一种非洲猪瘟病毒抗体胶体金双联检测试纸条及其制备方法

1.本发明涉及快速免疫层析检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗体胶体金双联检测试纸条及其制备方法。


背景技术：

2.非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病。asf最早于1920年发现于肯尼亚，我国自2018年8月首次出现非洲猪瘟病例，目前已迅速蔓延到全国。asfv粒子呈二十面体对称结构，直径约为200nm，是一种大型包膜双链dna病毒，该病毒不仅是asfivirus科asfarviridae的唯一成员，也是唯一已知的dna虫媒病毒。其基因组长度范围约为170～193kb，编码超过160个开放性阅读框(orfs)。研究表明，有超过50种蛋白被包装成病毒粒子并在病毒感染中起作用，如pp220、pp62、p72、p54、p30、cd2v、p10、p12、p14.5、p17，其中p30蛋白由cp204l基因编码，是早期病毒蛋白之一，相对分子质量为30kda，是asfv感染机体的过程中参与最多且免疫原性最强的抗原结构蛋白之一；p72蛋白由b646l(vp72)基因编码，一般在病毒感染晚期表达，是asfv的主要结构蛋白，相对分子质量为73.2kda，此外，因其是病毒二十面体的主要组成部分，因此具有高度的抗原活性和免疫原性。asfv通常对家猪和野猪易感，依据毒株毒力强弱在临床上通常表现为急性、亚急性和慢性感染。急性感染后通常表现为高热、皮肤发绀和淋巴结严重出血等症状，死亡率高达100％；相较于前者，亚急性感染后一般是部分致死，部分耐过；而慢性感染虽不致死，但经过一段时间后会发展为隐性或持续性感染。由于该病毒传播速度极快，且目前尚无有效的治疗药物以及有效的疫苗可用，发生疫情时控制其流行和传播的最有效措施为扑杀，因此对全球养猪业构成了巨大损失。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告的动物疫病，我国将其列为重点防范的一类动物疫病。
3.在当前尚未有asfv疫苗接种的情况下，血清学抗体检测为阳性则证明正在或者已经发生了感染。在疫区，存活的动物在亚急性感染后抗体会持续数月或数年，因此抗体检测可应用于呈慢性或隐性感染动物的大规模筛查。目前实验室常用的asf血清学抗体检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(elisa)、荧光抗体试验(fat)、胶体金免疫层析技术等。虽然酶联免疫吸附试验(elisa)是oie推荐的血清学诊断方法，该方法可以有效的检测到asfv感染后存活猪机体内的asfv特异性抗体，但该方法比较耗时，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床抗体水平的快速、廉价、高效监测的要求。
4.胶体金免疫层析检测技术是一种以胶体金为示踪标记物，结合抗原抗体免疫反应的一种新型诊断技术，具有操作简单、快捷、易于判断，且不需要任何仪器、成本低廉等优点，适用于现场检测。鉴于p30蛋白和p72蛋白分别在感染早期和感染晚期发挥着重要作用，在免疫学诊断和新型疫苗研发方面具有重要的应用价值。但是由于现有的p30蛋白和/p72蛋白的胶体金测试纸条存在以下问题：
①
现有的非洲猪瘟胶体金测试纸条仅能单独检测p30蛋白和/p72蛋白，无法实现非洲猴猪瘟抗体的全程监测；
②
即使采用常规方法制备用于检测p30蛋白和/p72蛋白的试纸条，但是由于结合垫制备过程中采用常规金标蛋白保护剂
和金标蛋白封闭液，导致阳性样品和阴性样品的检测线和质控线显色差别不明显，影响结果判定；
③
采用常规的样品垫封闭液和样品稀释液，也会导致阳性样品和阴性样品的检测线和质控线显色差别不明显，影响结果判定。
5.针对上述问题，本发明提供了一种可以快速检测asf感染后抗体水平的胶体金双联免疫层析试纸条，以期对asf疫情进行高效监测从而控制该病的传播和流行，为非洲猪瘟的防控提供技术支撑。


技术实现要素：

6.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于全程监测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金双联检测试纸条及其制备方法。具体包括以下内容：
