组织细胞分割采样系统和方法与流程

本发明属于生物医学领域，涉及一种生物组织或培养物的分割采样系统和分割采样方法，以及一种分析组织块或细胞团块样品的方法。

背景技术：

生物组织可由多种不同种类、功能的细胞组成，位于组织中不同位置的细胞各有其特定的基因表达模式。在培养的细胞团块中，处于不同微环境中的细胞亦有其各自的表达谱。为了研究细胞的分化、迁移、侵袭、相互作用等各种过程，有必要对组织或培养物中特定的一些细胞加以分离和分析。

目前使用的细胞取样分析方法还有各种不足。例如，一种现有方法是对组织或细胞团块进行酶处理或物理处理使其解离，然后通过流式细胞术或微流控技术分离出单细胞，但这一过程将损失细胞所处的空间位置信息，并且细胞从原本所处的环境中解离的过程可能造成对细胞转录的干扰。

另一种方法是将组织块或细胞固定后进行机械切片，但固定和染色时间长，且切片过程难以控制，不能保证切到感兴趣的目标区域。

显微操作可以实现对样品中特定位置细胞的准确拾取，但该方法对实验人员个人操作技巧有很高要求，且耗时长、效率非常低，完全无法满足高通量分析的需求。

目前较先进的一种方法是对组织或细胞团块进行共聚焦荧光显微光学切片断层成像，即，获取样品在z方向上不同深度的x-y方向二维图像(即光学切片)，将多个二维x-y图像沿着z方向排列，重建出样品的三维图像，然后利用该三维图像指导激光对选定区域进行切割。但是该方法需要对样品进行免疫荧光染色或要求样品本身带有荧光标记，染色或标记的过程繁琐，且样品稍厚即会导致染色效果急剧下降，对于较大的组织块、细胞团块无法直接处理，因此该方法的适用范围非常有限。

技术实现要素：

鉴于现有技术对于组织块或细胞团中特定位置的细胞取样还存在各种不足，本公开提供一种生物组织或培养物的分割采样方法、为实现该方法所使用的系统，以及一种分析组织块或细胞团块样品的方法，以解决现有技术一方面或多方面的问题。

为实现上述目的，本公开提供一种组织细胞分割采样系统，包括：

用于承载待分割采样的样品的载样器；

用于对所述样品的表面进行扫描的扫描器；

用于切割所述样品的切割器；

用于承载所述载样器、扫描器、切割器的机架；和

控制处理系统；

其中，所述控制处理系统控制所述扫描器采集所述样品的表面扫描数据，利用所述表面扫描数据构建表现所述样品形状的三维几何数字模型，根据在所述三维几何数字模型中选定的一个或多个切割目标区域控制所述切割器从所述样品中切下一个或多个切块。

在进一步的实施方案提供的组织细胞分割采样系统中，所述机架上安装有机械致动装置，所述机械致动装置在所述控制处理系统的控制下使所述载样器和所述扫描器之间、所述载样器和所述切割器之间发生相对运动。

在进一步的实施方案提供的组织细胞分割采样系统中，所述控制处理系统包括处理器、存储器，所述存储器存储供所述处理器执行的机器可执行指令，通过执行所述机器可执行指令，使所述处理器：

-向所述机械致动装置和所述扫描器发送扫描控制信号，令所述扫描器采集所述样品的表面扫描数据；

-利用所述表面扫描数据构建表现所述样品表面形状的三维几何数字模型；

-在所述三维几何数字模型中选定一个或多个切割目标区域；

-基于所述三维几何数字模型和所述样品的实际位置的对应关系，根据所述切割目标区域的坐标产生切割控制信号；

-向所述机械致动装置和所述切割器发送切割控制信号，令所述切割器按照选定的切割目标区域从所述样品中切下一个或多个切块；

-记录切下的每个切块的编号，建立切块编号和对应的切割目标区域坐标的映射。

在进一步的实施方案提供的组织细胞分割采样系统中，所述组织细胞分割采样系统还包含转运系统，用于转运从所述样品中切下一个或多个切块。

在进一步的实施方案提供的组织细胞分割采样系统中，所述切割器为激光切割器。

在进一步的实施方案提供的组织细胞分割采样系统中，所述组织细胞分割采样系统还包括光路系统，所述光路系统用于改变从所述激光切割器发出的激光光束的传播方向。

在进一步的实施方案提供的组织细胞分割采样系统中，所述切块的形状为正方体、长方体或圆柱体，所述正方体或长方体的底面边长为0.1-5mm，所述圆柱体的底面直径为0.1-5mm。

