抗原组合在制备肺癌的检测试剂或试剂盒中的用途的制作方法

1.本发明属于疾病诊断技术领域，更具体地，本发明涉及抗原组合在制备肺癌的检测试剂或试剂盒中的用途。


背景技术：

2.肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，根据肺癌的发展又可分为i、ii、iii和iv期。肺癌的预后与诊断与临床分期密切相关，早期肺癌患者术后生存率可达90％，而ii-iv期患者则从40％骤降至5％以下。由于肺癌初期多无特异临床症状，难以察觉，出现症状而就诊的患者80％已经处于疾病晚期，失去了最佳治疗时期和手术的机会。中国肺癌的5年生存率仅为16.1％，因此肺癌的早期筛查和早期防治对于降低肺癌患者死亡率、提高患者生活质量极其重要。肿瘤早期筛查的目的在于准确地诊断出在显著症状出现之前的、尚处于发展早期的癌症，从而尽早采取治疗措施，显著提高患者的生存率。
3.目前应用于临床的肺癌诊断方法中，x射线、ct、pet等影像学方法通常只作为辅助诊断指标，而细胞学、组织病理学等确诊方法则因取材难度大而难以应用于大规模筛查。
4.在肿瘤发展的早期，肿瘤细胞产生基因突变、异位或重组，相关蛋白释放后被免疫系统识别为“非自身蛋白”作为抗原(taa)而发生免疫应答反应，产生针对该抗原的抗体，即肿瘤相关自身抗体(tab)。
5.自身抗体水平在疾病发展进程中会发生波动，同样可以应用于监测疾病进展和复发。对于一些抗癌症治疗方法，自身抗体水平的提高与癌症完全缓解相关。在使用抗ctla-4抗体治疗前列腺癌患者时，自身抗体水平提高提示患者对治疗具有较好的反应。某些自身抗体的测定也与不同疾病亚型相关，比如，在肺癌中一些自身抗体对小细胞肺癌更敏感，而另一些自身抗体对非小细胞肺癌更敏感。自身抗体同样应用于预示癌症的复发，乳头状甲状腺癌患者在接受治疗后一年内，甲状腺球蛋白自身抗体阳性提示疾病有较高的复发可能，而甲状腺球蛋白自身抗体阴性则指示患者有较好的治疗效果。
6.利用肿瘤相关自身抗体来诊断肿瘤在理论上是可行的，实践中也有一定的研究。但不同个体免疫系统的反应有所差异，如何对肿瘤自身抗体进行检测是合适的，对于疾病诊断具有较好的敏感性/特异性？这是本领域的难题。不同的肿瘤形成的自身抗体本身具有较大的差异，利用怎样的抗原才能实现特异性检测也是本领域的难题。并且，越来越多的研究显示，藉由单种自身抗体难以准确推测所有癌症的发病情况。
7.此外，尽管本领域致力于早期诊查的研究，但对于肺癌这一癌种，通过外周血、尿液等无创伤性待测样本(无需创造性手术)来实现早期诊断，具有极大的挑战，如何选择适当的标志物是本领域难题。
8.综上，开发更加经济、有效、无创伤性、易于普及的肺癌早期发现与诊断方法，势在必行。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种适合中国肺癌流行病学特征的九种肺癌相关自身抗体组合，以及简便、快捷、准确的对该组合进行联合检测，以辅助早期肺癌的诊断或/及筛查的方法。
10.在本发明的第一方面，提供抗原组合在制备检测肺癌的检测试剂、检测装置或试剂盒中的用途，该抗原组合包括以下抗原蛋白或其变体(包括异构体)或片段：ck20、imp2、ssx1、cage、p53、sox2、hud、ny-eso-1、mage a4；其中，所述的试剂、检测装置或试剂盒是检测肺癌相关自身抗体的试剂、检测装置或试剂盒。
11.在一个优选例中，所述检测试剂、检测装置或试剂盒是用于检测待测样本中肺癌相关自身抗体存在情况或存在量的检测试剂、检测装置或试剂盒；较佳地，所述的检测试剂、检测装置或试剂盒为适于酶联免疫法、可见光比色法、荧光发光法或化学发光法的试剂。
12.在另一优选例中，所述的检测试剂、检测装置或试剂盒是以血清、血浆、组织或细胞为待测样品的检测试剂、检测装置或试剂盒。
13.在另一优选例中，所述检测肺癌包括：肺癌筛查、辅助诊断和/或预后。
14.在另一优选例中，所述抗原组合中，各个抗原被集成于(如包被于)一固相载体上；较佳地，所述固相载体包括(但不限于)：微孔板、磁微粒、微球、塑料珠、液相芯片、微流控芯片、玻片或亲和膜。
15.在另一优选例中，所述肺癌为原发性肺癌，包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌及其他少见类型原发性肺癌；或者，包括(但不限于)0期、i期、ii期、iii期肺癌；处于无明显的身体不适阶段的肺癌；病灶体积小的肺癌。