7.第一方面，本发明提供了一种用于全程监测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金双联检测试纸条，包括pvc底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在pvc底板上；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线t和质控线c，所述的检测线t设置于靠近样品垫的一端，所述的质控线c设置于靠近吸水垫的一端；所述结合垫包被有金标蛋白，所述金标蛋白包括胶体金标记的asfv p30蛋白和胶体金标记的asfv p72蛋白；所述检测线t包括包被有asfv p72蛋白的检测线t1和包被有asfv p30蛋白的检测线t2；所述质控线c包被有抗asfv p30蛋白单克隆抗体，和/或抗asfv p72蛋白单克隆抗体。
8.优选地，所述结合垫的制备方法为：
9.调胶体金溶液的ph值为8，在胶体金溶液加入asfv p30蛋白，37℃反应，再加入金标蛋白封闭液反应，37℃反应，离心；用金标蛋白保护剂将沉淀重悬，即为asfv p30金标蛋白溶液；
10.调胶体金溶液的ph值为7，在胶体金溶液加入asfv p72蛋白，37℃反应，再加入金标蛋白封闭液反应，37℃反应，离心；用金标蛋白保护剂将沉淀重悬，即为asfv p72金标蛋白溶液；
11.将制备的金标蛋白喷洒在金标结合垫上得结合垫；
12.所述金标蛋白封闭液为含有纯度为10％m/v bsa和3％m/v酪蛋白的超纯水溶液；
13.所述金标蛋白保护剂为含有3％m/v蔗糖、1％m/v pvp、0.5％v/v tween
‑
20的pbs溶液。
14.优选地，所述asfv p30金标蛋白溶液组成为：每1ml胶体金溶液含60μg asfv p30蛋白；所述asfv p72金标蛋白溶液组成为：1ml胶体金溶液加入10μg asfv p72蛋白。
15.优选地，所述检测线t1上包被有0.8mg/ml的asfv p72蛋白；所述检测线t2上包被有0.3mg/ml的asfv p30蛋白。
16.优选地，所述样品垫经样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有1％m/v peg20000，1％m/v pvp
‑
40，0.5％v/v tween
‑
20，2％m/v bsa的pbs溶液。
17.优选地，所述asfv p30蛋白的基因序列号为nc 044955.1；所述asfv p72蛋白的基因序列号为nc 001659.2。
18.第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述用于全程监测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金双联检测试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：
19.制备包被有金标蛋白的结合垫；
20.制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
21.将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在pvc底板上，得非洲猪瘟病毒抗体胶体金双联检测试纸条。
22.第三方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面所述的用于全程监测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金双联检测试纸条。
23.优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液为含有0.02m tris
‑
hcl，0.85％m/v nacl，1％v/v tween
‑
20的pbs溶液。
24.优选地，所述试剂盒还包括样品垫封闭液、金标蛋白保护剂、金标蛋白封闭液；所述样品垫封闭液为含有1％m/v peg20000，1％m/v pvp
‑
40，0.5％v/v tween
‑
20，2％m/v bsa的pbs溶液；所述金标蛋白保护剂为含有3％m/v蔗糖，1％m/v pvp
‑
40，0.5％v/v tween
‑
20的pbs溶液；所述金标蛋白封闭液为含有10％m/v bsa和3％m/v酪蛋白的超纯水溶液。
25.本发明的有益效果是：本发明提供的asfv p30和p72双联检测试纸条能够可准确的获悉机体的感染时期，同时具有结合其特异性好、灵敏性好、准确率高等优点；与现有的elisa检测方法相比，不仅准确率高，而且简化了检测的步骤和时间；有望成为非洲猪瘟抗体的现场或者实验室检测的使用技术，为非洲猪瘟的快速诊断提供又一种新思路。
附图说明
26.图1p30蛋白和p72蛋白的sds
‑
page电泳图，其中m为marker；1为p30蛋白；2为p72蛋白；
27.图2最适蛋白标记ph值选择结果图，其中a为asfv p30蛋白，b为asfv p72蛋白；
28.图3最适蛋白标记量选择结果图，其中a为asfv p30蛋白，b为asfv p72蛋白；