本公开还提供一种组织细胞分割采样方法，包括以下步骤：

s1：扫描待分割采样的样品的表面，采集样品表面扫描数据；

s2：利用步骤s1采集到的样品表面扫描数据构建表现样品形状的三维几何数字模型；

s3：从构建的三维几何数字模型中选定一个或多个切割目标区域；

s4：按照选定的切割目标区域从样品中切下一个或多个切块；

s5：收集切割下来的切块，记录每个切块的编号，建立切块编号和对应的切割目标区域坐标的映射。

本公开还提供一种分析组织块或细胞团块样品的方法，包括以下步骤：

s1：扫描待分析的样品的表面，采集样品表面扫描数据；

s2：利用步骤s1采集到的样品表面扫描数据构建表现样品形状的三维几何数字模型；

s3：从构建的三维几何数字模型中选定一个或多个切割目标区域；

s4：按照选定的切割目标区域从样品中切下一个或多个切块；

s5：收集切割下来的切块，记录每个切块的编号，建立切块编号和对应的切割目标区域坐标的映射；

s6：将所述切块消化处理为单细胞悬液，送至单细胞测序；

s7：获得单细胞的基因表达谱后，回溯各单细胞的来源，绘制所述样品中不同空间位置的细胞表达谱。

综上所述，本公开的技术方案具备以下优点：

1、本公开的组织细胞分割采样系统和方法是由样品表面扫描数据建立的三维数字模型所引导的，因此不要求样品透明，也不要求样品带有荧光标记，对各种来源的组织细胞样品的分割均广泛适用。

2、根据本公开的系统和方法的原理，待切割样品不需进行固定、包埋、染色、荧光标记等前处理，大幅简化了样品处理过程。

3、本公开的切割过程由计算机控制，可精确地切割样品的目标部位。对于现有技术难以处理的较大、较厚的组织细胞样品，利用本公开的系统和方法也可简便准确地从样品内部取到感兴趣位置的切块。

4、本公开的系统和方法可以实现对每一切块在原始样品中所处空间位置的回溯。通过对组织块或细胞团块中特定部位的准确取样和位置回溯，推动更精准全面的生命科学研究。

5、本公开的系统和方法切割组织细胞的效率高，可满足高通量分析的要求，且操作简便，大幅降低操作人员培训学习的成本。

附图说明

参考以下附图，根据一个或多个不同实施例对本公开进行详细描述。提供的附图是为了便于理解本公开，而不应认为是对本公开的广度、范围、尺寸或适用性的限制。为了便于说明，附图不一定按比例绘制。

图1a为本公开的一种示例性的生物样品分割采样装置的正面观示意图。

图1b为本公开的一种示例性的生物样品分割采样装置的侧面俯视示意图。

图1c为本公开的一种示例性的生物样品分割采样装置的侧面仰视示意图。

图2a为本公开的一种示例性的生物样品分割采样装置的样品穿挂处局部放大示意图。

图2b、2c、2d、2e为本公开的一种示例性的生物样品分割采样装置切割样品目标区域过程的示意图。

具体实施方式

本公开提供的组织细胞分割采样系统包括载样器、扫描器、切割器、机架、控制处理系统。在进一步的实施方式中，还可包括其他附加部件。

载样器

载样器用于承载待分割采样的组织块或细胞团块样品(以下将待分割采样的组织块或细胞团块样品简称为“样品”)。载样器可以是供样品放置于其上的样品台，也可以是供样品悬挂的挂钩或挂针。

扫描器

扫描器可以是各种非接触主动式扫描器，其将额外的能量(如可见光束、超声波、x射线等)投射至样品，借由能量的反射来计算样品的三维空间信息。一种代表性的扫描器为3d激光扫描器。扫描器用于对样品的表面进行扫描，以供构建出表现样品形状的三维几何数字模型。

切割器

切割器用于对样品的指定区域进行切割。切割器的具体形式可以是刀片、激光切割器等，从切割精度出发，优选激光切割器。

机架

载样器、扫描器、切割器安装在机架上。机架可进一步包括机械致动装置，其与选自载样器、扫描器、切割器的一种或多种部件连接。在控制处理系统的控制下，机械致动装置使载样器和扫描器之间、载样器和切割器之间发生相对运动，以完成样品表面扫描和切割过程。机械致动装置的具体形式不限，例如可以是步进马达、直流马达、液压马达等，配合适当的传动装置，如齿条、齿轮、皮带、滚轮等。

