。rdms可与no发生快速反应，改变rdms化学结构，变更rdms的光敏性质，在808nm激发光激发下与上转换纳米颗粒发生fret效应，进而影响新型探针的绿色发光，改变发光比率。

具体的，本实施例的稀土上转换纳米颗粒为3层壳核结构，从内向外依次为激活剂层、能量传递剂层和敏化剂层，其化学表达式为：naerf4:yb,tm@nayf4:yb@nandf4:yb，即是以yb和tm共掺杂的naerf4纳米颗粒内核naerf4:yb,tm为激活剂层，在所述内核外依次包覆有作为能量传递剂层的yb掺杂的nayf4第一壳层nayf4:yb、作为敏化剂层的yb掺杂的nandf4第二壳层nandf4:yb。其中，在激活剂层中，er³⁺、tm³⁺、yb³⁺的摩尔百分比为80％：0.5％：19.5％；在能量传递剂层中，y³⁺与yb³⁺的摩尔百分比为90％：10％；在敏化剂层中，nd³⁺与yb³⁺的摩尔百分比为90％：10％。

本实施例纳米探针的制备方法为：首先通过晶种法制备激发光调控的稀土上转换纳米颗粒，然后通过溶胶凝胶法在稀土上转换纳米颗粒外包覆介孔二氧化硅层；再通过物理吸附法在介孔二氧化硅层的介孔内部负载rdms分子，即获得纳米探针。具体步骤如下：

1、通过晶种法制备激发光调控的稀土上转换纳米颗粒naerf4:yb,tm@nayf4:yb@nandf4:yb

(1)将醋酸铒、醋酸铥和醋酸镱共1mmol，与630mg氟化钠、10ml油酸、10ml十八烯加入到100ml的三口烧瓶a中，磁力搅拌下升温至110℃，然后抽真空10min以除去水和氧气；除尽后通n2，升温至300℃，保温反应1h；

其中，醋酸铒、醋酸铥和醋酸镱的摩尔百分比为80％：0.5％：19.5％。

(2)将0.9mmol的醋酸钇、0.1mmol的醋酸镱，与4ml油酸和4ml十八烯加入到50ml的三口烧瓶b中，磁力搅拌下升温至110℃，然后抽真空10min以除去水和氧气；除尽后通n2，升温至200℃，并在步骤(1)反应结束后，以1ml/min的速度将其注入到三口烧瓶a中，300℃保温反应40min。

(3)将0.9mmol的醋酸钕、0.1mmol的醋酸镱，与4ml油酸和4ml十八烯加入到50ml的三口烧瓶c中，磁力搅拌下升温至110℃，然后抽真空10min以除去水和氧气；除尽后通n2，升温至200℃，并在步骤(2)反应结束后，以1ml/min的速度将其注入到三口烧瓶a中，300℃保温反应40min；

反应结束后，冷却至室温，然后加乙醇离心分离，即获得目标产物稀土上转换纳米颗粒。

2、通过溶胶凝胶法在稀土上转换纳米颗粒外包覆介孔二氧化硅层

(1)将200mgctab与0.2mmol稀土上转换纳米颗粒分散在装有20ml纯水的250ml单口烧瓶中，50℃搅拌过夜。

(2)将30ml纯水、5ml乙醇、0.5ml氢氧化钠加入到上述烧瓶内，50℃继续反应10分钟后，加入0.2mlteos和0.1mlaps，70℃反应1h。反应结束后，吸出烧瓶内液体并离心，得到包覆二氧化硅层的稀土上转换纳米颗粒。

(3)使用250ml单口烧瓶，将得到的包覆二氧化硅层的稀土上转换纳米颗粒再次分散在溶解了500mg硝酸铵的50ml乙醇中，室温下搅拌2h，反应结束后离心，即获得包覆介孔二氧化硅层的稀土上转换纳米颗粒。

3、通过物理吸附法在介孔二氧化硅层的介孔内部负载rdms分子

(1)通过化学合成制备rdms

将1g罗丹明b和0.5g邻苯二胺以及50ml二氯甲烷加入到250ml单口烧瓶中，超声使罗丹明b和邻苯二胺溶解于二氯甲烷。取1ml三乙胺和1ml1-丙基磷酸环酐加入到溶液中，室温搅拌反应24h。反应结束后，将所得溶液用硅胶粉吸附，使用柱层析技术进行分离，得到淡黄色透明液体并烘干，即获得产物rdms，为白色或淡黄色粉末。

(2)使用100ml单口烧瓶，将20mgrdms超声溶解于20ml乙醇中。取0.1mmol包覆介孔二氧化硅层的稀土上转换纳米颗粒，分散在上述乙醇溶液中，超声1h后，室温下搅拌1d。

(3)搅拌结束后离心，取沉淀物，使用适量乙醇再次分散沉淀后离心清洗。将清洗后所得沉淀物放入烘箱50℃干燥2h，即获得介孔内部负载rdms分子的稀土上转换纳米探针。