29.图4试纸条的结构示意图，其中，1为吸水垫、2为质控线c、3为检测线t1、4为检测线t2、5为结合垫、6为样品垫、7为pvc底板、8为硝酸纤维素膜(nc膜)；
30.图5试纸条结果判定示意图；
31.图6p30和p72两种抗体胶体金试纸条消长结果；
32.图7p30和p72两种抗体elisa消长结果。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
34.以下实施例中所述的asfvδ181/uk减毒株来源于非洲猪瘟区域参考实验室(兰州)。实施例1p30蛋白和p72蛋白的制备
35.1.p30重组蛋白的制备
36.将重组阳性质粒pet
‑
32a
‑
p30转化至感受态细胞bl21(de3)中，37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于含氨苄霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃培养12h，作为种子；将培养的种子按1:100接种于含氨苄霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃培养至od
600
nm约为0.65
时，加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，37℃继续培养6～8h；离心收菌，将菌体用适量的缓冲液重悬，超声破碎，12000r/min离心10min，弃去上清，用pbs洗涤4～6次，用适量的8mol尿素溶解沉淀，逐步透析至8mol尿素中，应用镍柱纯化p30蛋白，纯化结果见图1。鉴定结果显示，获得的p30蛋白纯度高。
37.2.p72截短蛋白的制备
38.将重组阳性质粒pet
‑
28a
‑
p72转化至感受态细胞bl21(de3)中，37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于含卡那霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃培养12h，作为种子；将培养的种子按1:100接种于含卡那霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃培养至od
600
nm约为0.65时，加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，37℃继续培养6～8h；离心收菌，将菌体用适量的缓冲液重悬，超声破碎，12000r/min离心10min，弃去上清，用pbs洗涤4～6次，用适量的8mol尿素溶解沉淀，逐步透析至8mol尿素中，应用镍柱纯化p72截短蛋白，纯化结果见图2。鉴定结果显示，获得的p72蛋白纯度高。
39.实施例2非洲猪瘟病毒抗体胶体金双联检测试纸条的制备
40.1.结合垫的制备
41.1.1胶体金溶液的制备
42.在100ml超纯水中加入1ml 1％氯金酸后充分混匀，加热至明显看到气泡均匀出现且向上升起时，立即一次性加入2.0ml，1％柠檬酸三钠溶液，加热至颜色不再变化后继续加热2～3min，小心取下锥形瓶，晾至室温，加超纯水定容至100ml。
43.1.2金标蛋白的制备
44.(1)最适标记ph值
45.使用0.1mg/ml k2co3溶液将金溶液的ph分别调至4～9，在不同ph的金溶液中加入适量的蛋白，室温静置2h，4℃，12000r/min离心30min，收集上清包被elisa板，采用间接elisa检测其与asf阳性血清的反应性，以ph为横坐标，以od
450 nm值为纵坐标绘制散点图，从而确定最适ph。
46.结果如图2所示，结果表明，标记p30蛋白时最适ph为8；标记p72蛋白时最适ph为7。
47.(2)最适标记量
48.将p30蛋白用pbs分别稀释为0.1mg/ml倍比稀释至0.00625mg/ml；将p72蛋白用pbs从0.25mg/ml倍比稀释至0.001953125mg/ml。在已调整好ph的金溶液中依次加入0.1ml上述不同浓度的蛋白，充分混匀，室温放置5～10min，加入0.1ml 10％nacl溶液，2h后观察颜色变化，记录最小蛋白标记量，在最小标记量的基础上加10～20％则为最适蛋白标记量。
49.结果如图3所示，其中1
‑
5表示将p30蛋白用pbs稀释从0.1mg/ml倍比稀释至0.00625mg/ml(分别为0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.025mg/ml、0.0125mg/ml、0.00625mg/ml)；1
‑