关于扫描样品表面的方式，可以是固定载样器，通过机械致动装置使扫描器在水平和竖直方向平移和/或使扫描器旋转而完成扫描；或者，也可以是固定扫描器，通过机械致动装置使载样器在水平和竖直方向平移和/或使载样器旋转而完成扫描；还可以通过机械致动装置使载样器、扫描器均进行移动(平移或旋转)而完成扫描。

关于切割样品的方式，可以是固定载样器，通过机械致动装置使切割器在水平和竖直方向平移和/或使切割器旋转而对样品的指定区域进行切割；或者，也可以是固定切割器，通过机械致动装置使载样器在水平和竖直方向平移和/或使载样器旋转而对样品的指定区域进行切割；还可以通过机械致动装置使载样器、切割器均进行移动(平移或旋转)而完成扫描。

控制处理系统

控制处理系统可包括处理器、存储器。存储器存储供处理器执行的机器可执行指令，通过执行指令，处理器进行：

-向机械致动装置和扫描器发送扫描控制信号，令扫描器采集样品的表面扫描数据；

-利用样品的表面扫描数据构建表现样品表面形状的三维几何数字模型；

-在构建的三维几何数字模型中选定一个或多个切割目标区域；

-基于三维几何数字模型和样品实际位置的对应关系，根据选定的切割目标区域的坐标产生切割控制信号；

-向机械致动装置和切割器发送切割控制信号，令切割器按照选定的切割目标区域从样品中切下一个或多个切块；

-记录切下的每个切块的编号，建立切块编号和对应的切割目标区域坐标的映射。

本文所称的存储器涵盖各种形式的计算机可读存储介质，包括但不限于随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、硬盘、光盘、闪存等，还可以是能够被计算机装置经由网络或通信链路访问的其他存储介质等。

本文所称的处理器是能够执行程序或机器可执行指令的电子部件。计算装置可包括一个或多个处理器，多个处理器可以在相同的计算装置之内，或者甚至可以分布于多个计算装置之间。

优选地，控制处理系统还可包括供用户或操作员与计算机或计算机系统交互的接口。向操作员提供信息的范例包括在显示器或图形用户界面上显示数据或信息。从操作员接收信息的范例包括通过键盘、鼠标、触摸板、麦克风、摄像头、遥控器等接收数据。

关于处理器和安装在机架上的各个部件的连接，可以是物理接触的电路连接，也可以是无线通信信号连接。

切割目标区域的形状不限，例如可以是正方体、长方体或圆柱体。从方便切割过程的角度出发，优选每个切割目标区域的形状为正方体或长方体。根据选定的切割目标区域从样品中切下一个或多个切块，切块的尺寸没有限制，可根据实际需要而确定。优选地，正方体切块的边长可以是0.1-5mm，进一步优选1-2mm；长方体切块的底面边长优选0.1-5mm，进一步优选1-2mm，长方体切块的高优选0.1-5mm，进一步优选1-2mm；圆柱体切块的底面直径优选0.1-5mm，进一步优选1-2mm，圆柱体切块的高优选0.1-5mm，进一步优选1-2mm。

另外，在进一步优选的实施方式中，本公开的生物样品取样系统还可包含其他配件。

例如，本公开的生物样品取样系统还可包含转运系统，用于转运切割下来的样品块。例如，转运系统可包含机械臂、容器，切割器切下的每个切块通过自身重力或在机械臂的推动下落入容器中，容器被输送到指定的位置，例如带有编号的样品架的格子中。

例如，在切割器选用激光切割器的情况下，本公开的生物样品取样系统还可包含光路系统，例如反射镜系统、多关节导光臂、光纤等，用于对激光切割器发出的激光光束的传播方向进行改变和调节，以实现激光切割方向的灵活控制。

