减肥类食品中双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的测定方法与流程

1.本发明属于检测鉴定技术领域，具体涉及一种减肥类食品中双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的测定方法。


背景技术：

2.双醋酚丁(c
24
h
19
no5)的临床药品口服后在肠内遇碱性肠液逐渐分解成醋酸和酚丁，酚丁对肠粘膜的刺激作用比酚肽强数十倍，导泻作用较强。添加双醋酚丁、脱乙酰比沙可啶这两种非食品原料的食品属于“有毒、有害食品”。对于减肥食品中混有双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶，被认为是“有毒、有害食品”，现有技术中双醋酚丁、脱乙酰比沙可啶的检测采用超高效液相色谱
‑
串联质谱法进行定性，该方法是以色谱保留时间和最强离子丰度的百分比作为定性依据，采用计算方法进行定性具有一定的局限性，存在一定的假阳性的风险。另外，阳性样品在未知浓度的情况下，更易对三重四极杆串联质谱仪造成严重污染，增加检验工作的经济成本和时间成本。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明提供一种减肥类食品中双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的测定方法，其采用高效液相色谱
‑
离子阱质谱法，适用于糖果、饮料、片剂、胶囊剂、口服液等产品中双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的定性分析。离子阱质谱具有多级全扫描功能，可通过比较样品与对照品色谱保留时间、一级和二级全扫描色谱图和质谱图的信息来进行综合判定，提高了检验的准确性和专属性，可达到快速准确筛查的目的。
4.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
5.一种减肥类食品中双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的测定方法，其包括如下步骤：
6.s1、待测样品的制备：将样品精密取样，置于容量瓶中，加入甲醇，超声提取30min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，备用；
7.s2、用双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶标准品配制浓度均为10μg/ml的标准工作液；
8.s3、空白对照溶液：与待测样品同法处理，但不加样品；
9.s4、采用高效液相色谱仪
‑
离子阱质谱仪对检测样品、混合标准工作液、空白溶液分别进行检测，根据保留时间和一级全扫描质谱和二级全扫描质谱定性；
10.s5、结果判定，待测样品溶液的色谱中，若检出与标准品保留时间一致的色谱峰，且该色谱峰的一级全扫描质谱及二级全扫描质谱均与标准品一致，且空白对照溶液无干扰，则认定检出相应化合物。
11.需要说明的的是，当只需检测单一物质时，即只需检测双醋酚丁或脱乙酰比沙可啶时，只需要配制对应单一的双醋酚丁或脱乙酰比沙可啶的标准工作液即可进行检测；如果需要同时检测双醋酚丁和脱乙酰比沙可啶这两中物质时，配制的标准工作液是既含有双醋酚丁又含有脱乙酰比沙可啶。
12.本发明中步骤s1和步骤s2的顺序可颠倒进行，先进行步骤s1或s2不影响结果的判断。
13.如上所述的测定方法，优选地，在步骤s1中，当检测样品为固体样品时，先将样品研细成粉末，精密称取1g进行检测样品的制备；当检测样品为液体样品时，精密量取1ml进行。
14.如上所述的测定方法，优选地，在步骤s1中，滤液可进行稀释后再进行检测，用甲醇稀释2～20倍。
15.如上所述的测定方法，优选地，在步骤s2中，
16.(1)先制备标准储备液：分别精密称取双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶标准品10mg，精确至0.00001g，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml的双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的标准储备液；
17.(2)分别取标准储备液1ml，至同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为10μg/ml的混合标准工作液。
18.如上所述的测定方法，优选地，在步骤s3中，所述高效液相色谱仪的检测条件为色谱柱为c18柱，流动相为乙腈与10mmol/l乙酸铵水溶液按体积比为50:50混合，流速为0.5ml/min，柱温为35℃。
