本发明属于生物医学
技术领域：
，具体涉及一种多细胞因子检测芯片及其应用。
背景技术：
：原发性免疫性血小板减少症(primaryimmunethrombocytopenia，itp)是最常见的出血性疾病，目前itp诊断仍然是除外性诊断：排除病毒感染、肿瘤、药物、风湿性疾病、脾功能亢进等引起的血小板减少才可以诊断为itp，仍然缺少有效的确诊方法。糖皮质激素是itp的一线治疗药物，但仅有20％-50％的患者可持续有效，大部分患者会经历病情复发，而糖皮质激素治疗带来的高血糖、高血压、骨质疏松、肥胖等健康问题持续困扰患者，临床上如能早期筛查出糖皮质激素治疗itp无效的患者，尽早停止糖皮质激素并换用二线治疗药物，将使这部分患者免于承受糖皮质激素的副反应，但目前缺少有效的检测技术预测糖皮质激素的治疗效果。与免疫有关的细胞因子主要包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核巨噬细胞产生的单核因子、白细胞介素(interleukin，il)、干扰素(interferon，ifn)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)、趋化因子(chemokine)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，tgfβ)等，它们在免疫系统中起着非常重要的调控作用，在异常情况下会导致免疫病理反应。多种免疫细胞通过多种机制参与itp发病，包括分泌多种细胞因子造成itp患者外周血细胞因子浓度呈现不同程度的升高或降低，细胞因子浓度呈现出itp特征性的改变。其他自身免疫性疾病，以系统性红斑狼疮(sle)为代表，常常伴随血小板减少，但其细胞因子浓度变化与itp变化不同。因此，根据细胞因子浓度变化对血小板减少患者的病因诊断有辅助作用。技术实现要素：本发明的第一目的是，提供一种多细胞因子检测芯片。本发明的第二目的是，提供上述多细胞因子检测芯片在鉴别和诊断原发性免疫性血小板减少症中的应用。本发明的第三目的是，提供上述多细胞因子检测芯片在预测糖皮质激素药物疗效中的应用。为实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：一种多细胞因子检测芯片，包括报告基质、蛋白探针分子和带有荧光的报告分子，其中：所述蛋白探针分子为包括细胞因子il-1β、il-18、il-36α、il-36β、il-36γ、il-33、il-5、il-10、il-13、tnf-α、ifn-γ、il-6、il-4、il-20p70、gro的蛋白探针分子，固定于所述报告基质上，所述报告分子为带有荧光且具有梯级浓度的所述细胞因子标准品混合液。优选地，所述报告基质为若干自带不同荧光且大小均一的圆形微球。为实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：所述多细胞因子检测芯片在鉴别和诊断原发性免疫性血小板减少症中的应用。优选地，所述细胞因子包括il-1β、il-18、il-36α、il-36β、il-36γ、il-33、il-5、il-10、il-13、tnf-α、ifn-γ和il-6。为实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：所述多细胞因子检测芯片在预测糖皮质激素药物疗效中的应用。优选地，所述细胞因子包括il-5、il-6、il-4、il-12p70、il-13、tnf-α、ifn-γ和gro。优选地，所述糖皮质激素药物为地塞米松。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明通过细胞因子检测可快速鉴别和诊断原发性免疫性血小板减少症与其他原因血小板减少，克服目前itp诊断缺少特异性检测手段的问题。(2)本发明的多细胞因子检测芯片可用于预测糖皮质激素药物疗效(例如预测原发性血小板减少症患者在地塞米松治疗后疗效)，根据细胞因子浓度变化即早期预测患者糖皮质激素治疗效果，对治疗无效患者可早期进入二线治疗，避免不必要的糖皮质激素暴露从而免于承受其副作用，克服目前缺少地塞米松疗效预测指标的问题。参考以下详细说明更易于理解本申请的上述以及其他特征、方面和优点。