一种透射电镜样品的制备方法

1.本发明属于透射电镜技术领域，具体涉及一种透射电镜样品的制备方法。


背景技术：

2.尖孢镰刀菌是引起香蕉枯萎病的主要原因。其中1号生理小种与4号生理小种严重威胁着全球香蕉产量(siddhesh,international journal of pest management,2015,61(3):250
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263)。其土传特性使得控制甚至消灭尖孢镰刀菌变得十分困难(carvalhais,frontier in plant science,2019,10)。随着病情的发展，植株叶片开始变黄，并逐渐枯萎。伴随着病情的进一步蔓延，叶片会掉落，围着假茎形成一圈。新生叶片会出现边缘皱褶(berg,molecular plant pathology,2010,8(3))。一旦香蕉植株被尖孢镰刀菌感染，目前来说还未有有效的控制措施。这种困难是由于尖孢镰刀菌可以产生大量孢子，这些孢子可以在土壤中存活30年之久(ploetz,plant health prog,2000,10:1
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7)。现有的杀菌剂与熏蒸方法不能有效的控制尖孢镰刀菌孢子蔓延(ploetz,plant health progress,2005)。
3.进一步筛选出对尖孢镰刀菌有效作用的杀菌剂，了解尖孢镰刀菌孢子的内部结构是首先需要解决的问题。liu等通过透射电镜研究空气放电对尖孢镰刀菌的活力及其超微结构的影响(liu,plant protection research,2017,147
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151)。wang等研究一株盐湖芽孢杆菌af
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1的鉴定及其抗尖孢镰刀菌活性研究(wang,journal of yunnan university,2019,41(1):164
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171)。采用透射电镜对尖孢镰刀菌孢子进行细胞内细胞器的研究。对尖孢镰刀菌孢子显微水平具有推动作用。所采用的制样方法可以有效区分细胞壁，对细胞内细胞器的区分需进一步改进。
4.在尖孢镰刀菌透射电镜的样品制备中，本发明所采用的样品制备方法未见有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种能够有效体现细胞内各细胞器反差的透射电镜样品的制备方法。
6.为了实现上述目的，本发明是采取以下技术方案实现的：
7.本发明的第一个目的是提供一种透射电镜样品的制备方法，包括以下步骤：将样品固定后用染色剂进行预染色，然后经脱水、过渡、渗透与包埋、切片、染色后得到透射电镜样品。
8.优选，所述的染色剂为质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液。
9.所述的预染色具体为：将固定后的样品置于质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液过夜，然后用磷酸钠缓冲液漂洗。
10.具体步骤如下：
11.1)戊二醛、饿酸双固定法固定：将样品用2.5％戊二醛固定液抽真空固定24小时以上，用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗，然后用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液配制的质量
分数1％的饿酸溶液后固定4小时后，用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗；
12.2)预染色：将固定后的样品置于质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液过夜，然后用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗；
13.3)脱水：将预染色后的样品依次用体积分数30％的乙醇水溶液、体积分数50％的乙醇水溶液、体积分数70％的乙醇水溶液、体积分数80％的乙醇水溶液、体积分数90％的乙醇水溶液、无水乙醇脱水，环氧丙烷置换；
14.4)过渡、渗透与包埋：将脱水后的样品依次用环氧丙烷：包埋剂体积比＝3:1混合液、环氧丙烷：包埋剂体积比＝1:1混合液、环氧丙烷：包埋剂体积比＝1:3混合液过渡，包埋剂渗透，然后将样品置于包埋管中，注满包埋剂，60℃聚合；
15.5)切片，然后置于质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液过夜，再用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗，得到透射电镜样品。
16.优选，所述的包埋剂为环氧树脂
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812，所述的样品为尖孢镰刀菌孢子。
17.本发明的第二个目的是提供一种透射电镜样品的制备方法，包括以下步骤：将样品固定后进行脱水，在脱水期间进行预染色，然后经过渡、渗透与包埋、切片、染色后得到透射电镜样品。