16.在另一优选例中，所述抗原蛋白cage为全长cage蛋白或其氨基酸序列第1-232位氨基酸的片段。
17.在本发明的另一方面，提供一种用于检测肺癌的检测装置(如检测板)，所述检测装置包括：固相载体，以及集成于(如包被于)该固相载体的抗原蛋白，包括以下抗原蛋白或其变体(包括异构体)或片段：ck20、imp2、ssx1、cage、p53、sox2、hud、ny-eso-1、mage a4；其中，所述检测肺癌是检测肺癌相关自身抗体。
18.在一个优选例中，所述抗原蛋白cage为全长cage蛋白或其氨基酸序列第1-232位氨基酸的片段。
19.在另一优选例中，所述固相载体包括(但不限于)：微孔板、磁微粒、微球、塑料珠、液相芯片、微流控芯片、玻片或亲和膜。
20.在另一优选例中，所述抗原蛋白的包被浓度(包被时的溶液浓度)为20～500nm(如30、50、80、100、150、200、250、300、400nm)。
21.在另一优选例中，所述的固相载体为微孔板，较佳地为96孔板，其中9列包被有所述抗原蛋白ck20、imp2、ssx1、cage、p53、sox2、hud、ny-eso-1、mage a4(九种)，3列包被有空载体蛋白，以并行检测对应的肺癌相关自身抗体。
22.在本发明的另一方面，提供一种用于检测肺癌的试剂盒，其中包括：检测试剂或检测装置，其是检测以下抗原蛋白或其变体(包括异构体)或片段的检测试剂或检测装置：ck20、imp2、ssx1、cage、p53、sox2、hud、ny-eso-1、mage a4；其中，所述检测肺癌是检测肺癌
相关自身抗体。
23.在一个优选例中，所述的用于检测肺癌的试剂盒中包括前面任一所述的检测装置。
24.在另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)：稀释液(如样本和抗体稀释液)、第二抗体、洗涤液、人源化标签肽抗体校准品、人源化标签肽抗体质控品、底物、终止液、发光液。
25.在另一优选例中，所述第二抗体带有可检测的标记物。
26.在另一优选例中，所述第二抗体为抗人igg抗体。
27.在另一优选例中，所述试剂盒中还包括使用说明书。
28.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
29.图1、9种抗原检测癌症患者和健康人血液中相应自身抗体效果图。
30.图2、9种肺癌相关自身抗体联合检测肺癌患者和健康人roc曲线。
31.图3、用于联合检测肺癌相关自身抗体的酶联免疫板抗原蛋白一种排布示意图，抗原蛋白p53、sox2、ssx1、hud、ny-eso-1、cage、mage a4、ck20、imp2分别包被96孔微孔板中9列，空载体蛋白(vob)包被96孔微孔板中3列，空载体蛋白可以位于酶联免疫板的左边或右边。
32.图4、酶联免疫板加样检测排布示意图。
具体实施方式
33.本发明人经过深入的研究，揭示了一种优选的抗原组合，其可被应用于检测肺癌相关自身抗体，且具有良好的检测特异性以及敏感性。该抗原组合包括抗原ck20、imp2、ssx1、cage、p53、sox2、hud、ny-eso-1、mage a4。本发明也优化设计了检测试剂、检测装置或试剂盒，可针对无创伤性的样本如血清或血浆进行检测，大大提高了肺癌诊断的便利性，有助于肺癌筛查、辅助诊断和/或预后。
34.如本文所用，“待测样本”或“待测样品”是指待检测的样本。本发明中，所述的待测样本可以是：血清，血浆，取自病变部位的组织，肺泡灌洗液，胸水，痰液等；优选地为血清或血浆。
35.如本文所用，“诊断”一词是指本领域技术人员用以评估及/或决定一个体罹患一特定疾病、病症或症征的可能性的方法。“诊断”一词也包含侦测罹患一疾病、病症或症征的倾向，决定一药物治疗的治疗功效，或是预测对药物治疗的反应。本揭示内容的诊断方法可单独进行，或与其他用以分析疾病、病症或症征的诊断及/或分期方法同时进行。
36.在广泛研究筛选和反复试验的基础上，本发明人发现在临床肺癌的诊断中，以肺癌自身抗体为靶标，联合运用一系列抗原，可以极为有效地提高肺癌诊断的准确性、敏感性。具体地，本发明公开了一个九种肺癌相关自身抗体的组合及其联合检测方法，该九种肺癌相关自身抗体组合包括p53、sox2、ssx1、hud、ny-eso-1、cage、mage a4、ck20、imp2。
37.在肿瘤发展的早期，肿瘤细胞产生基因突变、异位或重组，相关蛋白释放后被免疫
