本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种从瓮棺土样中提取羊毛角蛋白进行蛋白质组学检测的方法。
背景技术：
中国纺织品文化由来已久，从已出土的纺织品文物残片可以得知纺织品的历史至少可以追溯到5500年，而毛作为一种获取简单，性能优异的纤维材料，在中国古代纺织品中有着不可替代的地位。中国最开始的农耕文明就开始对动物的训化，在中国悠久的历史里，动物毛的利用很可能可以追溯到更加古老的时代。羊作为新石器时代就被驯服的动物，羊毛无可厚非的成为了古代人们纺织品的主要原材料之一。
羊毛作为生物的一部分，其主要成分是蛋白质，而作为有机物的羊毛织物在长时间的埋藏过程中，各种微生物、酸、碱等的侵袭中难以完整保存下来，这为探索织物起源与发展带来了非常大的挑战。如何在织物宏观特征消失的情况下确定它的存在，找到考古材料中存在的微乎其微的分子证据成为研究早期毛织物的关键。所以我们需要对仅存的蛋白质残余进行富集，用于样品需求更加微量的检测手段。
目前检测羊毛的方法有很多种，如电镜，红外，切片等，需要丝纤维保存较完整，所以需要一种更好的检测方法对毛的存在的证据和毛的蛋白质姐妹分支进行表征，同时排除非毛蛋白质的干扰。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种从瓮棺土样中提取羊毛角蛋白进行蛋白质组学检测的方法。本发明通过将免疫学与蛋白质组学结合，既可以充分提取样品中的毛类蛋白质，又可以检测出这些毛类蛋白质老化过程中的肽段损失。且操作方便，蛋白损伤性能小。
本发明的具体技术方案为：
一种从瓮棺土样中提取羊毛角蛋白进行蛋白质组学检测的方法，包括以下步骤：
1）取500mg氨基化的磁性纳米颗粒，加入到40-60mlpbs缓冲液中，超声分散；加入150-250ml、20-30wt%戊二醛溶液，在30-40℃的振荡水浴锅中振荡反应2-3小时。
2）磁性分离固液相，用pbs缓冲液清洗3-5遍，之后将活化后的磁性纳米颗粒分散在40-60mlpbs缓冲液中，得到5-15mg/ml的磁性纳米粒子溶液。
3）取30ml上述磁性纳米粒子溶液，向其中加入含有20-55mg兔抗角蛋白单克隆抗体的bsa溶液，在30-40℃下振荡反应1-3h。
本发明中抗体不局限于兔抗角蛋白抗体，加入羊毛中含有的其它蛋白质抗体合成多种单一免疫磁珠，可以提高蛋白质获取丰度且不会降低特异性。
4）取100mg混有羊毛角蛋白的瓮棺土样溶解在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，在50-80℃的震荡水浴锅中溶解2-3h后冷却。
5）用pbs缓冲液洗涤步骤3）中所得的免疫磁珠，加入步骤4）中所得的瓮棺土样提取液，在30-40℃条件下震荡孵育1-3h。
可以同时加入多种单一免疫磁珠共同提取，确保提取到所有想要的蛋白质结果，保证了提取蛋白质的准确性与完整性。
6）磁性分离，pbs缓冲液洗涤，除去杂质和上清液，得到羊毛角蛋白结合的免疫磁珠。
全程用同种pbs洗涤液洗涤，保证最小污染，同时使用的是偏中性的ph7.4洗涤液，对环境污染小。
7）对羊毛角蛋白结合的免疫磁珠进行蛋白质组学分析，得到蛋白序列数据。
作为优选，步骤1）、2）、5）、6）中pbs缓冲液的ph=7.4。
作为优选，步骤1）中，所述戊二醛溶液的溶剂为ph=7.4的pbs。
作为优选，步骤3）中，兔抗羊毛角蛋白抗体为全序列抗体，bsa溶液中bsa的浓度为8-12mg/ml；抗体稀释倍数为1:1000-1500。
作为优选，步骤4）中，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的ph=9.6。
作为优选，步骤5）中，震荡过程中定时进行上下颠倒，使瓮棺土样提取液成均匀悬浊液。
作为优选，步骤6）中，磁性分离时外部磁性物体置于底部，上下颠倒，多次重复，最终磁体在上，瓮棺土样在下，直接从下口除去土样和多余液体。
作为优选，步骤7）中，若检测结果含有抗体，需在结果中排除。
