一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的分析方法与流程

本发明涉及大麻素类物质及其代谢物检测
技术领域：
，尤其涉及一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的分析方法。
背景技术：
：根据欧洲药物和药物成瘾监测中心(emcdda)和欧洲早期预警系统(ems)监测结果，合成大麻素类化合物仍是增长速度最快的一类新精神活性物质。该类化合物是一类模拟传统毒品四氢大麻酚(δ9-tetrahydrocannabinol，thc)的衍生物，其成瘾性强、价格低廉、隐蔽性强、不易被检测，常被作为传统毒品的吸食替代品。合成大麻素类化合物的作用效力比thc强，与受体结合的亲和力比thc高80-100倍。常见急性不良反应如躁动、焦虑、高血压、精神病、心动过速、癫痫、心肌梗死、肾功能障碍等。自2004年起合成大麻素类化合物开始泛滥。近年来，在我国滥用越来越普遍，被不法分子添加在电子烟油、草药香料中。就目前来看，在我国已经被管制的合成大麻素约有50种，仍有相当多的合成大麻素类化合物没有被列入管制列表内。目前，由于合成大麻素类化合物的大量非法滥用，导致急性中毒而死亡的案件数量越来越多，各国的公共健康安全问题受到严重的威胁。近年来，已报道的合成大麻素类化合物及其代谢物的分析方法有多种。其中针对分析合成大麻素类化合物的免疫分析方法尽管有所发展，但由于特异性不足和合成大麻素的衍生物不断出现，免疫分析法仍然受到限制。已有文献报道分析尿液、血液和唾液中的合成大麻素类化合物，主要采用的分析方法有液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法等。唾液样品和血液、尿液样品相比成分更简单，且取材方便，无破坏性，得到人们的广泛关注。但这些方法大多数只能分析几种合成大麻素类化合物，且样品前处理方法耗时长。一般来说，摄入合成大麻素后，在尿液中一般检测不到合成大麻素的母体化合物。因此，摄入合成大麻素后在很大程度上依赖于代谢物的检测。毛发是检测药物滥用的重要检材。到目前为止，分析毛发中合成大麻素类化合物的相关文献还比较少，主要是用于母药，代谢物还比较少。因此，本发明的目的在于提供一种检测头发中16种合成大麻素类化合物及其代谢物的方法。技术实现要素：本发明为实现上述目的，提供了一种通过lc-ms/ms法考察了头发中16种合成大麻素类化合物及其代谢物含量的方法。头发作为生物检材，具有易采集、稳定、易保存、检测窗口长、可反映长时间内用药史等优点。头发分析经过几十年的发展，更加系统化、规范化，其结果已经可以作为法庭的参考依据。本发明提供一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的分析方法，包括如下步骤：步骤s1、配制混合对照品溶液和混合内标溶液配制，所述混合内标溶液中的内标为(±)-11-nor-9-羧基-δ9-四氢大麻酚-d3和jwh-018n-(4-hydroxypentyl)metabolite-d5；步骤s2、取经过前处理的待测毛发样本和空白毛发样本配制待测样品溶液和标准浓度的待测标准曲线溶液；步骤s3：分别对待测样品溶液和标准浓度的待测标准曲线溶液进行液相色谱-串联质谱分析，以每个分析物在毛发中的质量浓度为横坐标，以分析物的定量离子与内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算待测毛发样本中头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的含量。优选地，所述16种合成大麻素类物质及其代谢物为5f-mdmb-pica、4f-mdmb-butinaca、5f-cumyl-pinaca、mdmb-4en-pinaca、5f-adb、4f-mdmb-bica、cumyl-4cn-binaca、adb-butinaca、5cl-apinaca、5cl-ab-pinaca、5f-amb-pica、amb-4en-pica、5f-mpp-pica、3,5-ab-chmfuppyca、eg-018、amb-fubica、5f-mdmb-picametabolite2、5f-mdmb-picametabolite7、5f-adbmetabolite2和mdmb-4en-pinacabutanoicacid。