CRMP2及抗CRMP2抗体的应用

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及crmp2及抗crmp2抗体的应用。

背景技术：

神经系统自身免疫性疾病是自身免疫分子、免疫细胞识别了神经系统组织细胞自身成分(自身抗原)导致炎症等损伤所引起的一类疾病，可发生在中枢神经系统、周围神经系统及神经-肌肉接头处，包括：自身免疫性脑炎(autoimmuneencephalitis,ae)、中枢性脱髓鞘疾病、自身免疫性周围神经病等。其中，ae最常见，临床表现为急性或者亚急性起病(<3个月)，具备一个或者多个神经与精神症状或者临床综合征：1)边缘系统症状：近事记忆减退、癫痫发作、精神行为异常；2)脑炎综合征：弥漫性或者多灶性脑损害的临床表现；3)基底节和(或者)间脑/下丘脑受累的临床表现；4)精神障碍，且精神心理专科认为不符合非器质性疾病。主要累及青中年人群，致死率及致残率高。

目前已发现的神经元自身抗原有近20种。1985年开始发现的自身抗原主要针对神经元胞内抗体，例如抗hu(anna-1)、yo(pca-1)、rui(anna2)、pnma2(paraneoplasticantigenma2，副肿瘤抗原ma2)等。2019年新发现精原细胞瘤相关的副肿瘤抗原kelch-likeprotein11。这类抗原主要是通过细胞免疫介导神经元不可逆损伤，这类ae患者常伴有肿瘤，又称为肿瘤相关ae，或称副肿瘤综合征。2007年美国宾夕法尼亚州dalmau实验室在畸胎瘤患者的血清和脑脊液(cerebrospinalfluid,csf)样品中首次发现第一个针对神经元表面受体ae自身抗体，即抗nmdar(n-methyl-d-aspartatereceptor，n-甲基-d-天冬氨酸受体)抗体，其病理机制是自身抗体通过结合nmdar受体介导体液免疫反应，引起突触的nmdar受体减少，从而引起相对可逆的神经元功能障碍，免疫治疗效果良好。近年来，越来越多的针对神经元细胞表面蛋白和突触蛋白的自身抗体介导的体液免疫导致一类全新的ae被鉴定，这类ae确诊后进行早期免疫治疗效果良好。这类ae对应的自身抗原(或蛋白)包括：(1)神经递质受体ampar(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacidreceptor)、mglur5(metabotropicglutamatereceptor5)、gabaar/gababr(gamma-aminobutyricacida/breceptor)、glyr1(甘氨酸受体)、d2r(多巴胺-2受体)；(2)跨膜蛋白caspr2(contactin-associatedprotein-like2)、dner(delta/notchlikeegfrepeatcontaining)、ddp6/dppx(dipeptidylpeptidaselike6)、dcc(netrin1receptordcc)、iglon5(iglonfamilymember5)、neurexin-3α；(3)分泌蛋白lgi1(leucinerichgliomainactivated1)；(4)以及细胞内蛋白gad65(glutamicaciddecarboxylase65)。与传统的副肿瘤综合征不同的是，ae可伴有或不伴有肿瘤的发生。已知肿瘤和病毒感染是激发因素之一。

2016年graus等制定了ae的临床诊断和治疗专家共识。2017年中国脑炎专家根据国内ae临床特点形成了《中国自身免疫性脑炎诊治专家共识》，指出，这一新类型ae是一种致病性抗体兼诊断标记物可查的可治性且并不少见的脑炎，患者早期接受免疫治疗和非重症患者的预后较好。ae的诊断首先需要综合分析患者的临床表现、脑脊液检查、神经影像学和脑电图等辅助检查结果，确定其患有脑炎(ae疑似患者或可能的ae)，继而进行已知ae相关的抗体检测予以诊断，抗体检测阳性并符合临床表现且排除其它病因的可能的ae即可明确诊断为针对某种已知自身抗原的ae，例如抗nmdar脑炎。因此，对应抗体的阳性检出是ae确诊的必要条件，但不是充分条件。由于儿童的自身免疫性脑炎的临床表现与成人不同，难以鉴别特定的自身免疫性脑炎综合征，因此，自身抗体的检出对儿童自身免疫性脑炎的明确诊断显得非常重要。