系统识别为“非自身蛋白”作为抗原而发生免疫应答反应，产生针对该抗原的抗体，即肿瘤自身抗体。自身抗体以游离或与相关抗原结合成抗原-抗体复合物的形式存在于体内循环。但不同个体免疫系统的反应有所差异，单个自身抗体难以准确推测所有肺癌的发病情况。本发明中，确定了若干种适用于肺癌检测的抗原，构成抗原组合，利用该抗原组合来检测肺癌自身抗体。本发明人发现，这种检测方法具有相对高的特异性和敏感性，有助于在临床上实现更为早期的肿瘤筛查。与传统的影像学诊断出癌细胞相比，本发明的方法可提前在血液中检测出癌症自身抗体水平的升高。
38.基于本发明人的上述新发现，提供了抗原组合在制备检测肺癌的检测试剂、检测装置或试剂盒中的用途，该抗原组合包括以下抗原蛋白或片段：ck20、imp2、ssx1、cage、p53、sox2、hud、ny-eso-1、mage a4；其中，所述的试剂或试剂盒是检测肺癌相关自身抗体的试剂或试剂盒。
39.本发明中，所述的p53，其氨基酸序列可以如seq id no:1所示；所述的sox2，其氨基酸序列可以如seq id no:2所示；所述的ssx1，其氨基酸序列可以如seq id no:3所示；所述的hud，其氨基酸序列可以如seq id no:4所示；所述的ny-eso-1，其氨基酸序列可以如seq id no:5所示；所述的cage，其氨基酸序列可以如seq id no:6所示；所述的mage a4，其氨基酸序列可以如seq id no:7所示；所述的ck20，其氨基酸序列可以如seq id no:8所示；所述的imp2，其氨基酸序列可以如seq id no:9所示。
40.本发明中，也包括任一所述的抗原蛋白的保守性序列变体。所述的“保守性序列变体”是指基本上保持所述抗原蛋白相同的生物学功能或活性的抗原蛋白。所述的“保守性序列变体”可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的抗原蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的抗原蛋白，或(iii)成熟抗原蛋白与另一个化合物融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列，或与抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。通常，所述片段、衍生物和类似物中包括抗原的抗原决定簇。
41.所述的“保守性序列变体”可以包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，最佳地1-5个，如3、2或1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(如20个以内，较15个或10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述的类似物。这些类似物与天然抗原蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些抗原蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。
42.根据本发明，用于cage自身抗体检测的抗原蛋白为全长cage蛋白或其第1-232位的氨基酸片段。在一些优选方式中，使用其第1-232位的氨基酸片段。
43.所述的抗原蛋白还可含有一个或多个蛋白片段，作为蛋白标签。例如，所述的标签可以是flag、ha、ha1、c-myc、poly-his、poly-arg、bira、strep-tagii、au1、ee、t7、4a6、ε、b、ge、ty1等。
44.本发明基于间接酶联免疫法的原理，设计了可用于辅助肺癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测的试剂。间接酶联免疫法的原理是将肺癌相关自身抗体对应抗原蛋白连接到固相载体上，样品中待测自身抗体与之结合成固相抗原-受检自身抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检自身抗体复合物中的自身抗体结合，形成固相抗原-受检自身抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的吸光度，确定待测自身抗体水平。
45.作为本发明的优选方式，所述检测采用的信号检测方法包括可见光比色法、荧光发光法、化学发光法。