其中，(±)-11-nor-9-羧基-δ9-四氢大麻酚-d3为5f-mdmb-pica、4f-mdmb-butinaca、5f-cumyl-pinaca、mdmb-4en-pinaca、5f-adb、4f-mdmb-bica、cumyl-4cn-binaca、adb-butinaca、5cl-apinaca、5cl-ab-pinaca、5f-amb-pica、amb-4en-pica、5f-mpp-pica、3,5-ab-chmfuppyca、eg-018、amb-fubica的内标，jwh-018n-(4-hydroxypentyl)metabolite-d5为5f-mdmb-picametabolite2、5f-mdmb-picametabolite7、5f-adbmetabolite2和mdmb-4en-pinacabutanoicacid的内标。优选地，步骤s3中，液相色谱条件如下：色谱柱：watersacquityhsst3column，100mm×2.1mm，1.8μm；流动相a：20mmol/l乙酸铵缓冲溶液含0.1％甲酸，流动相b：乙腈；采用流动相a和流动相b不同体积混合，进行梯度洗脱；流速：0.3ml/min。进一步地，所述梯度洗脱的具体过程如下：在0～1分钟中，流动相a和流动相b的体积比保持50:50不变；1～6分钟中，流动相a和流动相b的体积比由50:50匀速渐变至10:90；在6～9分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持10:90不变；在9～9.1分钟内，流动相a和流动相b的体积比由10:90匀速渐变至50:50；在9.1-10分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持50:50不变。优选地，步骤s3中，质谱条件如下：检测系统为电喷雾离子器质谱的正离子模式检测，选择离子监测模式，采用analystsoftware1.5多工作站进行数据收集和分析，多离子模式监测，质谱仪离子源温度为500℃，直接进样后进行母离子和子离子，以及去簇电压和碰撞能的筛选以得到最大的离子强度，保持碰撞解离能量稳定。优选地，步骤s1中，所述混合对照品溶液的配制方法为：精密移取各对照品溶液适量，加甲醇稀释为质量浓度分别为5、10、25、50、100和200ng/ml的混合物对照品溶液；优选地，步骤s1中，所述混合内标溶液配制方法为：精密移取(±)-11-nor-9-carboxy-δ9-thc-d3和jwh-018n-(4-hydroxypentyl)metabolite-d5适量，加甲醇配制为质量浓度为0.4ng/ml的混合内标溶液。优选地，步骤s2中，所述前处理的具体步骤为：将毛发样本用丙酮清洗多次，吹干后用甲醇复溶，以排除外部污染因素，室温下干燥得到洗净的毛发样本；用剪刀将所述洗净的毛发样本剪成1-2mm。优选地，步骤s2中，所述待测样品溶液的配制方法：精密称取经过前处理的待测毛发样本20mg置于2ml含研磨珠的研磨管中，加入1ml所述混合内标溶液，经4℃以下研磨和超声10min后，离心取上清液，经微孔滤膜过滤得所述待测样品溶液。优选地，步骤s2中，所述待测标准曲线溶液的配制方法：精密称取经过前处理的空白头发样品20mg置于2ml含研磨珠的研磨管中，分别加入10μl不同浓度的所述混合物对照品溶液，加入1ml所述混合内标溶液，经4℃以下研磨和超声10min后，离心取上清液，经微孔滤膜过滤得所述待测标准曲线溶液。优选地，所述研磨的参数为：速度6m/s；时间20s；停留时间40s；循环10次。优选地，所述离心的参数为：离心力为13500×g，离心时间为5min。本发明提供了一种考察头发中16种合成大麻素类化合物及其代谢物的方法，填补了将头发作为生物检材用于检测新型合成大麻素类化合物及其代谢物的空缺，为司法鉴定等相关领域提供相关的技术支持。本发明采用冷冻研磨技术，使得头发样品中的合成大麻素类化合物及其代谢物得以释放，比其他碱水解、超声等方法，操作简单，耗时更短。相比较其它合成大麻素类化合物的检测方法，本发明是目前能够同时检测新型合成大麻素类化合物数目最多的方法。此外，本发明中使得1对同分异构体得到有效分离，方法简单、灵敏度高、选择性好，特别适合应用于日常案件处理。附图说明图1为各目标物在头发中质量浓度为lloq时的色谱图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。仪器：xw-80a涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)minnspin高速离心机(德国eppendorf公司)afs-10超纯水制备系统(德国merck公司)上海净信jxfsprp-cln冷冻研磨仪(上海净信有限公司)acquityuplci-class液相色谱仪(美国waters公司)串联qtrap6500plus三重四级杆线性离子阱复合质谱仪(美国sciex公司)。