随着共识的制定，ae抗体的阳性检出是确诊ae的必要条件。目前，ae特异抗体的检测主要采用基于表达特异抗原的细胞免疫荧光检测法(cellbasedassay，cba法)。2014年中国医学科学院通过单荧光cba法对284例不明原因脑炎患者的脑脊液进行抗nmdar抗体检测，其中46例抗体阳性，发病比例为16.2％，说明抗nmdar脑炎在我国并不罕见。因此，对不明病因脑炎病例进行抗nmdar抗体检测是有必要的。2017年美国滨州大学中心用单荧光cba法分析了750例疑似ae患者的最常见6种ae抗体(自免六项)，在检出的4种ae抗体中，nmdar抗体比例最高，为10.94％。我们对约4000例送检的疑似ae的样本进行检测，已知ae抗体总阳性检出率小于20％，早期诊断ae仍然是一个挑战。部分已知ae抗体检测阴性的患者的血清或脑脊液通过鼠脑组织的免疫组化检查结果为阳性，说明可能存在有未知抗体，这部分约占ae的60％～80％，因此，发现新的ae相关抗体及其靶向分子标志物，进一步阐释其致病性与致病机制，对于临床上更好地诊治自身免疫性脑炎具有重要意义。

ae的致病机理尚处于初期的研究阶段，不同自身抗体触发疾病的发生及临床表现有所不同。例如，抗nmdar抗体与神经元nmdar结合后，大大减少了突触的数量；而抗gababr抗体抑制该受体活性，但对突触的密度并没有明显影响；抗lgi1和caspr2抗体可干扰突触蛋白-蛋白相互作用；抗neurexin-3α抗体可改变突触的形成；抗iglon5抗体可导致形成新形式的tau蛋白病变。临床上，大部分患者表现为脑炎症状，也有表现为小脑综合征或慢性脑病症状。

肿瘤和病毒感染是ae的风险因素。抗nmdar脑炎常伴有畸胎瘤，抗gababr脑炎常伴有小细胞肺癌。肿瘤细胞可能分泌自身抗原从而激活了免疫系统而导致ae的发展，例如畸胎瘤类神经样组织细胞分泌nmdar，发生ae比不发生ae的畸胎瘤患者的肿瘤组织炎症反应很高。但伴有hodgkin淋巴瘤的dner、mglur1和mglur5脑炎例外，肿瘤不产生任何ae相关的抗原。约20％的单纯疱疹病毒脑炎患者几周后可继发ae，主要以nmdar为主，机理可能是病毒介导的颅内炎症反应促进自身抗原的产生，在神经系统外产生了自身免疫反应。然而，lg1脑炎及很多ae，特别是年轻患者，长期随访既没有肿瘤发现，也没有前期病毒感染的证据，说明的机制大部分并不清楚，ae的机制尚待进一步深入。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的抗体标志物并建立其检测体系，用于神经系统自身免疫性疾病的诊断和治疗。

本发明所采取的技术方案是：

本发明提供crmp2作为神经系统自身免疫性疾病标志物的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述crmp2的氨基酸序列如seqidno：1～3任一项所示。

在本发明的一些实施方式中，所述crmp2的核苷酸序列如seqidno：4～6任一项所示。

本发明还提供抗crmp2抗体作为神经系统自身免疫性疾病标志物的应用。

本发明还提供检测抗crmp2抗体的试剂在制备神经系统自身免疫性疾病的检测、诊断、治疗或预后评估试剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述检测抗crmp2抗体的方法选自cba、免疫印迹、膜条法、elisa、化学发光、放射免疫法、液相芯片法、侧向层析、电化学、流式细胞中的至少一种。

