四氧化三钴作为基质在MALDI-TOFMS检测小分子中的应用

本发明涉及纳米材料合成及质谱检测领域，尤其是涉及四氧化三钴作为基质在maldi-tofms检测小分子中的应用。

背景技术：

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,maldi-tofms)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，主要通过对样品离子质荷比(m/z)的分析而实现对样品进行精准定性和定量分析；主要应用于生物大分子特别是蛋白质研究领域。

maldi-tofms具有灵敏度极高，单次检测只需要极少量样品，可达到10^-12mol甚至10^-15mol的检测限。制样简单，同时可以直接用于混合物的检测分析，可检测的物质分子量范围广泛，上可达几十万道尔顿，分辨率高，获取数据结果非常方便高效。maldi-tofms中基质起到的作用主要如下：(1)吸收激光能量并把能量转移给分析物。这样不仅可把能量转移给分析物使其形成分子离子，还可避免由于过量的能量使分析物裂解；(2)包埋分析物，使分析物分子之间彼此隔离，避免分析物分子之间的缔合，这种缔合会导致质量的复杂化，以至无法进行解吸；(3)适当的基质还会通过其分子的光激发或光离子化作用而把质子转移给分析物，从而加强分析物分子离子的形成。

常用的传统基质有α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)、2,5-二羟基苯甲酸(dhb)、芥子酸(sa)、2,4,6-三羟基苯乙酮(thap)、蒽三酚(di)、3-吲哚丙烯酸(iaa)等。但是，这些传统的有机基质在低质量范围内会出现大量的背景基质质谱信号，严重干扰小分子的测定，导致小分子(m/z<1000)的分析通常会受到限制。同时，这些有机基质结晶不均匀，因此在质谱检测时会产生“甜点”效应，导致检测结果的重复性较差；所以开发一种可用于小分子化合物样品检测的基质材料具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供四氧化三钴作为基质在maldi-tofms检测小分子中的应用。所述纳米四氧化三钴颗粒制备方法简单可控，形貌规整、尺寸均匀、成本低廉、水溶性好，作为maldi-tofms基质可避免使用传统有机基质检测小分子化合物的基质干扰问题，也使得碳基材料作为激光解吸离子化辅助基质时质谱检测的可操作性强、重复性好，实现maldi-tofms对小分子化合物的高通量、高灵敏分析。

本发明的目的通过如下技术方案实施：

四氧化三钴作为基质在maldi-tofms检测小分子物质中的应用。所述纳米四氧化三钴为形貌规整的立方体，粒径大小在15～30nm的纳米材料。

所述应用的具体方法如下：

1)取四氧化三钴颗粒加入乙醇水溶剂，超声分散均匀，制得纳米四氧化三钴基质溶液；

2)取样品溶液点于不锈钢靶板表面，自然干燥形成均匀样品层；

3)取纳米四氧化三钴基质溶液点于样品层上，自然干燥后进行maldi-tofms质谱分析。

在步骤1)中，所述四氧化三钴颗粒与乙醇水溶剂的配比可为10mg︰5～20ml；所述乙醇水溶剂中乙醇与水的体积比为1︰5～5︰1。

在步骤3)中，所述样品为分子量小于1000dalton的氨基酸、脂类化合物、肽、糖类、酚类、农残、激素类、抗生素、食品添加剂等小分子物质中的至少一种。

在步骤3)中，所述maldi-tofms质谱分析中，待测样品溶液与基质溶液的用量比例为(0.01～10)mm︰(0.1～10)g/l。

在步骤3)中，所述取纳米四氧化三钴基质溶液点于样品层上，自然干燥后进行maldi-tofms质谱分析的具体方法可将基质溶液0.5～1μl点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层，再取0.5～1μl的样品溶液点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析；或

先取0.5～1μl的样品溶液点样于基质辅助激光解吸电离靶板，再将基质溶液0.5～1μl点样于样品点上，在室温下在空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析；或