18.优选，所述的染色剂为体积分数70％的乙醇水溶液配制的质量分数0.5％的乙酸双氧铀溶液。
19.所述的将样品固定后进行脱水，在脱水期间进行预染色具体为：所述的将样品固定后进行脱水，在脱水期间进行预染色具体为：将固定后的样品依次用体积分数30％的乙醇水溶液脱水，体积分数50％的乙醇水溶液脱水，用体积分数70％的乙醇水溶液配制的质量分数0.5％的乙酸双氧铀溶液预染色过夜，体积分数70％的乙醇水溶液脱水，体积分数80％的乙醇水溶液脱水，体积分数90％的乙醇水溶液脱水，无水乙醇脱水，环氧丙烷置换。
20.具体步骤如下：
21.1)戊二醛、饿酸双固定法固定：将样品用2.5％戊二醛固定液抽真空固定24小时以上，用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗，然后用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液配制的质量分数1％的饿酸溶液后固定4小时后，用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗；
22.2)脱水与预染色：将固定后的样品依次用体积分数30％的乙醇水溶液脱水，体积分数50％的乙醇水溶液脱水，体积分数70％的乙醇水溶液配制的质量分数0.5％的乙酸双氧铀溶液预染色过夜，体积分数70％的乙醇水溶液脱水，体积分数80％的乙醇水溶液脱水，体积分数90％的乙醇水溶液脱水，无水乙醇脱水，环氧丙烷置换；
23.3)过渡、渗透与包埋：将脱水与预染色后的样品依次用环氧丙烷：包埋剂体积比＝3:1混合液、环氧丙烷：包埋剂体积比＝1:1混合液、环氧丙烷：包埋剂体积比＝1:3混合液过渡，包埋剂渗透，然后将样品置于包埋管中，注满包埋剂，60℃聚合；
24.4)切片，然后置于体积分数70％的乙醇水溶液配制的质量分数0.5％的乙酸双氧铀溶液预染色过夜，再用0.1m，ph 7.2的磷酸钠缓冲液漂洗，得到透射电镜样品。
25.优选，所述的包埋剂为环氧树脂
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812，所述的样品为尖孢镰刀菌孢子。
26.本发明针对尖孢镰刀菌孢子比较厚的特点，采用戊二醛、饿酸双固定法固定，并配合孢子不断均匀分散技术，使固定更加充分。本发明在戊二醛、饿酸双固定法固定后，增加过夜预染色的方法，凸显孢子细胞内各细胞器的结构。本发明和现有技术相比，具有成像清
晰，尖孢镰刀菌孢子内细胞器(尤其是线粒体)反差明显的特点。从而为进一步研究尖孢镰刀菌孢子内部结构变化提供技术支持，为后续采取有针对性尖孢镰刀菌防控策略提供微观水平基础。
附图说明
27.图1是本发明的尖孢镰刀菌孢子透射图；其中，a是实施例1的尖孢镰刀菌孢子透射整体图；图b是实施例1的尖孢镰刀菌孢子透射局部图；c是实施例2的尖孢镰刀菌孢子透射整体图；d是实施例2的尖孢镰刀菌孢子透射局部图；e是对比例1的尖孢镰刀菌孢子透射整体图；f是对比例1的尖孢镰刀菌孢子透射局部图。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
29.实施例1：透射电镜样品制备方法1
30.1.戊二醛、饿酸双固定法固定：将尖孢镰刀菌孢子用2.5％戊二醛固定液抽真空4℃固定24小时；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟；然后用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2)配制的质量分数1％的饿酸溶液4℃后固定4小时；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟。
31.2.预染色：将固定后的尖孢镰刀菌孢子置于质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液4℃过夜(12小时)；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟。
32.3.脱水：将预染色后的尖孢镰刀菌孢子依次用体积分数30％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数50％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数70％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数80％的乙醇水溶液常温(25℃)脱水20分钟，体积分数90％的乙醇水溶液常温(25℃)脱水20分钟，无水乙醇(加无水硫酸钠)常温(25℃)脱水2次，每次30分钟，环氧丙烷常温(25℃)置换2次，每次30分钟。
33.4.过渡、渗透与包埋：将脱水后的尖孢镰刀菌孢子依次用环氧丙烷：ep812树脂(环氧树脂
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812)体积比＝3:1混合液常温(25℃)过渡30分钟，环氧丙烷：ep812树脂体积比＝1:1混合液常温(25℃)过渡60分钟，环氧丙烷：ep812树脂体积比＝1:3混合液常温(25℃)过渡2小时30分钟，纯ep812树脂常温(25℃)渗透3小时，纯ep812树脂常温(25℃)渗透过夜(12小时)，纯ep812树脂常温(25℃)渗透7小时；然后将尖孢镰刀菌孢子置于包埋管中，注满纯ep812树脂，60℃聚合48小时。