本发明还提供抑制抗crmp2抗体表达或翻译的试剂在制备神经系统自身免疫性疾病药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述抑制抗crmp2抗体表达或翻译的制剂包括：抗crmp2抗体基因启动子抑制剂、抗crmp2抗体基因转录抑制剂、抗crmp2抗体蛋白合成抑制剂、抗crmp2抗体基因的sirna。

本发明还提供使抗crmp2抗体活性降低或失活的制剂在制备神经系统自身免疫性疾病药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，使抗crmp2抗体活性降低或失活的试剂包括：抑制抗crmp2抗体活性的物质、或降解抗crmp2抗体活性的物质、或降低抗crmp2抗体蛋白水平的基因工具。

本发明还提供一种神经系统自身免疫性疾病辅助诊断试剂，该试剂含有检测抗crmp2抗体表达量的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述检测的样本为脑脊液或血液。

在本发明的一些实施方式中，所述神经系统自身免疫性疾病为脑炎或脑脊髓炎。

本发明的有益效果是：

本发明通过研究发现crmp2是一个新的脑炎或脑脊髓炎相关的自身抗体靶向分子标志物。根据该类疾病的命名规则，此新病称为抗crmp2脑炎或脑脊髓炎，其累及部位或症状定位可以是大脑、小脑和/或脊髓。crmp2则可用于该疾病的明确诊断和为免疫治疗方案提供依据，并可通过检测该自身抗体的滴度变化监测治疗效果及判断预后及复发。

附图说明

图1为pcdna3.1+载体图谱。

图2为p1、p2、p3患者影像。

图3为p1患者脑脊液的脑片免疫组化检测。

图4为crmp2标志物的鉴定。

图5为原代培养的小鼠大脑皮层神经元的p1患者血清的免疫荧光检测。

图6为p1、p3患者血清的cba检测。

图7为p2患者治疗前后血清样本中抗crmp2抗体的cba检测。

图8为p2患者血清样本的膜条法检测。

图9为crmp2的3种亚型序列比对结果。

图10为人、小鼠、大鼠、牛、猩猩、鸡的crmp2蛋白序列比对。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

其中已知crmp2有3种蛋白亚型，序列如下：

亚型1：长度：677个氨基酸；种属：人(homosapiens)，氨基酸序列如seqidno：1所示；亚型2：长度：572个氨基酸；种属：人(homosapiens)，氨基酸序列如seqidno：2所示；亚型3：长度：536个氨基酸；种属：人(homosapiens)，氨基酸序列如seqidno：3所示。

已知crmp2有3种编码蛋白的转录本，对应上述3种蛋白亚型，序列如下：

转录本1：长度2034bp；种属：人(homosapiens)，核苷酸序列如seqidno：4所示；转录本2：长度1719bp；种属：人(homosapiens)，核苷酸序列如seqidno：5所示；转录本3：长度1611bp；种属：人(homosapiens)，核苷酸序列如seqidno：6所示。

使用的pcdna3.1-crmp2质粒中crmp2序列为转录本1，用以表达1型crmp2蛋白，涵盖了3种转录本及3种亚型的全部序列，以便无遗漏的检测抗crmp2抗体。其中pcdna3.1-crmp2载体图谱见图1。

pcdna3.1-crmp2质粒采用的真核表达载体为pcdna3.1+，图谱如下：载体构建所用的酶切位点为bamhi(5’端)和ecori(3’端)，中间为插入的crmp2转录本1序列，具体序列如seqidno：7所示。

实施例1

本实施例中的3例患者编号分别为：p1、p2、p3。

p1为首例，利用其脑脊液和血液样本鉴定得到crmp2；p2、p3为cba法回顾性分析检测到的抗crmp2抗体阳性病例。

p1、p2、p3均有头晕或头痛、视觉障碍、行走不稳病征；脑白质病变；免疫治疗有效；血液和/或脑脊液的大鼠脑片tba检测阳性；抗crmp2抗体检测阳性，其它ae相关抗体检测阴性。