作为优选，步骤1）中，所述氨基化的磁性纳米颗粒的合成步骤为：
a.称取4.78gfecl3·6h2o和2.78gfeso4·7h2o溶解在蒸馏水中，将溶液倒入容器中，在充氮气的条件下搅拌至溶解；加入3.2gnaoh，80-90℃水浴持续搅拌0.5-1.5h制得fe3o4磁性纳米颗粒，磁性分离，倒掉上清液，用乙醇和蒸馏水多次洗涤保存在去离子水中；
b.移取500mg含有纳米磁珠的磁性液体，溶解在250-350ml无水乙醇中，超声至完全分散，加入25-35mlaptes，用氨水调节ph至10.5-11.5，然后在55-65℃水浴中搅拌反应4-6h；结束后，用无水乙醇洗涤。
该方法合成的磁性纳米颗粒活性更高，且磁性颗粒均匀。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
（1）本发明对氨基化免疫磁珠进行了活化处理，增强了该氨基化磁珠与抗体的结合能力。
（2）本发明利用免疫磁珠的抗原抗体特异性结合，能更准确的提取出尽可能多的所需蛋白质，排除无用蛋白质。
（3）本发明利用蛋白质组学可以对难以鉴别的土壤微量羊毛蛋白质富集分析，对其内含有的多肽和丢失的多肽定量分析。
（4）本发明蛋白质提取过程简单，耗时较短，有用蛋白质保存比例大，杂质蛋白含量种类明确，提高了蛋白质组学结果准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1（免疫磁珠与cb溶解法对比）
1)称取4.78gfecl3·6h2o和2.78gfeso4·7h2o溶解在蒸馏水中，将溶液倒入250ml三口烧瓶中，在充氮气的条件下搅拌至溶解。加入3.2gnaoh。85℃水浴持续搅拌1h制得fe3o4磁性纳米颗粒。磁性分离，倒掉上清液，用乙醇和蒸馏水多次洗涤保存在去离子水中。移取500mg含有纳米磁珠的磁性液体，溶解在300ml无水乙醇中，超声至完全分散，加入30mlaptes，用氨水调节ph至11，然后在60℃水浴中搅拌反应5h。结束后，用无水乙醇洗涤。
2)取500mg氨基化的磁性纳米颗粒，加入到50ml，ph7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pbs）中，超声分散。加入200ml、23%戊二醛，在37℃的振荡水浴锅中振荡反应2小时。
3)磁性分离固液相，用ph7.4的pbs清洗4遍，之后将活化后的磁珠分散在50mlpbs缓冲液，得到10mg/ml的磁性纳米粒子溶液。
4)取30ml（300mg）上述的磁珠溶液，向其中加入含有45mg兔抗角蛋白单克隆抗体的bsa溶液，在37℃下振荡反应2h。
5)取a，b两组完全一样的100mg混有20mg羊毛角蛋白的干净土样溶解在ph9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（cb）中，60℃的震荡水浴锅中溶解2.5h后冷却。
6)用ph7.4的pbs溶液洗涤步骤3）中的免疫磁珠，加入步骤5）中冷却后的土样提取液a，在37℃条件下震荡孵育2h。
7)磁性分离，用pbs洗涤，除去杂质和上清液，得到羊毛角蛋白结合的免疫磁珠，真空干燥。
8)取步骤三中的土样提取液b，多次离心获取上清液，冷冻干燥得到羊毛角蛋白
9)对羊毛角蛋白结合的免疫磁珠和cb溶解的羊毛角蛋白进行蛋白质组学分析，得到蛋白质可能性和多肽含量数据。
实施例2（瓮棺土样的检测）
1)称取4.78gfecl3·6h2o和2.78gfeso4·7h2o溶解在蒸馏水中，将溶液倒入250ml三口烧瓶中，在充氮气的条件下搅拌至溶解。加入3.2gnaoh。85℃水浴持续搅拌1h制得fe3o4磁性纳米颗粒。磁性分离，倒掉上清液，用乙醇和蒸馏水多次洗涤保存在去离子水中。移取500mg含有纳米磁珠的磁性液体，溶解在300ml无水乙醇中，超声至完全分散，加入30mlaptes，用氨水调节ph至11，然后在60℃水浴中搅拌反应5h。结束后，用无水乙醇洗涤。
