曲洛司坦及其杂质的分离检测方法及应用与流程

1.本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种曲洛司坦及其杂质的分离检测方法及应用。


背景技术：

2.曲洛司坦即4α,5α-环氧-2-氰基-雄甾-2-烯-3,17β-二醇，其能可逆性地抑制肾上腺皮质中的3β-羟基甾体脱氢酶和
△
5,4-异构酶，由此阻滞盐皮质激素及糖皮质激素的生物合成，主要用于治疗库欣综合征(皮质醇增多症)和原发性醛固酮增多症。
3.曲洛司坦合成过程的工艺杂质4α,5α-环氧-2-氰基雄甾-2-烯-3,17β-二羟基-17-醋酸酯(曲洛司坦杂质3)，17β-羟基-4α,5α-环氧雄甾烷并[2,3-d]异噁唑-17-醋酸酯(曲洛司坦酯化物)，17β-羟基-4α,5α-环氧雄甾烷并[2,3-d]异噁唑(曲洛司坦环氧物)；曲洛司坦杂质3的降解杂质为4α,5α-环氧-2-氰基雄甾-2-烯-3-羟基-17-酮(曲洛司坦杂质5)。其中曲洛司坦杂质5与曲洛司坦极性相近，利用普通液相色谱洗脱体系进行检测，难以进行有效分离。鉴于其原料的质量控制直接影响到制剂终产品的质量。因此，为更好控制原料药及制剂的质量，对曲洛司坦的杂质研究尤为重要。目前曲洛司坦原料及以上两种杂质在国内外药典中均未收载，故本发明对曲洛司坦原料药及其制剂质量控制有着重要意义。
[0004]
有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0005]
本发明的主要目的在于提供一种曲洛司坦及其杂质的分离检测方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
[0006]
作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种曲洛司坦及其杂质的分离检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：以十八烷基键合硅胶为填充剂，以ph＝2-4的酸性水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱。
[0007]
进一步的，以流动相体积为100％计，梯度设置如下：
[0008][0009]
进一步的，以流动相体积为100％计，梯度设置如下：
[0010][0011]
进一步的，所述流动相a为0.05-0.15％磷酸水溶液。
[0012]
进一步的，所述流动相a为0.1％磷酸水溶液。
[0013]
进一步的，所用检测器为紫外检测器，检测波长为240-250nm。
[0014]
进一步的，所用检测器为紫外检测器，检测波长为246nm。
[0015]
进一步的，所用流速为0.7-1.3ml/min。
[0016]
进一步的，所用柱温为55-60℃。
[0017]
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：以0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；所用检测器为紫外检测器，检测波长为242-248nm；所用柱温为56-60℃；所用流速为0.8-1.2ml/min；梯度设置如下：
[0018][0019]
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：以0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；所用检测器为紫外检测器，检测波长为246nm；所用柱温为60℃；所用流速为1.0ml/min；梯度设置如下：
[0020][0021]
进一步的，进样量为10μl；
[0022]
进一步的，溶解供试品的溶剂为乙腈。
[0023]
作为本发明的第二个方面，本发明还提供了上述分离检测方法在曲洛司坦原料药或其制剂的质量控制中的应用。
[0024]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0025]
本发明提供的曲洛司坦及其杂质的分离检测方法，通过对流动相、色谱柱的优化设计，可准确、有效分离检测曲洛司坦中的有关物质，如杂质4α,5α-环氧-2-氰基雄甾-2-烯-3,17β-二羟基-17-醋酸酯和4α,5α-环氧-2-氰基雄甾-2-烯-3-羟基-17-酮等。本发明色
谱柱易得，流动相体系相对简单，经过系统方法学验证，专属性强、灵敏度高，达到主峰及各杂质有效分离，可用于曲洛司坦原料药中两种杂质的分离检测，提高了曲洛司坦制剂的安全性和有效性。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]
图1为实施例1-1中曲洛司坦定位溶液的hplc谱图；
[0028]
图2为实施例1-1中曲洛司坦杂质3定位溶液的hplc谱图；
[0029]
图3为实施例1-1中曲洛司坦杂质5定位溶液的hplc谱图；
[0030]
图4为实施例1-1中空白溶剂的hplc谱图；
[0031]
图5为实施例1-1中混样溶液的hplc谱图。
具体实施方式
[0032]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0033]
曲洛司坦对照品为自制对照品，hplc含量99.67％。
[0034]
曲洛司坦杂质3对照品为自制对照品(4α,5α-环氧-2-氰基雄甾-2-烯-3,17β-二羟基-17-醋酸酯)。
[0035]