46.作为本发明的优选方式，所述抗原蛋白以50nm、100nm、160nm、200nm四种浓度中的一种或两种固定于固相载体，不同抗原蛋白所采用的的浓度既可相同，亦可不同。
47.作为本发明的优选方式，优选地，利用共价固定方式将这九种肺癌相关自身抗体对应的检测抗原蛋白固定在固相载体表面，以特定浓度的人抗标签肽作为定量检测的校准品，采用比色法/荧光法/化学发光检测信号强度，从而实现这九种肺癌相关自身抗体的联合检测。
48.本发明适用于多种多样的待测样品，作为本发明的优选方式，所述的检测对象为人血清或血浆。血清(或血浆)稀释液或原液被用于检测自身抗体水平。
49.基于本发明的新发现，也提供了一种兼具较高灵敏性和高特异性的测肺癌的试剂盒。
50.在本发明的优选实施方式中，所述的检测肺癌的试剂盒中，包括包被有所述抗原蛋白的固相载体。该检测试剂盒可设计为适于可见光比色法、荧光发光法或化学发光法检测。
51.根据本发明，所述固相载体可以是但不限于：磁微粒、微球、塑料珠、液相芯片、微孔板、亲和膜、玻片或试纸等。作为本发明的优选方式，采用共价固定方式将抗原蛋白固定于固相载体。较佳地，通过将抗原包被于微孔板来实现可见光比色法、荧光发光法和/或化学发光法检测检测，例如96孔板。
52.作为本发明的优选方式，当使用微孔板作为固相载体时，优选96孔板，9列用于包被所述9种不同的肿瘤自身抗体对应抗原蛋白，3列包被抗原表达对应的空载体蛋白，以并行检测对应的9种肺癌相关自身抗体。
53.根据本发明，所述抗原蛋白的固定方法包括直接包被法和间接包被法。在本发明的具体实施例中，将抗原与edc-sulfonhs预混液混合、孵育，从而活化抗原，之后加入到固相载体中，孵育、封闭。此外，间接包被法例如通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原蛋白间接固定于固相载体上。
54.根据本发明，所述试剂盒还包括：稀释液(如样本和抗体稀释液)、第二抗体、洗涤液、人源化标签肽抗体校准品、人源化标签肽抗体质控品、底物、终止液、发光液等。优选的，所述第二抗体带有可检测的标记物；所述可检测的标记物优选为辣根过氧化物酶；进一步地，所述第二抗体优选为抗人igg抗体。
55.本发明的主要有益效果如下：
56.1、免疫系统针对抗原产生免疫反应起到信号放大的作用，使自身抗体浓度较相应抗原浓度更高，自身抗体不受多种蛋白酶解作用，可以在血液中稳定存在较长时间，自身抗体较抗原更易于在早期被检测；
57.2、利用9种肿瘤相关自身抗体进行并行检测，根据其联合变化对肿瘤进行预测，操作简单，节省人力和时间，提高了工作效率，降低同时检测多种肿瘤相关自身抗体的费用；
58.3、联合检测9种肺癌相关自身抗体，提高检测的灵敏度和准确性。
59.4、所设计的96孔板抗原及空载体蛋白，既适用于酶联接免疫吸附剂测定，也适用于板式化学发光免疫测定。
60.5、使用全长或片段性抗原蛋白检测相应的自身抗体，提高检测效果及稳定性。
61.6、每种自身抗体使用有针对性的、优化过的检测抗原浓度，已达成各个自身抗体的检测对线性范围的不同要求。
62.7、本发明的方法和试剂盒特别适合于肺癌诊断，特别是早期诊断，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、检测周期短等特点。可有效提高检测准确率，并减少结果的假阴性；本发明的实施例中，呈现了本发明方法和试剂盒在于早期、体积微小的肿瘤的诊断具有良好的灵敏度和准确性。
63.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
64.实施例1、共价固定有抗原蛋白的微孔板的制备
65.共价固定抗原蛋白至96孔微孔板的方法如下：
66.(1)制备抗原
67.大肠杆菌表达带有标签(利用pet28b载体重组表达，带有纯化标签his-tag)的重组蛋白p53、sox2、ssx1、hud、ny-eso-1、cage、mage a4、ck20、imp2和空载体蛋白(vob)，纯化目的蛋白作为抗原。
68.各个重组蛋白抗原的序列如下：
69.p53(人，393aa，seq id no:1)
[0070][0071]
sox2(人，317aa，seq id no:2)
[0072][0073][0074]
ssx1(人，188aa，seq id no:3)
[0075][0076]
hud(人，380aa，seq id no:4)
[0077][0078]
ny-eso-1(人，180aa，seq id no:5)
[0079][0080]
