一种检测头足类生物中微塑料的方法

本发明涉及微塑料检测
技术领域：
，具体为一种检测头足类生物中微塑料的方法。
背景技术：
：由于低成本、易制造和可塑性强等性质，塑料被广泛应用于生产和生活领域，导致大量塑料废弃物的形成。在太阳辐射、物理磨损、化学作用和(微)生物降解的情况下，海洋中的塑料废弃物会形成粒径小于5mm的碎片或颗粒，即微塑料(microplastics)。微塑料作为一种持久性污染物，其对海洋动物具有巨大的影响。微塑料粒径小，容易进入海洋动物体内。头足类生物是海洋生态系统特有的软体动物，分布在除北冰洋以外的全球各大洋及海域，包括乌贼、枪乌贼和茎柔鱼等。由于头足类生物能够栖息在海洋中的各个领域，微塑料进入头足类生物的可能性也大大增加。然而，目前海洋动物体内的微塑料的检测主要集中在近海的海洋动物，例如双壳类、近海鱼类，针对双壳类、近海鱼类，通常可以使用酸消解法、碱消解法、酶消解法或氧化剂消解法消解双壳类动物或近海鱼类的有机基质，进而检测微塑料含量。这些检测方法能够快速的检测出双壳类动物或近海鱼类体内的微塑料的含量。但适用于双壳类动物或近海鱼类的微塑料检测方法并不适用于头足类生物。对于头足类生物而言，目前尚未形成一套头足类生物中的微塑料检测标准与体系。技术实现要素：基于此，有必要提供一种检测头足类生物中微塑料的方法。包括：1)将来自头足类生物的样品的机体组织和消解液混合，以进行消解；2)对消解后的机体组织进行抽滤、干燥和镜检，并根据镜检数据采集目标物；以及3)对步骤2)中的所述目标物进行红外检测，计算微塑料含量；其中，所述机体组织的干重(g)与所述消解液的体积(ml)的比为1：–10–30；所述消解液的浓度为5–20wt％。优选地，所述机体组织的干重(g)与所述消解液的体积(ml)的比为1：–10–20。优选地，所述机体组织的干重(g)与所述消解液的体积(ml)的比为1:20。优选地，所述消解液的浓度为8–12wt％。优选地，所述消解液的浓度为10wt％。优选地，步骤1)中所述机体组织选自鳃、胃、肠道、食道和消化腺中的任意一种或多种。优选地，在步骤1)前，使用解剖刀将所述机体组织切割成块。优选地，步骤1)中所述消解液选自氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾-双氧水混合溶液或氢氧化钠-双氧水混合溶液中的任意一种或多种。优选地，步骤1)中的消解在60–80℃的温度下进行。优选地，步骤1)中的消解时间为20–36h。有益效果：本发明中的检测方法能够适用于头足类生物体内的微塑料检测，能够通过一次检测，体现出头足类生物体内多个组织(器官)内的微塑料含量，可以更加全面了解头足类生物体内微塑料的丰度和其对机体的影响。能够提高其体内微塑料积累、分布和迁移机制的研究的准确度。另外，本发明中的检测方法检测远海的海洋区域中具有高度洄游能力的头足类生物，而具有高度洄游能力的头足类生物会栖息在多个微塑料聚集海域。因此，其体内的微塑料含量的多和少可以代表了海域内微塑料含量的多少，为微塑料污染防治提供比较准确的参考依据。附图说明图1为实施例中目标物的红外检测图；图2为实施例中微塑料的显微图；图3为本发明中另一目标物的红外检测图；图4为本发明中另一微塑料的显微图；图5为本发明中另一目标物的红外检测图；图6为本发明中另一微塑料的显微图；图7为本发明中另一目标物的红外检测图；图8为本发明中另一微塑料的显微图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。在本发明中，术语“鉴定标准”为红外光谱仪的光谱系统中所带谱库的标准物质。在本发明中，“镜检”为将任意一种待测物置于显微镜下观察。在本发明中，使用红外检测的操作过程没有特殊限制。在本发明中，术语“目标物”为镜检下观察到的任意物质。