8分别表示将p72蛋白用pbs从0.25mg/ml倍比稀释至0.001953125mg/ml(分别为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml、0.015625mg/ml、0.0078125mg/ml、0.00390625mg/ml、0.001953125mg/ml)，结果表明，当p30蛋白浓度为0.025mg/ml(a3)时颜色由酒红色变成灰红色，因此0.05mg/ml(a2)为最小蛋白浓度，在最小标记量的基础上加20％为最适蛋白浓度60μg/ml；当p72蛋白浓度为0.00390625mg/ml(b7)时颜色由酒红色变成灰红色，因此0.0078125mg/ml(b2)为最小蛋白浓度，在最小标记量的基础上加20％为最适蛋白浓度9.4μg/ml，后续按10μg/ml为最适蛋白浓度。
50.(3)金标蛋白的制备：
51.调胶体金溶液的ph值为8，按1ml胶体金溶液加入60μg asfv p30蛋白的配比，加入asfv p30蛋白混合均匀，37℃反应30min；再加入金标蛋白封闭液，37℃反应30min；4℃静置2h，4℃12000r/min离心30min，用金标蛋白保护剂将沉淀按照总体积的1/20进行重悬，即为asfv p30金标蛋白溶液；
52.调胶体金溶液的ph值为7，按1ml胶体金溶液加入9.4μg asfv p72蛋白的配比，加入asfv p72蛋白混合均匀，37℃反应30min；再加入金标蛋白封闭液，37℃反应30min；4℃静置2h，4℃12000r/min离心30min，用金标蛋白保护剂将沉淀按照总体积的1/20进行重悬，即为asfv p72金标蛋白溶液；
53.(4)金标蛋白封闭液选择
54.封闭液封闭效果根据金结束后死金量判断。
55.分别采用4种封闭液，分别为：
①
10％m/v bsa(纯度：90％)；
②
10％m/v bsa(纯度：99.8％)；
③
10％m/v bsa(纯度：99.8％)+3％m/v酪蛋白；
④
3％m/v peg20000；
⑤
不封闭。
56.结果如表1所示，结果表明，在金标蛋白的制备过程中，不采用金标蛋白封闭液封闭时全部为死金；使用封闭液
④
时也几乎都是死金；使用封闭液
①
时死金量较少；而使用封闭液
③
时死金量最少，说明bsa的封闭效果在有惰性蛋白辅助后则效果更好。因此本发明选择封闭液
③
为金标蛋白封闭液。
57.表1金标蛋白封闭液的封闭效果
58.编号封闭液是否有死金
②
10％bsa(纯度：90％)++
②
10％bsa(纯度：99.8％)++
③
10％bsa(纯度：99.8％)+3％酪蛋白+
④
3％peg20000+++
⑤
不封闭++++
59.注：
‑
表示无死金；+表示较少死金/几乎没有死金；++表示较多死金；+++表示死金偏多；++++
60.表示全是死金
61.(5)金标蛋白保护剂选择
62.金标蛋白保护剂的选择必须满足质控线(c线)和检测线(t线)均显色明显，且阳性样品和阴性样品对应的t线反差明显。
63.分别采用5种蛋白保护剂，分别为：
①
硼酸+2％m/v peg20000的pbs溶液；
②
tris
‑
hc l+2％m/v peg20000的pbs溶液；
③
0.02mol/l(ph9.0)tris
‑
hcl+0.85％m/v nacl+1％v/v t ween
‑
20的pbs溶液；
④
tris(0.02mol/l)+20％m/v bsa+5％m/v蔗糖+0.04％m/v peg20000+0.5％v/v tween
‑
20的pbs溶液；
⑤
3％m/v蔗糖+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v tween
‑
20的pbs溶液。
64.上述5种金标蛋白保护剂对质控线(c线)和检测线(t线)均显色结果如表2所示。在上述5种不同的金标蛋白保护剂的作用下，分别将阳性样品和阴性样品进行检测。结果表明，当采用蛋白保护剂
①
时，阳性样品和阴性样品的c线和t线显色弱且两者的t线差别不明显；采用蛋白保护剂
②
时，虽阳性样品和阴性样品的c线和t线显色稍强但仍然两者t线差别
不明显；采用蛋白保护剂
③
和
④
时，阳性样品和阴性样品的c线和t线显色差别较明显；而采用蛋白保护剂
⑤
时，阳性样品和阴性样品的c线和t线显色差别较显著，因此以蛋白保护剂
⑤
为金标蛋白保护剂。
65.表2金标蛋白保护剂对质控线(c线)和检测线(t线)均显色结果
66.编号c线显色t线显色阳性与阴性t线结果对比
①
++差别不明显
②
++++差别不明显
③
++++差别较明显
④
++++++差别较明显
⑤
++++++差别明显
67.注：“+”越多，表示显色月明显
68.1.3结合垫的制备
69.将制备的金标蛋白用喷膜仪均匀喷洒在金标结合垫上，立即置于37℃烘箱中干燥2～3h，取出后储存在4℃，密封保存，以供后期使用。
70.2.样品垫的制备
71.在37℃
‑
38℃条件下，将样品垫浸泡于样品垫封闭液中2h后取出置于烘箱中烘干12h，再置于铝箔袋中干燥备用。