图1为本实施例步骤1所得稀土上转换纳米颗粒在980nm激光激发下的荧光图谱，从图中可以看出样品的主要发射峰～660nm，对应红色荧光。

图2为本实施例步骤1所得稀土上转换纳米颗粒在808nm激光激发下的荧光图谱，从图中可以看出样品的主要发射峰～540nm，对应绿色荧光。

图3为本实施例步骤1所得稀土上转换纳米颗粒的tem图，从图中可以看出样品呈哑铃型。

图4为本实施例所得纳米探针的tem图，从图中可以看出二氧化硅层包覆成功，且包覆层中的介孔通道清晰可见。

通过调节808nm激发光的瓦数和/或980nm激发光的瓦数，可以任意调节本实施例所得纳米探针在相同条件下的荧光比率i＝i540nm/i660nm。如在980nm激发光瓦数不变条件下，通过调节808nm激发光的瓦数使纳米探针的荧光比率i分别为1:1、1:2、1:4；在808nm激发光瓦数不变条件下，通过调节980nm激光的瓦数使纳米探针的荧光比率i分别为2:1、4:1。相应强度激发光下所产生绿色荧光和红色荧光的照片分别如图5所示，图中照片虽转为灰度照片，但从图中可清楚看出绿色、红色荧光的强度变化。

二、no检测

为便于使用，首先利用上述的纳米探针构建用于检测一氧化氮的荧光试纸，具体如下：

(1)将滤纸切成大小合适的矩形试纸条，在分散有上述纳米探针的pbs溶液(探针浓度为1mm)中浸泡，多次超声，涡旋，然后静置浸泡过夜；

(2)将烘箱设置为50℃，将浸泡过夜的试纸放入，使其完全干燥，备用。

利用上述试纸检测一氧化氮的方法如下：

步骤1、配置一系列不同浓度的no标准工作气体，将荧光试纸置于标准工作气体中充分反应，然后取出；

步骤2、根据所需荧光比率确定808nm激发光和980nm激发光的强度；将反应后荧光试纸置于黑暗环境中，先以980nm激发光照射反应后荧光试纸，使反应后荧光试纸发射出红色荧光，以滤光片过滤980nm激发光后，通过手机拍摄试纸的荧光照片并获得照片的灰度值(用于标准荧光强度)，记为i红；然后再以808nm激发光照射反应后荧光试纸，使反应后荧光试纸发射出绿色荧光，以滤光片过滤808nm激发光后，通过手机拍摄试纸的荧光照片并获得照片的灰度值，记为i绿；计算获得荧光比率r：r＝i绿/i红；

步骤3、按照步骤2的方法，获得与不同浓度的no标准工作气体反应后的荧光试纸的发光比率，然后以发光比率为纵坐标、以no浓度为横坐标，绘制标准工作曲线；

步骤4、将荧光试纸置于待测气体中充分反应，然后取出，并按步骤2相同的方法获得与待测气体反应后的荧光试纸的发光比率，再根据步骤3的标准工作曲线，确定待测气体中no的浓度。

具体实施中，照片的灰度值可通过imagej软件分析获得，980nm激光和808nm激光可通过便携式980nm/808nm激光器产生，所用滤光片可透过400-700nm光。

图6为本实施例在相同no浓度变化梯度下三种比率相对猝灭对比图。从图中可看出：随着绿红比率的下降，同样浓度的no使探针相对猝灭程度增大，证明比率的降低可以进一步提高检测的灵敏度。相对猝灭程度，具体指的是单位no浓度变化引起的比率变化绝对值，这里是比率下降程度。实验方式是准备三组实验，分别用1:1、1:2、1:4比率在相同no浓度梯度下测试，获得每次检测后变化的比率，分别列表作图，计算每种比例的相对猝灭程度。

图7为本实施例以1:4(图7(a))和1:2(图7(b))比率建立的0-25ppb浓度no与比率变化的对应关系。受客观条件限制，1:4接近设备条件准许的最佳比率范围，稳定条件下1:4比率最低可以检测到0.5ppb的no浓度。1:4比率线性方程为y＝-0.1542x+25.03441，r²＝0.99978。1:2比率线性方程为y＝-0.001x+0.5，r²＝0.9931。

图8为本实施例按照1:2比率的980nm激光和808nm激光瓦数为激发条件下，检测哮喘病人呼出气的结果。根据文献查阅所知，一般哮喘病人由于呼吸系统炎症反应使得呼出气体中含有一定量的no，大致范围处于35到数百ppb范围内，考虑到1:4比率条件下的量程(1:4初始比率为25％，每25ppbno使比率下降约3.85％，至多可检测约160ppbno)，可能无法满足实验需要，故这里采用量程更大(1:2初始比率为50％，每25ppbno下降比例约2.5％，至多可检测约500ppbno)的1:2比率继续测试。从医院找到11位哮喘患者作为实验志愿者，采集11位病人同等体积呼出气，通过检测系统完成所有测试并计算出结果，如表1和图8所示，均符合或接近哮喘病理no参数范围。

表1

以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。