本发明中，“机体组织”是由细胞和细胞间质构成的组成机体器官的成分。本发明提供了一种检测头足类生物中微塑料的方法，包括：1)将来自头足类生物的样品的机体组织和消解液混合，以进行消解；2)对消解后的机体组织进行抽滤、干燥和镜检，并根据镜检数据采集目标物；3)对步骤2)中的目标物进行红外检测，计算微塑料含量；其中，机体组织的干重(g)与消解液的体积(ml)的比为1：–10–30；消解液的浓度为5–20wt％。在本发明中，头足类生物可以为章鱼、乌贼和茎柔鱼等。机体组织可以为选自鳃、胃、肠道、食道和消化腺中的任意一种或多种，例如，机体组织可以为鳃、消化腺或胃；在另一个实施例中，机体组织可以为鳃、胃和肠道。鳃、胃、肠道、食道和消化腺等各类机体组织可以通过解剖头足类生物而获取，以乌贼或茎柔鱼为例，可以解剖乌贼或茎柔鱼，得到鳃、胃、肠道和食道等机体组织。在解剖前，可以将头足类生物置于冷库中保存，优选-20℃的冷库。当从冷库中取出头足类生物进行解剖时，需要先在室温下解冻，解冻时间不超过2h，优选为2h。在解剖后，对机体组织进行清洗、烘干和称重。优选地，清洗所用的水可以为超纯水。关于烘干，可以选择在70–80℃下烘干，优选为80℃。烘干的时间可以为20–24h，优选为24h。本发明中，消解液可以为氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾-双氧水混合溶液或氢氧化钠-双氧水混合溶液，例如，在一个具体实施例中，可以通过氢氧化钾溶液消解机体组织，或者通过氢氧化钾-双氧水混合溶液消解机体组织。在任意实施例中，机体组织的干重(g)与消解液的体积(ml)为1:–10–30的比例、消解液为5–20wt％的浓度能够适用于头足类生物体内的微塑料检测。以茎柔鱼为例，可以每克茎柔鱼的机体组织对应加入10–30ml浓度为5–20wt％的消解液，消解后的机体组织进行抽滤、干燥，并通过镜检和红外检测茎柔鱼机体组织内的微塑料含量。特别地，可以按照机体组织的干重(g)与消解液的体积(ml)的比为1：–10–20，例如，1g机体组织可以与10–20ml的消解液混合，10g机体组织可以和100–200ml的消解液混合。更有利地，机体组织的干重与消解液的体积的比为1:20，例如，1g机体组织可以与20ml的消解液混合；10g机体组织可以和200ml的消解液混合。进一步地，可以选择浓度为8–12wt％的消解液消解乌贼或茎柔鱼等头足类生物的机体组织，例如，可以通过浓度为8wt％的消解液消解机体组织；可以通过浓度为10wt％的消解液消解机体组织；或者可以通过浓度为12wt％的消解液消解机体组织。以鳃、胃、肠道和食道为例，机体组织的干重(g)与10wt％的消解液的体积比为1:20的比例下，可以有效地消解鳃、胃、肠道和食道等机体组织。本发明中仅以鳃、胃和肠道为示例进行实验，在另一些实施例中，也可以采集食道进行微塑料检测，本发明中机体组织的干重(g)与消解液的体积(ml)为1:–10–30的比例、消解液为5–20wt％的浓度也能够适用于消化腺或脑的消解。本发明中，在鳃、胃和肠道等机体组织与消解液混合之前，可以使用解剖刀将各机体组织切割成块。优选地，可以使用解剖刀将机体组织切割成1–8cm3的块状。更优选地，可以使用解剖刀将机体组织切割成1cm3的块状，以增加机体组织与消解液的接触面积，提高消解的效率。在一些实施例中，可以将机体组织和消解液在反应瓶中混合，然后在水浴恒温振荡器中进行。优选地，反应瓶为玻璃材质，以确保微塑料检测的精确性，例如，反应瓶为锥形瓶。优选地，在反应瓶放入水浴恒温振荡器前，将其进行超声震荡5–20min，优选为10min。在将消解液加入反应瓶之前，通过玻璃纤维滤膜(孔径2.7μm，直径47mm)将消解液过滤备用。反应瓶使用前可以通过超纯水清洗3遍。而超纯水可以通过滤膜过滤一遍，优选地，滤膜为玻璃纤维滤膜。