34.5.切片(厚度50nm)，然后置于质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液4℃过夜(12小时)，再用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟，得到透射电镜样品，透射电镜观察(图1a和图1b)。
35.实施例2：透射电镜样品制备方法2
36.1.戊二醛、饿酸双固定法固定：将尖孢镰刀菌孢子用2.5％戊二醛固定液抽真空4℃固定24小时；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟；然后用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2)配制的质量分数1％的饿酸溶液4℃后固定4小时；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟。
37.2.脱水与预染色：将固定后的尖孢镰刀菌孢子依次用体积分数30％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数50％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数70％的乙醇水溶液配制的质量分数0.5％的乙酸双氧铀溶液4℃预染色过夜(12小时)，体积分数70％的乙醇水溶液4℃脱水2次，每次20分钟，体积分数80％的乙醇水溶液常温(25℃)脱水20分钟，体积分数90％的乙醇水溶液常温(25℃)脱水20分钟，无水乙醇(加无水硫酸钠)常温(25℃)脱水2次，每次30分钟，环氧丙烷常温(25℃)置换2次，每次30分钟。
38.3.过渡、渗透与包埋：将脱水与预染色后的尖孢镰刀菌孢子依次用环氧丙烷：ep812树脂(环氧树脂
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812)体积比＝3:1混合液常温(25℃)过渡30分钟，环氧丙烷：ep812树脂体积比＝1:1混合液常温(25℃)过渡60分钟，环氧丙烷：ep812树脂体积比＝1:3混合液常温(25℃)过渡2小时30分钟，纯ep812树脂常温(25℃)渗透3小时，纯ep812树脂常温(25℃)渗透过夜(12小时)，纯ep812树脂常温(25℃)渗透7小时；然后将尖孢镰刀菌孢子置于包埋管中，注满纯ep812树脂，60℃聚合48小时。
39.4.切片(厚度50nm)，然后置于体积分数70％的乙醇水溶液配制的质量分数0.5％的乙酸双氧铀溶液4℃预染色过夜(12小时)，再用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟，得到透射电镜样品，透射电镜观察(图1c和图1d)。
40.对比例1：现有透射电镜样品制备方法：
41.1.戊二醛、饿酸双固定法固定：将尖孢镰刀菌孢子用2.5％戊二醛固定液抽真空4℃固定24小时；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟；然后用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2)配制的质量分数1％的饿酸溶液4℃后固定4小时；用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟。
42.2.脱水：将固定后的尖孢镰刀菌孢子依次用体积分数30％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数50％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数70％的乙醇水溶液4℃脱水20分钟，体积分数80％的乙醇水溶液常温(25℃)脱水20分钟，体积分数90％的乙醇水溶液常温(25℃)脱水20分钟，无水乙醇(加无水硫酸钠)常温(25℃)脱水2次，每次30分钟，环氧丙烷常温(25℃)置换2次，每次30分钟。
43.3.过渡、渗透与包埋：将脱水后的尖孢镰刀菌孢子依次用环氧丙烷：ep812树脂(环氧树脂
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812)体积比＝3:1混合液常温(25℃)过渡30分钟，环氧丙烷：ep812树脂体积比＝1:1混合液常温(25℃)过渡60分钟，环氧丙烷：ep812树脂体积比＝1:3混合液常温(25℃)过渡2小时30分钟，纯ep812树脂常温(25℃)渗透3小时，纯ep812树脂常温(25℃)渗透过夜(12小时)，纯ep812树脂常温(25℃)渗透7小时；然后将尖孢镰刀菌孢子置于包埋管中，注满纯ep812树脂，60℃聚合48小时。
44.4.切片(厚度50nm)，然后置于质量分数0.5％的乙酸双氧铀水溶液4℃染色过夜(12小时)，用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2，4℃)漂洗6次，前4次每次15分钟，后2次每次30分钟，得到透射电镜样品，透射电镜观察(图1e和图1f)。
45.从图1a
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f可以看出，本发明在戊二醛、饿酸双固定法固定后，采用0.5％乙酸双氧铀过夜预染色后，相对于现有技术，使得孢子内细胞器差异更加显著，尤其是线粒体，可以更好的研究尖孢镰刀菌内部结构，为后期尖孢镰刀菌防控提供微观结构。