19.如上所述的测定方法，优选地，在步骤s3中，所述离子阱质谱仪的检测条件为采用电喷雾离子化源，采用正离子扫描进行一级全扫描，二级全扫描，离子源喷射电压为5.0kv；毛细管温度为275℃；毛细管电压为15v；鞘气流速为1.2l/min；辅助气流速为0.15l/min。
20.如上所述的测定方法，优选地，在步骤s3中，所述离子阱质谱仪的子离子碰撞电压，对于双醋酚丁，母离子为402m/z，子离子为224m/z、266m/z碰撞电压设为45v；
21.对于脱乙酰比沙可啶母离子为278m/z，子离子184m/z，碰撞电压设为38v。如上所述的测定方法，优选地，在步骤s3中，检测进样量为10μl。
22.本发明的有益效果在于：
23.本发明提供的一种减肥类食品中双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的测定方法，可快速开展双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的定性检测，该检测方法适用于糖果、饮料、片剂、胶囊剂、口服液等产品中双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的定性分析。本发明方法准确性高，专属性强，灵敏度高，操作简便，适用于减肥类食品中双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的快速定性检测，可实现单一检测双醋酚丁或脱乙酰比沙可啶的目的，也可检测同时检测双醋酚丁和脱乙酰比沙可啶，两者之间不产生干扰，同时测定产品中这两种成分均可准确测定。
附图说明
24.图1为脱乙酰比沙可啶和双醋酚丁标准品的色谱图；
25.图2为脱乙酰比沙可啶标准品的一级质谱图；
26.图3为双醋酚丁标准品的一级质谱图；
27.图4为脱乙酰比沙可啶标准品的二级质谱图；
28.图5为双醋酚丁标准品的二级质谱图；
29.图6为阳性样品的色谱图；
30.图7为阳性样品的脱乙酰比沙可啶的一级质谱图；
31.图8为阳性样品的双醋酚丁的一级质谱图；
32.图9为阳性样品的脱乙酰比沙可啶的二级质谱图；
33.图10为阳性样品的双醋酚丁的二级质谱图；
34.图11为阴性样品的色谱图；
35.图12为阳性样品检出成分的色谱图；
36.图13为空白溶剂的色谱图；
37.图14为脱乙酰比沙可啶检出限色谱图；
38.图15为双醋酚丁检出限色谱图。
具体实施方式
39.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
40.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
41.实施例1
42.所用试剂：甲醇(ch3oh)，色谱纯；乙腈(ch3cn)，色谱纯；3.1.3乙酸铵(ch3coonh4)；乙酸铵溶液(10mmol/l)：称取0.77g乙酸铵，加入1000ml水溶解，经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用。
43.1.标准储备液(100μg/ml)的配制：分别精密称取双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶标准品10mg(精确至0.00001g)，分别置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml的标准储备液，4℃保存。
44.2.混合标准工作液(10μg/ml)的配制：分别精密量取双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶标准品储备液1ml，至同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为10μg/ml的混合标准工作液。
45.3.试样制备
46.(1)固体试样溶液：
47.取适量混匀，研细，精密称取粉末1g，置于50ml容量瓶中，加入甲醇30ml，超声提取30min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，备用。
48.(2)液体试样
49.试样溶液：取适量摇匀，精密量取1ml，置于50ml容量瓶中，加入甲醇30ml，超声提取30min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，备用。
50.模拟样品溶液：将试样溶液配制过程中加入所需标准储备液1ml，定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，备用。