cage(人，631aa，seq id no:6；其中下划线为其1-232位片段)
[0081][0082]
mage a4(人，317aa，seq id no:7)
[0083][0084]
ck20(人，423aa，seq id no:8)
[0085][0086][0087]
imp2(人，556aa，seq id no:9)
[0088][0089]
(2)表面活化和aptes功能化
[0090]
37℃条件下，微孔板每孔使用100μl 1％koh处理10min，每孔使用300μl去离子水洗涤，重复5次。然后室温条件下，通风橱中使用100μl 2％aptes孵育1小时，每孔使用300μl去离子水洗涤，重复5次。
[0091]
(3)抗原固定和bsa封闭
[0092]
利用5μl edc(8mg/ml)与5μl sulfonhs(22mg/ml)混合制备10μl edc-sulfonhs预混液，990μl选定浓度的抗原与10μl edc-sulfonhs预混液在37℃孵育15min。
[0093]
edc-sulfonhs活化的抗原，按照图3所示排布，加至aptes功能化的微孔中，37℃孵育1小时，300μl pbs(0.1m，ph 7.4)洗涤，重复5次。每孔使用300μl 1％bsa于37℃封闭30min，300μl pbs(0.1m，ph 7.4)洗涤，重复3次。
[0094]
实施例2、用于检测肺癌相关自身抗体的联合检测试剂的制备
[0095]
根据实施例1所述，制备了共价固定有所述抗原蛋白的微孔板。结合实施例1、图3以及其它所需的检测试剂来制备检测试剂盒，其中含有如下检测试剂：
[0096]
1、实施例1的可与肺癌相关自身抗体结合的抗原蛋白(p53、sox2、ssx1、hud、ny-eso-1、cage或其片段(cage的第1-232位氨基酸的片段)、mage a4、ck20、imp2)及空载体蛋白(vob)包被的微孔板；
[0097]
2、人源化标签肽抗体校准品(商品化人源anti-his抗体)；
[0098]
3、高浓度(浓度为220ng/ml)和低浓度(浓度为22ng/ml)的人源化标签肽抗体质控品；
[0099]
4、辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗人igg抗体；
[0100]
5、底物：tmb溶液；
[0101]
6、终止液：naf终止液；
[0102]
7、样本和抗体稀释液：含有0.1％(w/v)酪蛋白的pbst缓冲液；
[0103]
8、浓缩洗涤液：含有0.5％吐温-20的10
×
pbst缓冲液；
[0104]
9、封板膜。
[0105]
上述全部或部分试剂(如1～3的试剂)置于一个包装中，获得检测试剂盒。
[0106]
实施例3、九种肺癌相关自身抗体的联合检测方法
[0107]
1.校准品和样品准备
[0108]
本发明人取已知浓度的人源化抗体与稀释液配比稀释，得到一系列不同浓度的校准品c1-c6(浓度依次为330、110、36.7、12.2、4.1、1.4ng/ml)；
[0109]
取部分血浆使用样本稀释液稀释100倍，用于检测肺癌相关自身抗体。
[0110]
2.检测自身抗体
[0111]
2.1检测校准品及待测样本
[0112]
2.1.1将微孔板于室温平衡1h后，按照图4所示排布、每板检测8个样品。分别在微孔板样品检测孔加入稀释后样本各100μl，在校准品检测孔加入校准品c1-c6各100μl，在质控品检测孔分别加入高浓度质控品和低浓度质控品各100μl；
[0113]
2.1.2贴上封板膜，将微孔板放置于微孔板振荡器上，400rpm孵育90分钟(室温18-22℃)；
[0114]
2.1.3小心地移除微孔板上的封板膜，甩去其中的液体，在干净的吸水纸上拍干，将微孔板放入自动洗板机中，用配制好的洗涤工作液洗板3次(300μl/孔)，最后在干净的吸水纸上拍干；
[0115]
2.1.4采用8通道移液器，向每个反应孔中加入稀释好的二抗工作液各100μl，贴上封板膜，将微孔板放置于微孔板振荡器上，400rpm孵育60分钟(室温18-22℃)；
[0116]
2.1.5移除微孔板上的封板膜，甩去其中的液体，在干净的吸水纸上拍干，将微孔板放入自动洗板机中，用配制好的洗涤工作液洗板3次(300μl/孔)，最后在干净的吸水纸上拍干；
[0117]
2.1.6采用8通道移液器，向每个反应孔中加入底物各100μl；
[0118]
2.1.7避光放置15分钟(室温18-22℃，需要准确计时)，期间轻柔晃动反应板，使显示的蓝色在反应孔内分布均匀；