曲洛司坦杂质5对照品为自制对照品(4α,5α-环氧-2-氰基雄甾-2-烯-3-羟基-17-酮)。
[0036]
曲洛司坦酯化物自制对照品(17β-羟基-4α,5α-环氧雄甾烷并[2,3-d]异噁唑-17-醋酸酯)。
[0037]
曲洛司坦环氧物自制对照品(17β-羟基-4α,5α-环氧雄甾烷并[2,3-d]异噁唑)。
[0038]
实施例1专属性试验
[0039]
曲洛司坦酯化物储备溶液：称取曲洛司坦酯化物约16mg，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀作为曲洛司坦酯化物储备溶液。
[0040]
曲洛司坦环氧物储备溶液：称取曲洛司坦环氧物约16mg，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀作为曲洛司坦环氧物储备溶液。
[0041]
曲洛司坦杂质3储备溶液：称取曲洛司坦杂质3对照品约16mg，置于25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀作为杂质3储备溶液。
[0042]
曲洛司坦杂质5储备溶液：称取曲洛司坦杂质5对照品约16mg，置于25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀作为杂质5储备溶液。
[0043]
混和溶液a：分别精密量取曲洛司坦酯化物储备溶液和曲洛司坦环氧物储备溶液各0.5ml，置于同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀作为混和溶液a。
[0044]
混和溶液b：分别精密量取杂质3储备溶液和杂质5储备溶液各0.8ml，置于同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀作为混和溶液b。
[0045]
混样溶液：称取曲洛司坦约16mg，置于10ml量瓶中，精密量取混和溶液a0.4ml和混和溶液b1ml，置于同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀作为混样溶液。
[0046]
空白溶剂：流动相。
[0047]
实施例1-1
[0048]
色谱条件：
[0049]
色谱柱：agilenteclipsexdb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0050]
检测波长：紫外检测器，检测波长为246nm；
[0051]
流速：1ml/min；
[0052]
柱温：60℃；
[0053]
进样量：10μl；
[0054]
按照下表进行梯度洗脱：
[0055]
时间(min)0.1％磷酸水溶液(％)乙腈(％)08020301090401090458020558020
[0056]
曲洛司坦定位溶液的hplc谱图如图1所示。
[0057]
由图1可知，曲洛司坦的保留时间为15.115min。
[0058]
曲洛司坦杂质3定位溶液的hplc谱图如图2所示。
[0059]
由图2可知，曲洛司坦杂质3的保留时间为22.586min。
[0060]
曲洛司坦杂5定位溶液的hplc谱图如图3所示。
[0061]
由图3可知，曲洛司坦杂质5的保留时间为16.600min。
[0062]
曲洛司坦环氧物的保留时间为18.863min，曲洛司坦酯化物的保留时间为26.465min。
[0063]
空白溶剂的hplc谱图如图4所示。
[0064]
混样溶液的hplc谱图如图5所示，检测数据如表1所示。
[0065]
表1混合溶液检测结果
[0066][0067]
由图3和表1可知，曲洛司坦及各杂质峰之间的分离度均大于1.5，相互之间无干扰，符合药典要求。
[0068]
实施例1-2
[0069]
色谱条件：
[0070]
色谱柱：agelaxbpc18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0071]
检测波长：紫外检测器，检测波长为250nm；
[0072]
流速：1.3ml/min；
[0073]
柱温：55℃；
[0074]
进样量：10μl；
[0075]
按照下表进行梯度洗脱：
[0076]
时间(min)0.15％磷酸水溶液(％)乙腈(％)07030283070383070437030537030
[0077]
混合溶液检测数据如表2所示。
[0078]
表2混合溶液检测结果
[0079]
[0080][0081]
由表2可知，曲洛司坦及各杂质峰之间的分离度均大于1.5，相互之间无干扰，符合药典要求。
[0082]
实施例1-3
[0083]
色谱柱：agelaxbpc18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0084]
检测波长：紫外检测器，检测波长为240nm；
[0085]
流速：0.7ml/min；
[0086]
柱温：60℃；
[0087]
进样量：10μl；
[0088]
按照下表进行梯度洗脱：
[0089]
时间(min)0.05％磷酸水溶液(％)乙腈(％)090103259542595489010589010
[0090]
混合溶液检测数据如表3所示。
[0091]
表3混合溶液检测结果
[0092]
[0093][0094]
由表3可知，曲洛司坦及各杂质峰之间的分离度均大于1.5，相互之间无干扰，符合药典要求。
[0095]
实施例1-4
[0096]