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用液相磁珠法(luminex)对il-1β、il-18、il-36α、il-36β、il-36γ、il-33、il-5、il-10、il-13、tnf-α、ifn-γ、il-6、il-4、il-20p70、gro等15个细胞因子进行检测；其中il-1β、il-18、il-36α、il-36β、il-36γ、il-33、il-5、il-10、il-13、tnf-α、ifn-γ、il-6用于itp的诊断，il-5、il-6、il-4、il-12p70、il-13、tnf-α、ifn-γ、gro用于地塞米松治疗后疗效预判。多细胞因子检测芯片包含①采用大小均一的圆形微球作为报告基质，且不同微球带有不同荧光相互区分，可与检测样品和报告分子结合；②15种分别标记il-1β、il-18、il-36α、il-36β、il-36γ、il-33、il-5、il-10、il-13、tnf-α、ifn-γ、il-6、il-4、il-20p70、gro的蛋白探针分子，固定于上述圆形微球上，可与检测样品中的特定物质结合，圆形微球自带荧光用于鉴定检测物类别；③带有荧光的报告分子，可与检测样品中的特定物质结合，其信号强度用于定量不同检测物的浓度。itp诊断：抽取患者外周血，提取血清。反应平板中每孔加入混合的微球芯片，与平板结合后洗板，加入患者血清、标准品、空白样品，孵育。之后加入蛋白探针分子，孵育后洗板。再加入报告分子，孵育，洗板后上机读取结果。如果检测样品中itp相关9个分子、6个自身免疫性疾病相关血小板减少分子，每一项细胞因子落在itp范围内则积1分，落在sle-tp检测范围内则扣1分，总分在6分以上可诊断itp。糖皮质激素药物疗效预测：患者接受大剂量地塞米松(40mg/天，共4天)治疗后第7天抽取患者外周血，提取血清后后加样至检测芯片，读取检测结果，如果8个细胞因子中有6个以上细胞因子浓度升高，可预测治疗有效。实施例1采集22例新发itp患者进行细胞因子筛检，发现itp病人的血清il-5、il-10、il-13、tnf-α、ifn-γ、il-6、il-4、il-20p70、gro水平较正常对照组显著下降，下降幅度均大于50％(表1)，证明上述细胞因子浓度可以用于itp的诊断。表1：itp病人与健康对照组血清细胞因子浓度(浓度：pg/ml)实施例2对17例itp、17例系统性红斑狼疮继发血小板减少(sle-tp)患者进行检测，来鉴别免疫性血小板减少与风湿性疾病继发的血小板减少，结果显示il-1β、il-18、il-36α、il-36β、il-36γ、il-33在itp组显著下降(表2)。表2：itp病人与sle-tp血清细胞因子浓度(浓度：pg/ml)细胞因子itp病人sle-tp病人p值il-1β3.70±2.6656.00±109.020.004il-18224.33±137.275500.64±4921.550.001il-36α56.88±94.56618.75±732.990.000il-36β3.05±8.9121.81±27.120.001il-36γ535.24±1289.801423.33±1852.640.017il-3312.82±11.5051.53±60.060.001实施例3itp患者接受地塞米松治疗后，免疫细胞功能受药物影响发生数量和功能的改变，细胞因子也随之发生改变。跟踪实施例1中22例新发itp接受地塞米松治疗的患者(基线血小板水平<30×109/l)，22例患者在治疗后获得部分缓解或完全缓解(血小板计数恢复到(94-387)×109/l)，在这些患者接受治疗的1周后检查血清细胞因子，发现il-5、il-13、tnf-α、ifn-γ、il-6、il-4、il-12p70、gro在缓解患者中显著升高，对治疗效果具有预测作用(表3)。表3：itp病人治疗前后血清细胞因子浓度(浓度：pg/ml)细胞因子itp病人治疗前itp病人治疗后p值il-5406.1±201.41195.5±717.70.002il-13106.2±63.3278.8±121.80.001tnf-α6.5±945.5±30.90.002ifn-γ43.6±25.3103.2±83.60.003il-635.4±36.5221.1±1440.001il-437.9±51.196.8±114.40.016il-20p7037.9±17.552.1±23.50.019gro269.6±188.5470.6±2900.034应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12