色谱柱：watersacquityhsst3(100mm×2.1mm，1.8μm)，预柱：watersacquityhsst3(100mm×2.1mm，1.8μm)，使用multiquant3.0.2工作站进行数据分析。药品和器材：对照品：5f-mdmb-pica、4f-mdmb-butinaca、5f-cumyl-pinaca、mdmb-4en-pinaca、5f-adb、4f-mdmb-bica、cumyl-4cn-binaca、adb-butinaca、5cl-apinaca、5cl-ab-pinaca、5f-amb-pica、amb-4en-pica、5f-mpp-pica、3,5-ab-chmfuppyca、eg-018、amb-fubica、5f-mdmb-picametabolite2、5f-mdmb-picametabolite7、5f-adbmetabolite2、mdmb-4en-pinacabutanoicacid标准品购自美国cayman化学试剂公司。氘代内标(internalstandard，is)：(±)-11-nor-9-羧基-δ9-四氢大麻酚-d3[即，(±)-11-nor-9-carboxy-δ9-thc-d3]和jwh-018n-(4-hydroxypentyl)metabolite-d5标准品购自美国cerliiant试剂公司。甲醇和乙腈(uplc)购自sigma-aldrich公司(st.louis,mo,usa)。甲酸铵(uplc)购自fluka(buchs,switzerland)公司。甲酸(98％,ar)及乙酸铵(uplc)购自cnw(uk)。去离子水由milli-q(millipore,ma,usa)净水系统制备。空白头发由实验室志愿者获得。微孔滤膜(国药化学试剂有限公司)。【实施例】本实施例提供了一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的快速分析方法，包括如下步骤：步骤s1、溶液配制：步骤s11、混合对照品溶液的配制：精密移取各对照品溶液适量，加甲醇稀释为质量浓度分别为5、10、25、50、100和200ng/ml的混合物对照品溶液；步骤s12、混合内标溶液配制：精密移取(±)-11-nor-9-carboxy-δ9-thc-d3和jwh-018n-(4-hydroxypentyl)metabolite-d5适量，加甲醇配制为质量浓度为0.4ng/ml的混合内标溶液。步骤s2、待测样品溶液和待测标准曲线溶液制备：步骤s21、待测样品溶液制备：精密称取经过前处理的待测毛发样本20mg置于2ml研磨管(含研磨珠)中，加入步骤s12制备的1ml混合内标溶液，然后用上海净信jxfsprp-cln冷冻研磨仪(上海净信有限公司)在4℃以下研磨，经超声10min和离心5min后，取上清液约200μl，用0.22μm的微孔滤膜(国药化学试剂有限公司)过滤，取滤液得待测样品溶液。前处理的具体步骤为：将毛发样本用丙酮清洗3次，吹干后用甲醇复溶，以排除外部污染因素，室温下干燥得到洗净的毛发样本；用剪刀将洗净的毛发样本剪成1-2mm。研磨参数：速度6m/s；时间20s；停留时间40s；循环10次。离心参数：离心力为13500×g。步骤s22、待测标准曲线溶液制备：精密称取经过前处理的空白头发样品20mg置于2ml研磨管(含研磨珠)中，分别加入10μl步骤s11中制备的质量浓度分别为5、10、25、50、100和200ng/ml的混合物对照品溶液，加入步骤s12制备的混合内标溶液1ml，然后用上海净信jxfsprp-cln冷冻研磨仪(上海净信有限公司)在4℃以下研磨，毛发样品超声10min，离心5min，上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，即得待测标准曲线溶液。前处理、研磨参数、离心参数同步骤s21。步骤s3、分别对经步骤s2中制备的待测标准曲线溶液进行液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析，以每个分析物在毛发中的质量浓度为横坐标，以分析物的定量离子与内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算待测毛发样本中头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的含量。