51.空白对照溶液：不加试样，与试样同法处理。
52.4.检测所用仪器的条件本发明设置了若干检测条件，进行探索，例如，质谱优化条件从3.0～6.5kv逐级进行了实验，温度从200℃～350℃逐渐进行了实验，并对相关条件进行了组合筛选优化，意外获得能够兼顾双醋酚丁和脱乙酰比沙可的整体参数条件，这是以往常规检测所不能做到的。限于篇幅，以下仅对关联近的条件参数进行详细说明。
53.色谱条件优化：
54.1、色谱柱：选用c18、c8、c4色谱柱进行筛选，经试验发现c8、c4柱峰形不理想，分离效果不好，c18色谱柱峰形良好，分离效果理想，最终选择c18色谱柱。
55.2、流动相：有机相分别选用甲醇、乙腈，水相分别选用水、0.1％甲酸、10mmol/l乙酸铵水溶液，同时对有机相及水相比列进行筛选，选择有机相甲醇，水相为水或0.1％甲酸时，峰形不理想，选择有机相为乙腈，水相为10mmol/l乙酸铵水溶液峰形良好，同时调整体积比例为50:50，其出峰时间合适，分离效果好，最终选取乙腈与10mmol/l乙酸铵水溶液体积比为50:50作为该方法的最优流动相。
56.3、柱温：分别选取室温、25℃、35℃、45℃柱温进行筛选，柱温25℃峰形不理想，柱温45℃分离效果不好，最终35℃时色谱峰形理想。
57.质谱条件优化：
58.1、离子源喷射电压：分别选取4.5kv、5.0kv、5.5kv进行一级质谱筛选，在4.5kv时，双醋酚丁响应值为1.06
×
107，脱乙酰比沙可响应值为4.75
×
107；在5.5kv时，双醋酚丁响应值为1.34
×
107，脱乙酰比沙可响应值为6.21
×
107；在5.0kv时，双醋酚丁响应值为4.02
×
107，脱乙酰比沙可响应值为1.89
×
108。最终选取5.0kv，得到灵敏度较高的双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的一级质谱图。
59.2、毛细管温度：分别选取250℃、275℃、300℃进行一级质谱筛选，在250℃时，双醋酚丁响应值为1.15
×
107，脱乙酰比沙可响应值为5.43
×
107；在300℃时，双醋酚丁响应值为1.56
×
107，脱乙酰比沙可响应值为9.45
×
107在275℃时，双醋酚丁响应值为4.02
×
107，脱乙酰比沙可响应值为1.89
×
108。最终选取275℃，得到灵敏度较高的双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的一级质谱图。
60.3、毛细管电压：分别选取10v、15v、20v进行一级质谱筛选，在10v时，双醋酚丁响应值为2.41
×
107，脱乙酰比沙可响应值为4.85
×
107；在20v时，双醋酚丁响应值为3.25
×
107，脱乙酰比沙可响应值为6.77
×
107；在15kv时，双醋酚丁响应值为4.02
×
107，脱乙酰比沙可响应值为4.75
×
108。最终选取15v，得到灵敏度较高的双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的一级质谱图。
61.4、鞘气流速：分别选取1.0l/min、1.2l/min、1.4l/min、1.6l/min进行一级质谱筛选，在1.0l/min时，双醋酚丁响应值为1.01
×
107，脱乙酰比沙可响应值为4.85
×
107；在1.4l/min时，双醋酚丁响应值为1.23
×
107，脱乙酰比沙可响应值为1.11
×
108；在1.6l/min时，双醋酚丁响应值为2.31
×
107，脱乙酰比沙可响应值为1.03
×
108；在1.2l/min时，双醋酚丁响应值为4.02
×
107，脱乙酰比沙可响应值为1.89
×
108。最终选取1.2l/min，得到灵敏度较高的双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的一级质谱图。
62.5、辅助气流速：分别选取0.10l/min、0.15l/min、0.20l/min进行一级质谱筛选，在0.10l/min时，双醋酚丁响应值为1.13
×
107，脱乙酰比沙可响应值为9.45
×
107；在0.20l/min时，双醋酚丁响应值为1.27
×
107，脱乙酰比沙可响应值为2.36
×
108；在0.15l/min时，双醋酚丁响应值为4.02
×
107，脱乙酰比沙可响应值为1.89
×
108。最终选取0.15l/min，得到灵敏度较高的双醋酚丁及脱乙酰比沙可啶的一级质谱图。
63.6、子离子碰撞电压：针对双醋酚丁母离子402，分别选取30v、40v、45v、50v、60v，在30v时，双醋酚丁响应值为1.08
×
107；在40v时，双醋酚丁响应值为1.89
×
107；在50v时，双醋酚丁响应值为2.83
×