本公开还提供一种组织细胞分割采样方法，包括以下步骤：

s1：对待分割采样的组织块或细胞团块样品的表面进行扫描，采集样品表面扫描数据；

s2：利用步骤s1采集到的样品表面扫描数据构建表现样品表面形状的三维几何数字模型；

s3：从构建的三维几何数字模型中选定一个或多个切割目标区域；

s4：按照选定的切割目标区域从样品中切下一个或多个切块；

s5：收集切割下来的切块，记录每个切块的编号，建立切块编号和对应的切割目标区域坐标的映射。

按选定的目标区域从组织块或细胞团块样品中切下一个或多个切块后，可将切块送至后续的分析。可根据实际需要选择后续的分析项目，例如免疫组化、免疫荧光、蛋白质谱分析等，按现有的一般方法开展分析即可。一种优选的后续分析方法是将切块消化制备为单细胞悬液，然后开展单细胞测序。根据实际需要，对于切块的后续分析还可采用多种分析方法联用的方式进行。

获得各切块的后续分析结果后，回溯各切块在原始组织块或细胞团块样品中的空间位置，可建立组织块或细胞团块样品内部不同区域的生物化学概貌。以后续分析方法选择单细胞测序为例，在获得单细胞的基因表达谱后，回溯各单细胞的来源(即，根据该细胞来源于哪一个切块，通过该切块编号和对应的切割目标区域坐标的映射，确定该细胞来自原始组织块或细胞团块样品的什么空间位置)，即可描绘出原始组织块或细胞团块样品中不同空间位置的细胞表达谱情况，从而了解不同位置、不同微环境下的细胞的基因表达特性。

下面通过实施例对本公开的生物样品取样系统和生物样品取样方法作进一步说明。

图1a-1c示出了本公开的一种示例性的生物样品分割采样装置。将样品(组织块)穿挂在样品台1上，通过第一步进马达41将样品台1的高度调节为正对3d激光扫描器2。操作员通过计算机(未示出)发出扫描指令，使3d激光扫描器2沿着轨道3围绕样品台1旋转，完成对样品表面的扫描。

扫描数据发送至计算机，由此建立样品的三维几何数字模型，在显示器(未示出)上显示。操作员观察样品的三维几何数字模型，从数字模型表现的几何体内部和/或表面选定感兴趣的一个或多个切割区域(切割目标区域)。计算机系统辅助建立取样路线，控制第二步进马达42、第三步进马达43运作，从而带动激光切割器5沿xy平面平移，并控制第四步进马达44运作，从而带动平面镜组6移动，通过平面镜组调整激光光束方向。计算机系统同时控制激光切割器5产生激光束，按照选定的切割目标区域从样品中切下切块，切块掉落到放置在机械臂7上的试管中。如果切割目标区域有多个，则每切下一个切块，更换一支试管，将每个切块分别放置在不同的试管中。计算机记录每个试管盛放的切块的编号及该切块在原始样品中的位置坐标。

图2a-e进一步解释将感兴趣的切割区域从样品中切下的详细过程。图2a将样品穿挂处局部放大，虚线部分示出选定的感兴趣的切割区域。以粗激光束81将选定区域周围的非目标组织灼烧气化(图2b)，以竖直射出的第一细激光束82切割目标区域在xy平面的边界(图2c)，通过平面镜组调整光束方向形成水平的第二细激光束83，第二细激光束83切割目标区域在z方向的边界(图2d)，得到约2×2×2mm的目标组织切块9，其包含约10⁶个细胞(图2e)。

按照选定的切割目标区域切割下一个或多个切块后，将各个切块分别消化处理，制备成单细胞悬液，后续进行单细胞测序。得到单细胞测序结果后，根据单细胞来源于哪个切块，以及该切块从原样品什么位置切割而来，可建立原样品组织块不同位置的细胞表达图谱。

由于引导目标区域切割过程的三维模型是由样品的表面扫描数据建立的，因此不要求样品透明，也不要求样品带有荧光标记，因此本公开的切割系统和切割方法对于各种来源的组织块、细胞团块样品均广泛适用。

虽然已经参考优选实施例详细地示出和描述了本发明的特征，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的精神的情况下，可以在其中进行其他改变。同样地，各种图可以描绘用于本公开的示例性架构或其他配置，其用于理解可以包括在本公开中的特征和功能。本公开不限于所示出的示例架构或配置，而是可以使用各种替代架构和配置来实现。另外，尽管以上根据各种示例性实施例和实现描述了本公开，但是应当理解，在一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不限于它们对于它们所属的特定实施例的适用性的描述。相反，它们可以单独地或以某种组合方式应用于本公开的一个或多个其他实施例，无论是否描述了这样的实施例，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施例的一部分。因此，本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施例的限制。