仪器条件：色谱条件如下：色谱柱：watersacquityhsst3column(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相a：20mmol/l乙酸铵缓冲溶液含0.1％甲酸，流动相b：乙腈；流速：0.3ml/min，梯度洗脱见下表1。表1梯度洗脱程序时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)00.3505010.3505060.3109090.310909.10.35050100.35050质谱条件如下：1种内标用于计算各化合物的峰面积比，jwh-018n-(4-hydroxypentyl)metabolite-d5为合成大麻素类化合物及其代谢物的内标。检测系统为电喷雾离子器质谱(appliedbiosystems/mdssciex,toronto,canada)的正离子模式检测，选择离子监测模式，采用analystsoftware1.5(waters)多工作站进行数据收集和分析，多离子模式监测，质谱仪离子源温度为500℃，直接进样后进行母离子和子离子，以及去簇电压(declusteringpotential，dp)和碰撞能(collisionenergy，ce)的筛选以得到最大的离子强度，保持碰撞解离能量稳定。通过将各目标分析物分别直接质谱进样，依次确立了16种合成大麻素类化合物及及其代谢物和1个内标化合物的碎片离子、去簇电压、碰撞能和保留时间(见表2)，使得碎片离子有最大响应值，每个化合物通过两个碎片离子进行计算。表2各化合物质谱参数、保留时间【方法学验证】方法学验证根据毛发分析协会(thesocietyofhairtesting，soht)指导原则以及peters等的文献进行方法学验证生物药物的定量分析中，经常用到的方法学验证指标有：选择性、线性范围、检测限(limitsofdetection，lod)、定量限(limitsofquantification，loq)、精密度(日内精密度和日间精密度)、准确度(日内准确度和日间准确度)和稳定性。另外，提取回收率和基质效应等也往往为人们所需。一、选择性选择性通常通过待测空白溶液(不含任何标准品和内标)进行检测。在本实验中，将来自10位志愿者的，不含合成大麻素类化合物及其代谢物的空白头发进行分析，确保在目标组分的出峰时间内没有其他物质的干扰。此外还考察了可能的同服药物引起的干扰。待测空白溶液的配制：精密称取经过前处理的空白头发样品20mg置于2ml研磨管(含研磨珠)中，然后用上海净信jxfsprp-cln冷冻研磨仪(上海净信有限公司)在4℃以下研磨，毛发样品超声10min，离心5min，上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，即得待测空白溶液。其中前处理、研磨参数、离心参数同步骤实施例中步骤s21。结果：通过比较头发样品中各化合物的色谱图，确认内源性物质及可能的同服药物对目标物及内标无干扰。各化合物出峰时间分布在2.57-8.68min，而且其中1对同分异构体基本分离，可以分别确认峰面积。各目标物质量浓度为lloq时的色谱图见图1。二、lod和loq取空白头发加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为0.5、1、2、5、10pg/mg的质控样品，每个浓度点6份平行样品，按照实施例步骤s21中配制待测样品溶液的方法制备质控样品溶液。以信噪比s/n≥3时的质量浓度为检测限，s/n≥10时的质量浓度为定量限，且将定量限作为线性范围的最小浓度，对6份平行头发样品进行精密度和准确度实验考察。结果：6份loq质控头发样品精密度(relativestandarddeviation,rsd)小于20％，且准确度在80％-120％之间。实验结果表明，各化合物在头发中的lod为0.5-5pg/mg，lloq为1-10pg/mg，足以满足日常检案需要。实验结果见表3。三、线性以每个分析物在毛发中的质量浓度为横坐标，以分析物的定量离子与内标的峰面积比值为纵坐标，采用加权最小二乘法进行回归运算，求得线性方程，并计算相关系数(r2)。每个化合物的线性方程由5–8个点计算得到，最低浓度为loq(s/n≥10)，并确保实际样品的浓度落在线性范围内。结果：通过考察质量浓度为1、2、5、10、20、50、100、200pg/mg的头发样品，将各分析物和内标的峰面积比和浓度按照加权(1/x)最小二乘法计算，得线性回归方程及r2。结果表明，头发样品中各化合物在相应的浓度在线性范围内线性关系良好，相关系数(r2)＞0.99，结果见表3。