2)取500mg氨基化的磁性纳米颗粒，加入到50ml，ph7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pbs）中，超声分散。加入200ml、23%戊二醛，在37℃的振荡水浴锅中振荡反应2小时。
3)磁性分离固液相，用ph7.4的pbs清洗4遍，之后将活化后的磁珠分散在50mlpbs缓冲液，得到10mg/ml的磁性纳米粒子溶液。
4)取30ml（300mg）上述的磁珠溶液，向其中加入含有50mg兔抗角蛋白单克隆抗体的bsa溶液，在37℃下振荡反应2h。
5)取100mg用elisa法检测出羊毛角蛋白的瓮棺土样溶解在ph9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（cb）中，60℃的震荡水浴锅中溶解2.5h后冷却。
6)用ph7.4的pbs溶液洗涤步骤3）中的免疫磁珠，加入步骤5）中冷却后的土样提取液，在37℃条件下震荡孵育2h。
7)磁性分离，用pbs洗涤，除去杂质和上清液，得到羊毛角蛋白结合的免疫磁珠，真空干燥。
8)对羊毛角蛋白结合的免疫磁珠和cb溶解的羊毛角蛋白进行蛋白质组学分析，得到蛋白质可能性和多肽含量数据。
实施例3（多种单一免疫磁珠混合使用）
1)称取4.78gfecl3·6h2o和2.78gfeso4·7h2o溶解在蒸馏水中，将溶液倒入250ml三口烧瓶中，在充氮气的条件下搅拌至溶解。加入3.2gnaoh。85℃水浴持续搅拌1h制得fe3o4磁性纳米颗粒。磁性分离，倒掉上清液，用乙醇和蒸馏水多次洗涤保存在去离子水中。移取500mg含有纳米磁珠的磁性液体，溶解在300ml无水乙醇中，超声至完全分散，加入30mlaptes，用氨水调节ph至11，然后在60℃水浴中搅拌反应5h。结束后，用无水乙醇洗涤。
2)取500mg氨基化的磁性纳米颗粒，加入到50ml，ph7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pbs）中，超声分散。加入200ml、23%戊二醛，在37℃的振荡水浴锅中振荡反应2小时。
3)磁性分离固液相，用ph7.4的pbs清洗4遍，之后将活化后的磁珠分散在50mlpbs缓冲液，得到10mg/ml的磁性纳米粒子溶液。
4)取30ml（300mg）上述的磁珠溶液，向其中加入含有45mg兔抗角蛋白单克隆抗体的bsa溶液，在37℃下振荡反应2h。
5）同步骤1）、2）、3）、4）制得丝素蛋白单克隆抗体的免疫磁珠。
6)取100mg瓮棺土样溶解在ph9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（cb）中，60℃的震荡水浴锅中溶解2.5h后冷却。
7)用ph7.4的pbs溶液洗涤步骤3）、4）中的免疫磁珠，加入步骤6）中冷却后的土样提取液，在37℃条件下震荡孵育2h。
8)磁性分离，用pbs洗涤，除去杂质和上清液，得到羊毛角蛋白结合的免疫磁珠，真空干燥。
9)对羊毛角蛋白结合的免疫磁珠和cb溶解的羊毛角蛋白进行蛋白质组学分析，得到蛋白质可能性和多肽含量数据
实施例1中，对比了本发明与cb溶液法提取的丝素蛋白含量，免疫磁珠提取的角蛋白含量为16.5mg(以最终质量-加入免疫磁珠质量)，而cb提取液提取的角蛋白含量为16.2mg。考虑到免疫磁珠洗涤后的纯度很高，且在提取过程中磁珠可能有损失，实际值应该比计算值高，而cb提取液提取的没有较好的提纯方法，杂质较多，实际值应该比计算值低，故可以得出结论免疫磁珠的提取结果比溶液法要好。同时在之后的蛋白质组学检测中也可以看出免疫磁珠提取的多肽数量以及可信度均比溶液法要高。
实施例2，3也检测出了瓮棺土样中的羊毛角蛋白和各种多肽的种类数量比例，且实施例3中检测出少量丝素蛋白的多肽。
通过对比可知免疫磁珠的蛋白质提取能力要高于溶液法，为含量稀少且杂质蛋白质种类较多的样品提供了一种更加有效的提取方法。且为微量蛋白质类文物纺织品提供了一种更加有效且深入的研究方法。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。