色谱柱：agilenteclipsexdb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0097]
检测波长：紫外检测器，检测波长为248nm；
[0098]
流速：0.8ml/min；
[0099]
柱温：56℃；
[0100]
进样量：10μl；
[0101]
按照下表进行梯度洗脱：
[0102]
时间(min)0.1％磷酸水溶液(％)乙腈(％)080203059540595458020558020
[0103]
混合溶液检测数据如表4所示。
[0104]
表4混合溶液检测结果
[0105][0106][0107]
由表4可知，曲洛司坦及各杂质峰之间的分离度均大于1.5，相互之间无干扰，符合药典要求。
[0108]
实施例1-5
[0109]
色谱柱：agilenteclipsexdb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0110]
检测波长：紫外检测器，检测波长为242nm；
[0111]
流速：1.2ml/min；
[0112]
柱温：60℃；
[0113]
进样量：10μl；
[0114]
按照下表进行梯度洗脱：
[0115]
时间(min)0.1％磷酸水溶液(％)乙腈(％)09010301090401090459010559010
[0116]
混合溶液检测数据如表5所示。
[0117]
表5混合溶液检测结果
[0118][0119]
由表5可知，曲洛司坦及各杂质峰之间的分离度均大于1.5，相互之间无干扰，符合药典要求。
[0120]
实施例2灵敏度试验
[0121]
曲洛司坦及曲洛司坦杂质3定量限、检测限溶液配制：
[0122]
曲洛司坦储备液：称取曲洛司坦对照品约8mg，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀作为曲洛司坦储备液。
[0123]
曲洛司坦杂质3储备液：称取曲洛司坦杂质3对照品约8mg，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀作为曲洛司坦杂质3储备液。
[0124]
混合储备液：精密量取曲洛斯坦储备液1ml，曲洛司坦杂质3储备液2ml，置于同一50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，作为混合储备液。
[0125]
0.2％溶液：精密量取1ml混合储备液，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0126]
0.01％溶液(定量限)：精密量取1ml-0.2％溶液，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0127]
0.003％溶液(检出限)：精密量取3ml-0.01％溶液，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0128]
曲洛司坦杂质5定量限、检测限溶液配制：
[0129]
曲洛司坦杂质5储备液：称取杂质5对照品约8mg，置于10ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，混匀作为杂质5储备液。
[0130]
曲洛司坦杂质5定量限溶液：精密量取曲洛司坦杂质5储备液1ml，置于50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，作为杂质5-1％溶液。精密量取杂质5-1％溶液1ml，置于50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，作为杂质5-0.02％溶液。精密量取杂质5-0.02％溶液5ml，置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，作为曲洛司坦杂质5定量限溶液。
[0131]
曲洛司坦杂质5检出限溶液：精密量取3ml曲洛司坦杂质5定量限溶液，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0132]
色谱条件：
[0133]
色谱柱：agilenteclipsexdb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0134]
检测波长：紫外检测器，检测波长为246nm；
[0135]
流速：1ml/min；
[0136]
柱温：60℃；
[0137]
进样量：10μl；
[0138]
按照下表进行梯度洗脱：
[0139]
时间(min)0.1％磷酸水溶液(％)乙腈(％)08020301090401090458020558020
[0140]
根据信噪比法来确定检测限和定量限，将用已知浓度的储备液逐级稀释，当s/n≈10时，为定量限浓度，当s/n≈3时，为检测限浓度。
[0141]
表6检测限(lod)、定量限(loq)结果
[0142][0143]
由表6可知，当曲洛司坦和曲洛司坦杂质3的浓度为0.048μg/ml时，信噪比大于3，
当曲洛司坦杂质5的浓度为0.047μg/ml时，信噪比大于3，符合检测限要求；当曲洛司坦、曲洛司坦杂质3、曲洛司坦杂质5的浓度为0.16μg/ml时，曲洛司坦信噪比为9.98，接近10，曲洛司坦杂质3、曲洛司坦杂质5信噪比大于10，符合定量限要求。
[0144]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。