p1、p3有语言障碍、双侧指鼻试验不准；p2具有胸腹部疼痛，脊髓病变。

p1脑脊液肺炎支原体检测阳性；p3脑脊液人疱疹病毒6型、肺炎克雷伯杆菌检测阳性；血乙型流感病毒igm阳性。

其中p1、p2、p3这3例患者的具体临床资料见表1，影像资料见图2。

表13例抗crmp2抗体阳性脑炎/脑脊髓炎患者的临床资料

注：1.^1.自身免疫性脑炎抗体：抗nmda/lgi1/gaspr-2/dabab/ampa1/ampa2/iglon5/dppx/giy1/drd2/gad65抗体；^2.自身免疫性小脑相关抗体：抗dpysl5/homer3抗体；^3.甲状腺相关抗体：促甲状腺素受体抗体、抗甲状腺过氧化物酶抗体、抗甲状腺球蛋白抗体；^4.肿瘤抗原：糖类抗原(ca-125)，非小细胞肺癌相关抗原，鳞状细胞癌相关抗原(scc)，血清胰腺和胃肠道肿瘤相关抗(ca242)，胃癌相关抗原(ca-724)，胃肠癌相关抗原(ca-199)，癌胚抗原(cea)；^5.血清自身免疫抗体：抗核抗体、抗双链dna抗体、抗jo-1抗体、抗ssb抗体、抗sm抗体、抗ui-nrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗增殖细胞核抗原抗体、抗线粒体抗体、抗着丝点抗体、抗pm-scl抗体、抗scl-70抗体、抗ssa抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗重组ro52抗体。

2.缩写：mri：磁共振；mrs：改良rankin量表。

实施例2

基于大鼠脑片的免疫组化实验是自身免疫性脑炎的常规检查，包括免疫酶化学法和免疫荧光法(亦称tba法，tissuebasedassay)。

实施过程：将成年大鼠麻醉后心脏灌注pbs(磷酸盐缓冲液)以去除循环血液，取大脑(含海马区)进行矢状面冰冻切片，取小脑进行纵切，冷丙酮固定10分钟，晾干备用。用pbst溶液(含0.05％tween-20的pbs)将切片洗3次，每次3分钟。

接下来分别进行免疫酶化学法和免疫荧光法进行检测：(1)进行免疫酶化学法：再用3％过氧化氢处理10分钟，pbst洗3次后进行下一步封闭，用10％羊血清/pbst溶液室温封闭1小时；(2)进行免疫荧光法：无需过氧化氢处理，用10％羊血清/pbst溶液室温封闭1小时。

两组封闭完后甩去封闭液，加入p1患者脑脊液，37℃孵育1小时。孵育完毕，用pbst洗3次，每次5分钟。

(1)进行免疫酶化学法：脑脊液孵育、洗涤后，加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)标记的羊抗人igg二抗(bs-0297g-hrp，bioss)，37℃孵育30分钟，洗涤后滴加二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)底物液，显色3-15分钟，漂洗后核复染，树脂封片，于dm3000显微镜(leica，german)观察、采集图像。

(2)进行免疫荧光法：加入1:200倍稀释的绿色荧光标记的羊抗人igg二抗(ab97003，abcam)，37℃孵育30分钟。然后用pbst洗3次，每次5分钟。防淬灭封片剂封片，ix73荧光显微镜(olympus，japan)观察结果、采集图像。

结果：检测结果见图3，其中图3中a图和c图为免疫酶化学检测结果。其中与阴性非自身免疫患者脑脊液染色比较结果见图3中a图，p1患者脑脊液脑片染色阳性见图3中c图。图3中b图和d图为免疫荧光检测结果，图3中b图为在大脑海马区的检测结果，图3中d图为在小脑浦肯野细胞的检测结果，可以看出均显示阳性。表明，p1患者脑脊液中含有针对脑神经元的自身抗体，p1患者为疑似ae。