将样品溶液和基质溶液均匀混合，直接取0.5～2μl混合溶液点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下在空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明涉及的纳米四氧化三钴颗粒maldi-tofms基质以醋酸钴为原料，通过水热法合成，条件易控、耗时短、操作简便，制备得到的四氧化三钴为立方体纳米颗粒，尺寸在15～30nm之间，颗粒粒度均一；具有更广泛的maldi-tofms质谱分析的可操作性。

2、相比于传统基质，该立方四氧化三钴纳米颗粒作为基质应用于质谱检测具有更小的背景噪声，能够去除传统基质的背景干扰，使目标物有较好的离子化效率。可用于质谱成像、生物标记物发现、环境分析等复杂样品体系中。

3、纳米四氧化三钴颗粒作为maldi-tofms基质形貌规整、粒径在70～1000nm之间均匀可调，水溶性好，可在maldi-tofms靶上形成均匀的基质层，克服其它纳米材料的大小尺度控制较难及影响maldi-tofms质谱检测的稳定性的不足，能有效消除传统有机基质自身的背景干扰，提高信号的重复性。

4、使用纳米四氧化三钴颗粒作为maldi-tofms基质，解决传统有机基质的背景峰干扰缺陷，可快速高效地实现氨基酸、脂类化合物、多肽、寡糖、糖类、核苷、激素、药物等各种分子量小于1000dalton化合物的高灵敏高通量分析。

5、本发明涉及的纳米四氧化三钴颗粒基质形貌规整、尺寸均匀、成本低廉、水溶性好，克服其它纳米材料如碳纳米管、石墨烯作为maldi-tofms基质的尺度控制难而影响质谱检测稳定的问题，是辅助maldi-ms实现对低分子量区域化合物高灵敏度、高通量分析的优选基质。

附图说明

图1为实施例中所制得四氧化三钴的xrd图；

图2为实施例中所制得直径为15～30nm的四氧化三钴扫描电镜照片；

图3为实施例1中所制得的四氧化三钴作为基质分析的质谱图。其中，(a)为丙氨酸，(b)为天冬酰胺，(c)为组氨酸，(d)为脯氨酸，(e)为丝氨酸，(f)为缬氨酸。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。

本发明下述实施例中所用的检测仪器为：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(maldi-tofms)，仪器型号为autoflexmax。脉冲为nd:yag激光器，发射波长为355nm。

四氧化三钴作为基质在maldi-tofms检测小分子物质中的应用。所述纳米四氧化三钴的制备方法可为：

(1)将0.5g醋酸钴分散于乙醇/水(15ml/10ml)溶液中，室温搅拌15min，形成无色透明溶液；

(2)向步骤(1)加入2.5ml氨水(质量浓度25％)，电磁搅拌10min；

(3)在烘箱里150℃水热反应3h；

(4)将步骤(3)中所得反应液离心，水洗两次，乙醇洗两次；60℃下干燥过夜，得黑色粉末。从图1xrd图中可知，所制得黑色粉末为四氧化三钴。从图2扫描电镜照片可见，所制得四氧化三钴颗粒直径为15～30nm。

实施例1

(1)取纳米四氧化三钴颗粒10mg，加入5～20ml乙醇水溶剂，乙醇与水的体积比为1:5～5:1，超声分散均匀，制得纳米四氧化三钴基质溶液；

(2)取样品溶液点于maldi不锈钢靶板表面，自然干燥形成均匀样品层；

(3)取0.5μl步骤(1)中纳米四氧化三钴基质溶液，滴到步骤(2)的均匀样品层上，自然晾干形成均匀样品层；

(4)送入maldi-tofms进行分析；质谱数据在正离子反射模式下采集，每张谱图为1000次测量平均图，m/z范围50～1000。

为实施例1中所制得的四氧化三钴作为基质分析的质谱图见图3；从图中可见，每一种氨基酸可以很好地被maldi-tofms检测到，可清晰看到[m+h]+、[m+na]+、[m+k]+；以上结果说明该方法能很好地用于小分子样品的质谱检测。