72.样品垫封闭液的选择：
73.本发明采用了5种样品垫封闭液，分别为：
①
3％m/v蔗糖+1％m/v bsa+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v tween
‑
20的超纯水溶液；
②
3％m/v蔗糖+1％m/v bsa+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v tween
‑
20的pbs溶液；
③
1％m/v海藻糖+1％m/v peg20000+2％m/v bsa+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v tween
‑
20的pbs溶液；
④
1％m/v海藻糖+1％m/v peg20000+2％m/v bsa+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v ttitonx
‑
100的pbs溶液；
⑤
1％m/v peg200000+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v tween
‑
20+2％m/v bsa的pbs溶液。
74.在5种不同的样品垫封闭液的作用下，分别将阳性样品和阴性样品进行检测。结果如表3所示，当采用
①
和
④
封闭液时，阳性样品和阴性样品的c线和t线均显色较弱，且其对应的t线显色差别不明显；当采用
②
和
③
封闭液时，阳性样品和阴性样品的t线虽然差别明显但c线和t线均显色弱；当采用
⑤
封闭液时，阳性样品和阴性样品的c线和t线显色明显且其对应的t线差别明显。因此选择样品垫封闭液
⑤
(1％m/v peg200000+1％m/v pvp
‑
40+0.5％v/v tween
‑
20+2％m/v bsa的pbs溶液)为样品垫封闭液。
75.表3同的样品垫封闭液的作用下的显色结果
76.编号c线显色t线显色阳性与阴性t线结果对比
①
++++几乎无差别
②
++差别明显
③
++差别明显
④
++++差别不明显
⑤
++++++差别明显
77.注：“+”越多，表示显色越明显
78.3.硝酸纤维素膜的制备
79.以喷膜浓度为0.8mg/ml的asfv p72蛋白和0.3mg/ml的asfv p30蛋白在硝酸纤维素膜上划线形成检测线t1和t2；
80.以包含有1mg/ml抗p72蛋白单克隆抗体和1mg/ml抗p30蛋白单克隆抗体的等比例混合物在硝酸纤维素膜上划线形成质控线c；
81.两条检测线间隔50mm；质控线与检测线的最短距离为60mm；三条线划好后置于37℃～38℃干燥2～3h。
82.其中，单克隆抗体的选择如下：
83.单抗的选择：由公司构建获得p30单抗，分别为2h3、4e6、3h8；构建获得p72单抗，分别为3g7、3h5、6b6；
84.单抗亚型鉴定：用亚型鉴定试纸条试剂盒对单抗的亚型进行鉴定，鉴定结果显示p30单抗2h3、4e6、3h8单克隆抗体分别属于igg2a、igg2a、igg1型，p72单抗3g7、3h5、6b6分别属于igg2b、igg1、igg2a型。
85.特异性鉴定：
86.选择p30蛋白作为阳性对照，选择p72蛋白、p54蛋白、177l、17
‑
22蛋白作为阴性对照，同时包被elisa板对p30蛋白对应的3株单抗2h3、4e6、3h8进行特异性检测，检测结果显示，4e6和3h8均与p72、p54、177l蛋白有交叉反应，均为无效单抗，选取2h3为有效的抗p30蛋白单克隆抗体。
87.选择p72蛋白作为阳性对照，选择p30蛋白、p54蛋白、177l、17
‑
22蛋白作为阴性对照，同时包被elisa板对p72蛋白对应的3株单抗3g7、3h5、6b6进行特异性检测，检测结果显示3g7和3h5均与p30、p54蛋白有交叉反应，选取6b6为有效的抗p72蛋白单克隆抗体。
88.间接elisa测定效价：将p30蛋白包被elisa板，将p30单抗2h3从102稀释至107进行检测，结果显示2h3效价达到106；将p72蛋白包被elisa板，将p72单抗6b6从102稀释至107进行检测，结果显示2h3效价达到106。
89.4.试纸条的制备
90.质控线包被抗体以p30单抗2h3和p72单抗6b6为例。
91.在pvc底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫进行连接，得到试纸条，按照试纸条卡壳的大小对试纸条进行切条。其中试纸条的结构示意图如图4所示，1为吸水垫、2为质控线c、3为检测线t1、4为检测线t2、5为结合垫、6为样品垫、7为pvc底板、8为硝酸纤维素膜(nc膜)。
92.实施例3非洲猪瘟病毒抗体胶体金双联检测试纸条的使用及结果判定