实施例3

利用免疫沉淀结合蛋白质谱鉴定p1患者脑脊液自身抗体针对的抗原。

实施过程：取约2月龄大鼠新鲜脑组织，加入1毫升蛋白裂解液(20mmol/ltris-hcl，ph7.4，150mmol/lnacl，2mmol/ledta，1％tritonx-100，蛋白酶抑制剂)，玻璃匀浆器匀浆1分钟，置于冰上裂解30分钟。4℃12000rpm离心15分钟，取上清液作为大鼠脑蛋白裂解液。将500微升蛋白裂解液与500微升p1患者脑脊液混合，4℃垂直混旋过夜。加入50微升预洗的蛋白a标记琼脂糖，4℃垂直混旋2小时。4℃、1000rpm离心、重悬，蛋白裂解液漂洗3次，然后加入1xsds-page样品缓冲液，煮沸5分钟洗脱蛋白复合物。制备的样品通过sds-page分离，分别做免疫印迹和考马斯亮蓝染色。大鼠脑片tba检测阴性的脑脊液作为阴性对照。根据实验结果，选取疑似目的考马斯亮蓝染色条带(～70kda)，切胶，进行肽指纹质谱蛋白鉴定。结果见图4。其中图4中a图为免疫沉淀结果，图4中b图为考马斯亮蓝染色结果，其中免疫沉淀和考马斯亮蓝染色显示在约70kda处可能为靶蛋白条带，将其切胶、质谱鉴定，鉴定到crmp2的10余条多肽，其中图4中c图为其中一条多肽的二级质谱谱图，图4中d图为蛋白质谱鉴定到的多肽(下划线)在crmp2蛋白上的分布，可以看出多肽的crmp2蛋白覆盖度为40％，图4中d图下划虚线多肽对应图4中c图多肽。

实施例4

crmp2定位于神经元的胞质、轴突和树突，抗crmp2脑炎/脑脊髓炎患者的脑脊液和血清样本中的抗crmp2抗体应可以与神经元结合，这是导致ae的重要机理。

实施过程：取18～19天的c57小鼠胚胎，分离其脑组织、制备皮层神经元细胞悬液，以3x10⁶/孔的量铺24孔细胞培养板，板内预放细胞爬片，培养14天。培养完成后，用冰丙酮固定神经元10分钟。pbst洗涤3次3分钟、10％羊血清/pbst溶液室温封闭1小时后，加入患者或对照组血清(稀释度为1：20)和抗map2抗体(8707t，cellsignalingtechnology，稀释度为1：200)，在4℃孵育过夜或37℃孵育1小时。反应完后pbst洗涤3次5分钟，然后加入红色荧光标记(alexa594)的羊抗兔igg(ab150092，abcam)和绿色荧光标记(488)的羊抗人igg(ab97003，abcam)二抗37℃孵育30分钟。pbst洗涤3次5分钟，然后用含dapi(4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的封片剂封片。使用lsm980激光共聚焦显微镜(zeiss，german)拍照。结果见图5。标尺为20μm。

从图5可以看出，p1患者血清染色神经元呈阳性，信号分布在神经元的胞质、树突和轴突上，与crmp2的定位一致，符合抗crmp2脑炎/脑脊髓炎特点。阴性对照血清无染色。

实施例5

基于293t细胞过表达靶抗原的免疫荧光(即cba法)检测患者脑脊液和血清样本，是确诊自身免疫性脑炎/脑脊髓炎的重要途径。

实施过程：制备293t细胞爬片，待细胞长至50％～90％密度时，将pcdna3.1-crmp2真核表达质粒转染293t细胞，使293t细胞过表达crmp2重组蛋白。pbs洗293t细胞3次，然后用丙酮固定5分钟，晾干。用pbst溶液将爬片洗3次，每次3分钟。用10％羊血清/pbst溶液室温封闭1小时，弃封闭液，加入p1或p3患者血清(1:20稀释)，37度孵育1小时。孵育完毕，用pbst洗3次，每次5分钟。然后加入1:200倍稀释的绿色荧光标记的羊抗人igg二抗(ab97003，abcam)，37度孵育30分钟。然后用pbst洗3次，每次5分钟。含dapi的封片剂封片，使用lsm980激光共聚焦显微镜(zeiss，german)观察结果、采集图像。