[0119]
2.1.8采用8通道移液器，向每个反应孔中加入终止液各100μl，终止显色反应；
[0120]
2.1.9反应终止后，将微孔板放入酶标仪中，确保a1孔均位于左上角，读取od
650
值，保存od
650
数据。
[0121]
2.2绘制校准曲线并计算样本中自身抗体水平
[0122]
以校准品抗体浓度为横坐标，对应的od
650
值为纵坐标，绘制剂量-效应曲线并计算校准曲线回归方程。
[0123]
同一血浆样本中9个抗原检测的od
650
值分别减去对应的背景od
650
值，得到9个抗原的绝对od
650
值，将绝对od
650
值代入校准曲线回归方程计算样本中针对此抗原的自身抗体相对浓度值(ru)。
[0124]
实施例4、使该联合检测方法检测肺癌患者和健康人样本中肺癌相关自身抗体水平
[0125]
1、样本准备
[0126]
收集128例早期肺癌患者的血浆(肺癌组)，以及128例健康人的血浆(对照组)。所有肺癌患者经ct检测显示结节小于20mm，经病理诊断确诊为早期肺癌(原位(6例)、i期(55例)和ii期(67例))，肺癌患者血浆均在患者接受任何放化疗前采集。
[0127]
健康人血浆来自健康体检人群，无任何恶性肿瘤相关疾病。
[0128]
后续检测中，以所采集的血浆作为待测样本。
[0129]
2、利用重组蛋白p53、sox2、ssx1、hud、ny-eso-1、cage、mage a4、ck20、imp2和空载体蛋白(vob)包被的检测板的检测
[0130]
采用本发明的实施例2所述的试剂和实施例3所述的检测方法分别对128例肺癌患者血浆和128例健康人血浆中的9种肺癌相关自身抗体水平进行检测。
[0131]
9种抗原单独被用于检测癌症患者和健康人血液中相应自身抗体测定结果如图1，可见当它们被用于单独进行检测时，单个自身抗体在满足高特异性要求时灵敏度不够高。
[0132]
使用spss 25软件进行二元logistic回归分析和roc曲线分析，9种肺癌相关自身抗体水平为协变量，患肺癌状态为因变量，计算受试者患肺癌的预测概率，利用患肺癌状态和预测概率绘制roc曲线。
[0133]
roc曲线下面积为0.859，预测概率截断值设置为0.6951，敏感度为56.3％，特异性为92.2％。对于血浆样本(非癌组织样本)，能实现如此高的敏感度和特异性，技术效果非常理想。
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3、九抗原与六抗原/七抗原的特异性/敏感性比较
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(1)六抗原测试
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采用6个抗原包被于96孔板，检测自身抗体(待测样本为：肺癌患者和健康对照组血浆)，该6个抗原为p53，ny-eso-1，cage，gbu4-5，sox2，annexin i。
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其结果显示，敏感性和特异性分别为39％和89％。
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(2)七抗原测试
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采用7个抗原包被于96孔板，检测自身抗体(待测样本为：肺癌患者和健康对照组血浆)，该7个抗原为p53，ny-eso-1，cage，gbu4-5，mage-a4，sox2，hu-d。
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其结果显示，敏感性41％，特异性91％。
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本发明的9个抗原的组合联用、不运用gbu4-5及annexin i抗原、且运用ck20、imp2、ssx1抗原，敏感度达到56.3％，特异性达到92.2％，显著高于6个抗原/7个抗原联用的情形。
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在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。