107；在60v时，双醋酚丁响应值为2.41
×
107；在45v时，双醋酚丁响应值
为3.98
×
107。最终选取45v，得到灵敏度较高的双醋酚丁二级质谱图。
64.针对脱乙酰比沙可啶母离子278，分别选取20v、30v、35v、38v、40v、50v，在20v时，脱乙酰比沙可啶响应值为2.97
×
107；在30v时，脱乙酰比沙可啶响应值为3.46
×
107；在35v时，脱乙酰比沙可啶响应值为4.52
×
107；在40v时，脱乙酰比沙可啶响应值为5.77
×
107；在50v时，脱乙酰比沙可啶响应值为5.25
×
107；在38v时，脱乙酰比沙可啶响应值为1.04
×
108。最终选取38v，得到灵敏度较高的脱乙酰比沙可啶二级质谱图。
65.采用下面优化后的条件进行检测：
66.(1)色谱条件
67.色谱柱：资生堂c18柱(150
×
4.6mm，5m)，或性能相当者
68.流动相：乙腈
‑
10mmol/l乙酸铵水溶液50:50
69.流速：0.5ml/min
70.柱温：35℃
71.进样量：10μl
72.(2)质谱条件
73.离子源：电喷雾离子化源(esi)
74.扫描方式：正离子扫描
75.检测方式：一级全扫描，二级全扫描
76.离子源喷射电压：5.0kv；毛细管温度：275℃；毛细管电压：15v；鞘气流速：1.2l/min；辅助气流速：0.15l/min。
77.目标化合物母离子及子离子见表1。对照以一级、二级扫描图谱中母离子及子离子是否一致进行定性判断。
78.表1
79.目标化合物母离子(m/z)子离子(m/z)双醋酚丁402224、266脱乙酰比沙可啶278184
80.试样测定
81.将混合标准工作液、试样溶液、空白对照溶液以及模拟样品溶液分别注入高效液相色谱
‑
离子阱质谱仪中测定，根据保留时间和一级全扫描质谱和二级全扫描质谱进行快速定性。
82.本发明的方法同时测定脱乙酰比沙可啶和双醋酚丁，保留时间分别为4.9分(脱乙酰比沙可啶)和15.8分(双醋酚丁)，对于标准品的检测结果其色谱如图1所示，图中，上图为脱乙酰比沙可啶，下图为双醋酚丁，脱乙酰比沙可啶标准品的一级质谱图如图2所示，双醋酚丁标准品的一级质谱图如图3所示，图4和图5分别是脱乙酰比沙可啶和双醋酚丁标准品的二级质谱图。结果判断试样溶液色谱中，若检出与标准品保留时间一致的色谱峰，且该色谱峰的一级全扫描质谱及二级全扫描质谱均与标准品一致，且空白对照溶液无干扰，则认定检出相应化合物。
83.实施例2
84.在检测食品或保健食品中是否含有非法添加的化学物质双醋酚丁，可采用如下方法，首先精密称取双醋酚丁标准品10mg(精确至0.00001g)，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解
并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml的标准品储备液，精密量取双醋酚丁准品储备液1ml，至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为10μg/ml的标准工作液。取样品适量混匀，通过人工添加双醋酚丁进行检测模拟样品的检测，如在挂耳式滤泡咖啡中按0.5mg/g加入双醋酚丁混合后作为固体样品，将固体样品研细，精密称取粉末1g，置于50ml容量瓶中加入甲醇30ml，超声提取30min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，制成模拟样品溶液。另不加试样，与试样同法处理制成空白对照溶液。分别注入高效液相色谱
‑
离子阱质谱仪中采用实施例1中优化后的条件进行测定，试样溶液色谱中，检测结果显示模拟样品中检出与双醋酚丁标准品保留时间一致的色谱峰，且该色谱峰的一级全扫描质谱(母离子402)及二级全扫描质谱(子离子224、266)均与标准品一致，且空白对照溶液无干扰，认定模拟样品中检出双醋酚丁。
85.实施例3
86.在检测食品或保健食品中是否含有非法添加的化学物质脱乙酰比沙可啶，首先精密称取脱乙酰比沙可啶标准品10mg(精确至0.00001g)，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml的标准品储备液，精密量取脱乙酰比沙可啶准品储备液1ml，至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为10μg/ml的标准工作液。取样品适量混匀，通过人工添加脱乙酰比沙可啶进行检测模拟样品的检测，如在挂耳式滤泡咖啡中按加入0.5mg/g加入脱乙酰比沙可啶，混合后作为固体样品，将固体样品研细，精密称取粉末1g，置于50ml容量瓶中，加入甲醇30ml，超声提取30min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，制成模拟样品溶液。另不加试样，与试样同法处理制成空白对照溶液。分别注入高效液相色谱