本实施例在一抗同时加入抗crmp2抗体(ab129082，abcam，1:200稀释)做为阳性对照、二抗同时加入红色荧光标记的羊抗兔igg二抗(ab150092，abcam)，进行免疫荧光共染色。本实施例以非自身免疫疾病患者血清为阴性对照。结果见图6。

从图6可以看出，本实施例成功于293t细胞过表达了crmp2蛋白，p1、p3患者血清染色与crmp2基本重叠。阴性对照血清无染色。表明p1、p3患者血清含抗crmp2的自身免疫性抗体。

实施例6

通过免疫治疗降低或消除自身免疫性抗体，是治疗自身免疫性脑炎/脑脊髓炎的主要途径。

实施过程：3例患者经免疫治疗后均好转，见表1免疫治疗、预后。将p2患者治疗前和治疗后的血清进行抗crmp2抗体的cba检测，方法同实施例5。结果见图7。

从图7可以看出，p2患者治疗前血清的cba染色阳性，且与crmp2共定位，说明p2患者治疗前血清含抗crmp2的自身免疫性抗体。治疗、恢复后，p2患者血清cba染色阴性，表明p2患者治疗后血清抗crmp2抗体消失。

实施例7

免疫印迹(亦称膜条法)是自身免疫抗体检测的另一方法。

实施过程：首先制备crmp2蛋白。在10厘米细胞培养皿培养293t细胞至80％密度，利用entranstertm-d4000(4000-2，engreen)将pcdna3.1-crmp2真核表达质粒转染至293t细胞，继续培养293t细胞24小时～48小时，使其过表达crmp2重组蛋白。然后，利用1毫升蛋白裂解液在4℃处理293t细胞30分钟。4℃12000rpm离心15分钟，收上清，获得含crmp2的293t蛋白裂解液。加入5微克抗crmp2抗体(ab129082，abcam)，4℃垂直混旋过夜。加入50微升预洗的蛋白a标记琼脂糖，4℃垂直混旋2小时。4℃、1000rpm离心，去上清，蛋白裂解液重悬，然后重复离心和重悬以漂洗3次。最后一次离心后加入30微升的1xsds-page样品缓冲液重悬，煮沸5分钟以洗脱和纯化富集crmp2蛋白。洗脱液经10％的sds-page分离、转印硝酸纤维素膜、5％脱脂奶粉/tbst室温封闭1小时、1:20稀释的p2患者脑脊液室温孵育2小时、tbst洗3次5分钟、1:5000稀释的hrp标记的羊抗人igg室温孵育1小时、tbst洗3次5分钟、ecl底物显影，检测p2患者脑脊液中的抗crmp2抗体。以正常兔igg做为抗crmp2抗体的阴性对照；以pcdna3.1空载转染293t为crmp2蛋白阴性对照。结果见图8。从图8可以看出，在目的crmp2大小位置出现明显的条带，对应的阴性对照无条带，表明p2患者脑脊液中含抗crmp2的抗体，同时表明免疫印迹(膜条法)可以用于该抗体的检测。

实施例8

crmp2的3种亚型序列比对结果件图9，可以看出3种亚型在142至677位的氨基酸序列完全一致。因此实施例5、6、7中使用的pcdna3.1-crmp2质粒中crmp2序列为转录本1，用以表达1型crmp2蛋白，涵盖了3种转录本及3种亚型的全部序列，以便无遗漏的检测抗crmp2抗体。

实施例9

对不同种属来源的crmp2(别名dpyl2)蛋白序列进行同源性分析，结果见图10。从图10可以看出不同种属的crmp2蛋白高度同源，同源性96.853％。可以利用不同种属的crmp2蛋白检测人脑脊液或血清样本中的抗crmp2抗体。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

sequencelisting

<110>南方医科大学南方医院

<120>crmp2及抗crmp2抗体的应用

<130>

<160>7

<170>patentinversion3.5

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