实施例2

(1)取纳米四氧化三钴颗粒5mg，加入10ml乙醇水溶剂，乙醇与水的体积比为1︰2，超声分散均匀，制得纳米四氧化三钴基质溶液；

(2)取样品溶液点于不锈钢靶板表面，自然干燥形成均匀样品层；

(3)取1μl步骤(1)中纳米四氧化三钴基质溶液，滴到(2)的均匀样品层上，自然晾干形成均匀样品层；

(5)送入maldi-tofms进行分析；质谱数据在正离子反射模式下采集，每张谱图为1000次测量平均图，m/z范围50～1000。

实施例3

(1)取纳米四氧化三钴颗粒10mg，加入10ml乙醇水溶剂，乙醇与水的体积比为1:2，超声分散均匀，制得纳米四氧化三钴基质溶液；

(2)取样品溶液点于不锈钢靶板表面，自然干燥形成均匀样品层；

(3)取1μl步骤(1)中纳米四氧化三钴基质溶液，滴到(2)的均匀样品层上，自然晾干形成均匀样品层；

(4)送入maldi-tofms进行分析；质谱数据在正离子反射模式下采集，每张谱图为1000次测量平均图，m/z范围50～1000。

实施例4

(1)取纳米四氧化三钴颗粒10mg，14000r/min下离心15min并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水20ml中，得到浓度为0.5g/l的基质溶液；

(2)将基质溶液1μl点样于maldi-tofms靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层；

(3)再取1μl的氨基酸(可分别为丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸等，或者两种及以上氨基酸混合)溶液(浓度为0.5mm)点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。

实施例5

(1)取纳米四氧化三钴颗粒10mg，14000r/min下离心15min并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子20ml水中，得到浓度为0.5g/l的基质溶液；

(2)将基质溶液1μl点样于maldi-tofms靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层；

(3)取处理后的待测农残样品溶液1μl点于基质层，并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。

实施例6

(1)取纳米四氧化三钴颗粒10mg，14000r/min下离心15min并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子20ml水中，得到浓度为0.5g/l的基质溶液；

(2)将基质溶液1μl点样于maldi-tofms靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层；

(3)取0.5mg/ml的葡萄糖样品溶液1μl点于基质层，并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。

使用传统基质chca会出现基质本身的很多峰，这些峰的主要来源是基质发生质子化、碎裂、分子之间的缔合等，从而产生严重的基质背景干扰现象；其次，待测物与基质混溶存在不均匀的共结晶现象，影响质谱信号的重复性；而使用纳米四氧化三钴颗粒作为基质时，图3中无基质干扰峰，六种氨基酸的信号峰都以[m+h]⁺、[m+na]⁺、[m+k]⁺特征峰出现，在非常低的浓度下仍表现出很高的灵敏度和信号强度。

本发明所涉及的纳米四氧化三钴颗粒作为maldi-tofms基质的方法，从技术上克服传统有机基质在低分子量范围的背景干扰问题，保证maldi-tofms质谱分析小分子化合物的高灵敏度和重现性；本发明的有益效果在于：所制得的纳米四氧化三钴颗粒合成方法简单，形貌规整、粒径均匀；该材料在maldi-tofms样品靶上能形成均匀的基质层，有良好的比面积和光吸收能力，从而将吸收的能量有效传递给待测物，提高分析物的离子化效率；具有较强的抗盐干扰能力，因而对多种复杂混合体系无需特殊复杂处理即可分析。

以该纳米材料作为maldi-tofms基质的分析方法已成功用于分子量小于1000dalton的小分子进行质谱分析；适合的分子种类包括氨基酸、寡肽、脂肪酸、糖类、激素、抗生素等。本方法还可用于质谱成像、生物标记物发现和环境分析等领域。