‑
离子阱质谱仪中采用实施例1中优化后的条件进行测定，试样溶液色谱中，检测结果显示模拟样品中检出与脱乙酰比沙可啶标准品保留时间一致的色谱峰，且该色谱峰的一级全扫描质谱(母离子278)及二级全扫描质谱(子离子184)均与标准品一致，且空白对照溶液无干扰，则认定模拟样品中检出脱乙酰比沙可啶。
87.实施例4
88.在检测食品或保健食品中是否含有非法添加的化学物质双醋酚丁和脱乙酰比沙可啶，首先精密称取脱乙酰比沙可啶标准品10mg(精确至0.00001g)，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml的标准品储备液，精密量取脱乙酰比沙可啶标准品储备液1ml。
89.精密称取双醋酚丁标准品10mg(精确至0.00001g)，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml的标准品储备液，精密量取双醋酚丁标准品储备液1ml。
90.将乙酰比沙可啶准品储备液1ml和双醋酚丁准品储备液1ml一同加入10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为10μg/ml的标准工作液。取样品适量混匀，过人工添加脱乙酰比沙可啶和双醋酚丁各10μg/g，制成模拟样品溶液，进行检测模拟样品的检测，如在挂耳式滤泡咖啡中加入按每g挂耳式滤泡咖啡中加入600μg双醋酚丁，同时加入550μg脱乙酰比沙可啶混合均匀后获得固体样品，将固体样品研细，精密称取粉末1g，置于50ml容量瓶中，加入甲醇至30ml，超声提取30min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，制成模拟样品。另不加试样，与试样同法处理制成空白对照溶液。分
别注入高效液相色谱
‑
离子阱质谱仪中按实施例1中优化后的条件测定，试样溶液色谱中，检测结果显示模拟样品中检出与脱乙酰比沙可啶标准品保留时间一致的色谱峰，且该色谱峰的一级全扫描质谱(母离子278)及二级全扫描质谱(子离子184)均与标准品一致，且空白对照溶液无干扰，可认定模拟样品中含有脱乙酰比沙可啶；同时检测结果显示模拟样品中检出与双醋酚丁标准品保留时间一致的色谱峰，且该色谱峰的一级全扫描质谱(母离子402)及二级全扫描质谱(子离子224、266)均与标准品一致，且空白对照溶液无干扰，认定模拟样品中检出双醋酚丁。
91.采用上述方法，本发明对35批样品进行检测(分别包括市购的1、汤臣倍健左旋肉碱茶多酚片、2、碧生源牌常菁茶，3、共轭亚油酸绿茶肉碱软胶囊，4、樱花牌决明子山楂茶、5、唐传牌l
‑
阿拉伯糖粉、6、紫薯魔芋粉、7、综合植物果蔬复合水果压片糖果8、果蔬纤维素压片糖果及赠品小粉片、赠品酵素片等)，其中阴性检出34批，阳性检出1批(其中果蔬纤维压片糖果的赠品小粉片中检出脱乙酰吡沙可啶)。
92.阳性样品，以及本发明相关的样品+标准品的溶液的图谱极为相似，而阴性样品的图谱也都类似一条直线，都极为相似，因此各阳性图谱和阴性图谱只分别列出一组，作为有代表性的图谱。其中对于阳性样品的色谱图如图6所示，阳性样品的脱乙酰比沙可啶的一级质谱图如图7所示，阳性样品的双醋酚丁的一级质谱图如图8所示，阳性样品的脱乙酰比沙可啶的二级质谱图如图9所示，阳性样品的双醋酚丁的二级质谱图如图10所示。对于阴性样品例举一个检测样品的结果，其色谱图如图11所示。对于阳性的样品(其中果蔬纤维压片糖果的赠品小粉片中检出脱乙酰吡沙可啶)也列出检测样品的结果，其色谱图如图12所示，空白对照溶液的色谱图如图13所示。
93.采用此方法进行减肥类食品(含保健食品)中双醋酚丁和/或脱乙酰比沙可啶的测定，仅需将样品溶解过滤后直接测定，与对照品的一级二级质谱比对，可快速准确进行定性测定，且该方法可将双醋酚丁与脱乙酰比沙可啶有效分离，两者之间不产生干扰，同时测定产品两种成分均可准确测定。
94.实施例5灵敏度检测
95.称取紫薯魔芋粉1g，置50ml量瓶中，加入不同浓度的的双醋酚丁标准溶液100μl，和不同浓度的脱乙酰比沙可啶标准溶液100μl，用甲醇稀释至刻度，摇匀后，做成一系列梯度浓度的标准液。用0.22μm有机相微孔滤膜过滤，取滤液，注入高效液相色谱
‑
离子阱质谱仪中测定，按实施例1中优化后的操作进行检测，通过此方法进行灵敏度的测量。最后对于2.5μg/ml的双醋酚丁标准溶液100μl，1μg/ml脱乙酰比沙可啶标准溶液100μl，可检测出结果，由此结果说明脱乙酰比沙可啶的检出限为0.1mg/kg，色谱图结果如图14所示，双醋酚丁的检出限为0.25mg/kg或0.25mg/l，色谱图结果如图15所示，具有较高的检测灵敏度。