93.将待检样品用样品稀释液1:10稀释，室温下，将100μl样品滴在样品垫上5～10min内观察结果；判定结果如图5所示，若检测线(t线)和质控线(c线)均出现红色，则为阳性；若检测线(t线)不显色，质控线(c线)显色，则为阴性；若质控线(c线)不显色可判定为试纸条失效。
94.检测和判定原理：将待检的样品加到样品垫上，会通过毛细管作用向前层析，到达结合垫上时，若待检样品中含有p30和/或p72抗体，则结合垫上的蛋白会与其相应的抗体发生抗原抗体结合反应，从而形成相应的复合物，继续向前层析到达检测线t2(p30)处或t1(p72)处形成一条肉眼可见的红色条带或在t2(p30)和t1(p72)处均形成红色条带。而无论待检样品中是否含有p30和p72抗体，金标蛋白均会向前继续层析到达质控线处，与质控线
处的抗p30和p72的单克隆抗体复合物进行反应，从而形成肉眼可见的红色条带。因此，若质控线不显示红色条带则说明该试纸条已经失效。
95.样品稀释液的选择：
96.本研究采用了6种样品稀释液，分别为：
97.①
硼酸溶液；
②
tris
‑
hcl溶液；
③
pbs溶液；
④
tris
‑
hcl+0.2％m/v、0.5％m/v、1％m/v不同浓度bsa的pbs溶液；
⑤
tris
‑
hcl+0.2％m/v、0.5％m/v、1％m/v不同浓度bsa+0.8％v/v nacl的pbs溶液；
⑥
0.02m(ph9.0)tris
‑
hcl+0.85％m/v nacl+1％v/v tween
‑
20的pbs溶液。
98.在6种不同的样品稀释液的作用下，分别将阳性样品和阴性样品进行检测，显色结果如下表4所示。结果表明，当封闭液为
①‑③
时，阳性样品和阴性样品的c线和t线均显色弱且其对应的t线显色差别不明显；当稀释液为
④‑⑤
时，阳性样品和阴性样品的c线和t线虽显色明显但其对应的t线差别不明显；当稀释液为
⑥
时，阳性样品和阴性样品的c线和t线显色明显且其对应的t线差别明显。因此以
⑥
号含0.02m(ph9.0)tris
‑
hcl+0.85％m/v nacl+1％v/v tween
‑
20的pbs溶液为样品稀释液。
99.表4样品稀释液处理后的显色结果
100.编号c线显色t线显色阳性与阴性t线结果对比
①
++差别不明显
②
++差别不明显
③
++差别不明显
④
++++3种浓度条件下差别均不明显
⑤
++++3种浓度条件下差别均不明显
⑥
++++++差别明显
101.注：“+”越多，表示显色越明显
102.实施例4非洲猪瘟病毒抗体胶体金双联检测试纸条的临床应用
103.使用asfvδ181/uk减毒株对1号、2号、3号、4号、5号猪分别进行免疫，分别采取0d、1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d、23d、25d、27d、29d的免疫血清，使用本发明制备的试纸条检测抗体消长，并与瑞典svanova公司p30间接elisa试剂盒和西班牙ingenasa p72阻断elisa试剂盒进行比较，以对p30和p72两种抗体的消长规律进行说明。
104.两种抗体消长结果证明：p30最早出现时间大约在第7天，最晚大约在第11天，而p72相较于p30晚，一般最早出现时间第9天，最晚为第15天(图6)。与两种进口试剂盒几乎完全相符(图7)，因此本发明通过观察两种抗体的消长规律，达到对asf进行动态监测的目的。
105.用本发明制备的asfv抗体胶体金双联免疫层析试纸条与瑞典svanova公司制备的asfv p30抗体检测试剂盒和西班牙ingenasa公司制备的asfv p72 elisa抗体检测试剂盒同时检测84份临床血清样品(40份asfvδ181/uk减毒株免疫血清、14份感染灭活血清和30份asfv阴性血清)，比较asfv抗体胶体金检测试纸条与两种商品化elisa试剂盒的符合率，以对试纸条的特异性和敏感性进行说明。检测结果如下表5所示.
106.表5检测结果
[0107][0108]
结果表明：
[0109]
①
试纸条与瑞典elisa的总符合率为98.8％((39+14+30)/(40+14+30))；
[0110]
②
试纸条与瑞典elisa的阳性符合率为98％((39+14)/(40+14))；
[0111]
③
试纸条与瑞典elisa的阴性符合率为100％(30/30)；
[0112]
④
试纸条与西班牙elisa的总符合率为98.6％((39+30)/(40+30))；
[0113]
⑤
试纸条与西班牙elisa的阳性符合率为97.5％(39/40)；
[0114]
⑥
试纸条与西班牙elisa的阴性符合率为100％(30/30)；
[0115]
综上所述，本发明制备的试纸条与参考方法的符合率都很高，且本试纸条可以一步实现非洲猪瘟病毒p30和p72抗体的联合检测，实现非洲猪瘟病毒抗体的全程监测，大大简化了检测的步骤和时间。