表3各目标物在全血中的回归方程、线性范围、相关系数、lod及lloq四、精密度和准确度对loq、低、中、高四个浓度的质控样品进行精密度和准确度的考察，取空白头发加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为1、2、5、10、20、50、150pg/mg的质控样品，每个浓度点6份平行样品。按照实施例步骤s21中配制待测样品溶液的方法制备质控样品溶液。按照实施例步骤s3中方法进样分析，计算日内精密度和准确度(n＝6)。连续测定4天，计算日间精密度和准确度(n＝24)。精密度用相对标准偏差(relativestandarddeviation，rsd)表示，将质控样品与标准曲线同时测定，以当日的标准曲线计算质控样品平行样的浓度之间的接近程度，精密度考察了在同日和不同日重复实验后的变化。准确度用偏倚表示，通过线性计算浓度，比较线性计算所得值与真实值之间的百分比。结果：各化合物日内精密度为0.11％–10.9％，日间精密度为2.5％–12.6％，日内准确度为87.0％–110.7％，日间准确度为95.0％–105.9％，表明方法精密度和准确度良好。五、提取回收率和基质效应根据matuszewski等提出的方法将样品分为以下三组计算提取回收率和基质效应：ⅰ组：分别精密称取经过前处理的不同来源的头发20mg置于2ml研磨管(含研磨珠)中，分别加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为1、2、5、10、20、50、150pg/mg的质控样品，加入混合内标溶液1ml，然后用上海净信jxfsprp-cln冷冻研磨仪(上海净信有限公司)在4℃以下研磨，毛发样品研磨后超声10min，离心5min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤即得。ⅱ组：分别精密称取经过前处理的不同来源的头发20mg置于2ml研磨管(含研磨珠)中，加入混合内标溶液1ml，然后用上海净信jxfsprp-cln冷冻研磨仪(上海净信有限公司)在4℃以下研磨，毛发样品研磨后超声10min，离心5min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，分别加入混合对照品溶液适量即得质量浓度为1、2、5、10、20、50、150pg/mg的样品。ⅲ组：配制对应质量浓度为1、2、5、10、20、50、150pg/mg的混合对照品溶液。每个浓度每组各6份样品，按步骤s3中方法进样分析，记录峰面积(a)。提取回收率＝aⅰ/aⅱ，基质效应＝aⅱ/aⅲ。结果：通过记录每组相应质量浓度1、2、5、10、20、50、150pg/mg质控样品的峰面积，计算求得提取回收率和基质效应。结果各分析物的提取回收率范围为36.1％–93.3％，基质效应范围为19.1％–110.0％，其中分析物5f-mdmb-pica、4f-mdmb-bica、5f-mpp-pica在毛发基质中产生离子抑制，其me的范围为19.1％-49.9％，其它化合物基质效应均符合要求。根据相关文献报道，在毛发基质中合成大麻素类化合物发现离子抑制现象。分析物的基质效应受浓度影响大，浓度越低，越易受离子抑制影响。我们也推测在离子化过程中产生竞争关系，受分析物的理化性质的影响，5f-mdmb-pica、4f-mdmb-bica、5f-mpp-pica化合物的极性相对较小，其它化合物的极性相对较大。5f-mdmb-pica、4f-mdmb-bica、5f-mpp-pica化合物离子化效率降低，导致离子抑制。六、稳定性取空白毛发加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为1、2、5、10、20、50、150pg/mg的质控样品，每个浓度6份样品，按照实施例步骤s21中配制待测样品溶液的方法配制质控样品溶液，4℃自动进样杆下分别放置24、48h、72h后考察样品稳定性，根据随行当日标准曲线计算质控样品准确度考察方法稳定性。结果：质控样品在24h、48h、72h下稳定性的准确度分别为88.5％–108.5％、88.9％–112.6％和91.1％–113.3％。本发明采用冷冻研磨技术作为前处理方法使得头发样品中的合成大麻素类化合物及其代谢物得以释放，比其他碱水解、超声等方法，操作简单，耗时更短。相比较其它合成大麻素类化合物的检测方法，本发明是目前能够同时检测新型合成大麻素类化合物数目最多的方法。此外，本发明中使得1对同分异构体得到有效分离，方法简单、灵敏度高、选择性好，特别适合应用于日常案件处理。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页12