一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤化疗、免疫抑制剂等药物的广泛应用，条件致病性真菌感染，特别是深部真菌感染的发病率呈明显上升趋势。白念珠菌是最常见的条件致病性共生真菌之一，是健康人体微生物群的一部分，存在于宿主的口腔、表皮、胃肠道及阴道等处，在免疫功能低下的患者中可引起严重和频繁的粘膜念珠菌感染，如口腔和阴道的念珠菌病(vvc)或系统性念珠菌血症。感染后病情发展快，在国内综合医院白念珠菌感染病死率达37.7％。目前治疗真菌感染的有效手段仍是抗生素类药物治疗，而与其他微生物相比，念珠真菌的结构更加复杂，拥有细胞壁结构，而且感染无特异性临床表现，极易导致漏诊误诊，影响疾病的治疗。因此对白念珠菌感染的早期发现和准确鉴定对于临床给药治疗以及流行病学研究意义重大。
3.传统的真菌实验室诊断方法主要包括真菌分离培养法、组织病理鉴定、pcr法等，病理鉴定的特异度和灵敏度均较低，同时检测周期长，不能快速将白念珠菌与其他念珠菌区分，存在诊断给药延迟的可能；真菌分离培养法特异度高，能分辨菌属，但取材要求高，培养要求高，检测周期长，有假阴性；pcr法耗时长，需要较高的实验室条件，无法推广普及。临床常用的真菌快速检测方法有koh湿片法、真菌镜检、革兰氏染色法、荧光检测法等。其中koh湿片法操作简单，常有各种杂质导致视野背景较杂乱，非常依赖检测人员的经验与技术水平但灵敏度、特异性及准确率低；革兰氏染色法操作较为复杂，结果不准确，无法确认是否为真菌感染，而其他创伤性诊断手段常受到患者病情和身体状况的限制。
4.荧光检测法是一种已有较多应用的快速检测真菌方法。市场上流通的荧光检测真菌试剂盒，主要成分为荧光试剂、促溶剂和背景染料。目前常用的荧光试剂为calfluor white(cfw),能与真菌细胞壁内的几丁质成分结合，在紫外的激发下发生蓝色荧光。但cfw特异性结合能力较差，可以与大部分真菌结合，需要另外人工判断菌属，同时淬灭时间短，能使背景组织发出明亮的荧光，影响真菌与背景的判断。所以cfw一般需要联合背景染料以去除背景干扰，利用促溶剂分解待测样品角质层。后来市场上出现利用重组几丁质酶标联的荧光素试剂盒检测真菌，此类方法提高了特异性和稳定性，但是生物酶较容易失活不易保存，而且几丁质酶检测法是广谱真菌检测方法，不能特异性识别白念珠菌。因此，有必要提供一种高特异性、高灵敏度的特异性白念珠真菌荧光染色液，以解决现有技术中的不足。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用，以解决上述技术问题。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.第一方面，本发明提供了一种特异性白念珠真菌荧光染色液，每1l特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.05～0.15g、链霉亲和素
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荧光素复合物0.05～1g、渗透剂5～25g、稳定剂30～225g、抗猝灭剂7～35g。
8.优选的，所述粘附肽原液中粘附肽的序列为apklripslk
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biotin，分子结构式如i所示：
9.优选的，所述粘附肽原液是由粘附肽粉末和含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液配制成的。
10.进一步优选的，所述含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液包括氯化钠8g/l、氯化钾0.2g/l、磷酸氢二钠1.44g/l、磷酸二氢钾0.24g/l，所述含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液的ph值为8.0，所述含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液中的二甲基亚砜的重量百分比为1％。
11.优选的，所述粘附肽原溶液中粘附肽的浓度为0.5～2mg/ml，更进一步优选为1mg/ml。
12.优选的，所述链霉亲和素
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荧光素复合物为采用下述方法制得：
13.将荧光素溶于硼酸盐缓冲液a中，再加入碳二亚胺盐酸盐和n
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羟基硫代琥珀酰亚胺，反应3～10min，调节溶液的ph值至8.0～8.5后加入链霉亲和素，混匀后持续反应1～3h；向所得的溶液中加入含5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭5～20min终止反应，经离心、除去沉淀后，用硼酸盐缓冲液b在截留分子量100k的超滤离心管中洗涤得到链霉亲和素
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荧光素复合物。
14.进一步优选的，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明
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异硫氰酸中的至少一种。
15.进一步优选的，所述硼酸盐缓冲液a的ph值为5.0～6.0，更进一步优选为5.5。
16.进一步优选的，所述荧光素、碳二亚胺盐酸盐和n
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羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1000:2000。
17.进一步优选的，所述链霉亲和素与荧光素的摩尔比为20:1。
18.进一步优选的，所述硼酸盐缓冲液b的ph值为6.5～7.5，更进一步优选为7.0。
19.优选的，所述渗透剂为二甲基亚砜、二甲基乙酰胺中的至少一种。
20.优选的，所述稳定剂为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠中的至少一种。
21.优选的，所述抗淬灭剂为丙三醇、抗坏血酸中的至少一种。
22.优选的，所述特异性白念珠真菌荧光染色液还含有保湿剂。
23.进一步优选的，所述保湿剂为丙三醇、丁二醇中的至少一种。
24.第二方面，本发明提供的一种如第一方面所述的特异性白念珠真菌荧光染色液的制备方法，包括如下步骤：
25.(1)将粘附肽原液与链霉亲和素荧光素复合物，在室温下孵育10～40min，摇晃彻底，并进行避光保存，得到复合物溶液；
26.(2)将所得的复合物溶液、稳定剂、抗淬灭剂、渗透剂和水混合均匀后，定容至1l即得特异性白念珠真菌荧光染色液。
27.第三方面，本发明提供的一种特异性白念珠真菌的检测方法，包括如下步骤：
28.(1)将待测的含有微生物的样本稀释液移至载玻片中间区域，制片完成；
29.(2)将如第一方面所述的特异性白念珠真菌荧光染色液滴加到样本稀释液进行覆盖，在25～37℃下孵育5～30min即可完成染色；
30.(3)取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片，吸取多余液体；
31.(4)取样片载玻片于荧光显微镜下以400～600nm的波段进行观测白念珠菌群的形态及荧光强度。
32.为了便于理解本发明，现对本发明中的相关原理作进一步解释，具体如下：
33.白念珠菌在获得致病性条件侵染宿主之前，会先由酵母态转换为假丝态生长出菌丝。这种菌丝状态促进了白念珠菌的侵染能力，同时协助白念珠菌逃逸宿主的免疫。假丝态使白念珠菌获得强侵染能力的原因之一就是在菌丝结构中含有强粘附蛋白als族，它包括至少8个糖蛋白编码基因(als1至als7和als9)，足以粘附到人细胞和细胞外基质等成分。
34.粘附肽是由多个氨基酸残基组成的，具有粘合真菌蛋白质功能的短肽链；观察到能够和菌丝中强粘附蛋白als族结合的粘附肽具有共同的序列“τφ+”，由具有高转角倾向的氨基酸(τ：a、d、g、k、n、p或s)、紧随其后的具有较大疏水性或芳香族残基的氨基酸(φ：f、h、i、l、m、t、v、w或y)组成，最后是带正电的氨基酸(+：r或k)，选用具有以上氨基酸序列的粘附肽即可特异性结合白念珠菌。
35.本发明根据以上原理，选用合适的带有生物素基团的粘附肽序列，采用活泼酯法，使链霉亲和素(streptavidin,sa)标记异硫氰酸荧光素fitc，然后利用链霉亲和素与生物素的高亲和力结合，与带有生物素化基团的粘附肽相结合，构建粘附肽
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异硫氰酸荧光素高特异性荧光探针，以此来对白念珠菌进行荧光标记。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
37.(1)本发明提供的特异性白念珠真菌荧光染色液为一个溶液体系，以水为溶剂，其它所有的成分均匀分散于水中，可稳定共存于同一体系中，在生产、销售、使用过程中，更加方便快捷；
38.(2)本发明提供的特异性白念珠真菌荧光染色液可以特异性检测白念珠菌，稳定性高；
39.(3)本发明染色液中的荧光基团为蓝光激发(490nm)和绿光发射(520nm)，有利于减小紫外伤害，利于镜检观察；
40.(4)本发明提供的制备方法步骤简单，反应条件温和，仅需在常温下搅拌即可完成。
具体实施方式
41.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
42.临床常用的真菌快速检测方法非常依赖检测人员的经验与技术水平但灵敏度、特异性及准确率低革兰氏染色法操作较为复杂，结果不准确，无法确认是否为真菌感染，而其他创伤性诊断手段常受到患者病情和身体状况的限制。荧光检测法当中，生物酶较容易失活不易保存。总的来说，白念珠真菌荧光染色液的特异性和灵敏度不理想。以下实施例提供高特异性、高灵敏度的特异性白念珠真菌荧光染色液，以解决现有技术中的不足。
43.以下实施例中的粘附肽的序列为apklripslk
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biotin，分子结构式如i所示：
44.实施例1链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物的制备
45.按照异硫氰酸荧光素、碳二亚胺盐酸盐和n
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羟基硫代琥珀酰亚胺按照1:1000:2000的摩尔比，将50μl异硫氰酸荧光素(3mg/ml)溶于50μl、ph值为5.5的硼酸盐缓冲液中，再加入碳二亚胺盐酸盐和n
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羟基硫代琥珀酰亚胺，反应3～10min，调节溶液的ph值为8.0～8.5，随后按链霉亲和素与异硫氰酸荧光素的摩尔比为20:1的比例加入链霉亲和素，混匀后持续反应2h，加入10μl含5％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)封闭10min终止反应，经离心、除去沉淀后，用ph值为7.0的硼酸盐缓冲液在截留分子量100k的超滤离心管中洗涤得到链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物，并将链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物重悬于ph值为7.0的硼酸盐缓冲液中，最后采用1％琼脂糖凝胶电泳验证偶联成功，证实链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物制备成功。
46.实施例2粘附肽原液的配制
47.将粘附肽粉末用含二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液(包括8.0g/l氯化钠、0.2g/l氯化钾、1.44g/l磷酸氢二钠、0.24g/l磷酸二氢钾，二甲基亚砜1％(质量百分比)，ph值为8.0)配制原液，原液中粘附肽的浓度为1mg/ml。
48.实施例3
49.将粘附肽原液与链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物，在室温下孵育30min，摇晃彻底，并进行避光保存，得到复合物溶液，向烧杯中加入500ml纯化水，将所得复合物溶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、丙三醇和二甲基亚砜混合均匀，定容至1l得到特异性白念珠真菌
荧光染色液，每1l特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.05g、链霉亲和素
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荧光素复合物0.05g、磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钠20g、丙三醇7g、二甲基亚砜5g。
50.实施例4
51.将粘附肽原液与链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物，在室温下孵育30min，摇晃彻底，并进行避光保存，得到复合物溶液，向烧杯中加入500ml纯化水，将所得复合物溶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、丙三醇和二甲基亚砜混合均匀，定容至1l得到特异性白念珠真菌荧光染色液，每1l特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.1g、链霉亲和素
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荧光素复合物0.5g、磷酸二氢钾50g、磷酸氢二钠100g、丙三醇50g、二甲基亚砜15g。
52.实施例5
53.将粘附肽原液与链霉亲和素
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异硫氰酸荧光素复合物，在室温下孵育30min，摇晃彻底，并进行避光保存，得到复合物溶液，向烧杯中加入500ml纯化水，将所得复合物溶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、丙三醇和二甲基亚砜混合均匀，定容至1l得到特异性白念珠真菌荧光染色液，每1l特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.15g、链霉亲和素
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荧光素复合物1g、磷酸二氢钾75g、磷酸氢二钠150g、丙三醇25g、二甲基亚砜25g。
54.对比例1
55.向烧杯中加入500ml纯化水，将荧光增白剂28(市售产品)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、丙三醇和二甲基亚砜混合均匀，定容至1l得到荧光染色液。
56.应用实施例
57.取上述实施例3～5及对比例1所得的荧光染色液，采用下述方法来检测白念珠真菌：将待测的含有白念珠真菌的样本稀释液移至载玻片中间区域，制片完成；将所得特异性白念珠真菌荧光染色液滴加到样本稀释液进行覆盖，在25～37℃下孵育5～30min即可完成染色；取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片，吸取多余液体；取样片载玻片于荧光显微镜下以400～600nm的波段进行观测白念珠菌群的形态及荧光强度。
58.经观察发现：与对比例1的荧光染色液相比，由本发明实施例提供的粘附肽荧光素染色液进行染色的样本，在显微镜下背景颜色更加分明，观察的荧光显色更加清晰。
59.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。