在一些实施例中，在机体组织和消解液加入反应瓶后，将反应瓶封口，以隔绝空气中的微塑料和反应瓶中的微塑料，提高微塑料检测精度。优选地，反应瓶使用铝箔封口。在消解过程中，可以选择在60–80℃的温度下进行消解，优选为65–80℃，更优选为70℃。还可以选择在100–150r/min的转速下进行消解，时间为20–36h。以避免机体组织消解不充分，例如，可以在转速为130r/min的情况下，使机体组织消解36h。本发明在消解后，需要将消解在消解液中的机体组织分离出去，分离的方式可以选择抽滤。通过布氏漏斗和抽滤装置进行抽滤，以除去消解的机体组织。优选地，布氏漏斗使用前通过超纯水清洗3遍。在一些实施例中，抽滤所用的滤膜为玻璃纤维滤膜，通过玻璃纤维滤膜将消解后的机体组织除去，以避免微塑料含量测量产生误差。优选地，在聚四氯乙烯滤膜使用前，使用超纯水将滤膜清洗2–4遍，保障检测精度。在一些实施例中，可以使用孔径为2.7–5μm玻璃纤维滤膜。优选为2.7μm。在一些实施例中，将步骤2)中抽滤后的样品在50–70℃的温度下进行干燥，然后镜检。在本发明中，优选地，干燥的温度为70℃。在干燥时，将盛载了样品的玻璃纤维滤膜置于培养皿中，并将培养皿的敞口用铝箔纸覆盖好并放入70℃烘箱中干燥，以避免外界微塑料进入培养皿中。培养皿使用前通过超纯水清洗3遍，干燥的时间为0.5–2h，优选为1h。在本发明中，可以将富集微塑料的玻璃纤维滤膜置于显微镜下观察，对于观察到的目标物，使用解剖针按压目标物，当颗粒不会碎裂时，此颗粒为疑似微塑料的样品，进一步通过红外光谱仪进行成分分析。优选地，镜检所用的显微镜可以为体式显微镜szx2-fof(olympus，日本)；解剖针的针尖直径可以为0.15mm。红外光谱仪可以选用傅里叶变换红外光谱仪。优选地，傅里叶变换红外光谱仪的工作模式为透射模式，光谱的范围为455–4000cm-1，样品的采集时间为3s，光谱波数的分辨率为8cm-1，每个样品的扫描次数为3次。对于样品进行红外检测后得到的检测图谱，可以与傅里叶变换红外光谱仪所带的检测系统中的谱库标准物质检索对比，结合官能团特征峰的位置，匹配率大于70％即判定为微塑料，进而判断样品中微塑料的含量。优选地，可以将样品的检测图谱与omnic软件中的谱库标准物质进行比较，结合官能团特征峰的位置，匹配率大于70％即判定为微塑料。在一些实施例中，谱库标准物质可以为甲基纤维素(methylcellulose)、聚乙烯亚胺(poly(ethylenimire))、改性环氧氯丙烷(epichlorohydrinmodified)、赛璐酚(cellophane)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose)、醇酸树脂(alkydresin)、蓖麻酸丙二醇酯(propyleneglycolricinoleate)、二聚亚油酸/甘醇共聚物(bis(2-hydroxyethyl)dimerate)、不饱和聚酯树脂(polyesterresin,unsaturated)、聚乙烯丙酸酯(poly(vinylpropionate:acrylate))、柠檬酸三正丁酯(acctyltri-n-butylcitrate)或柠檬酸三丁酯(tri-n-butylcitrate)，例如，将目标物进行红外检测，得到其红外图谱，并与标准库中的甲基纤维素(methylcellulose)、聚乙烯亚胺(poly(ethylenimire))、改性环氧氯丙烷(epichlorohydrinmodified)和赛璐酚(cellophane)等标准物质进行比较，分析其匹配率。在另外一个实施例中，可以将另一目标物的红外图谱与羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose)、甲基纤维素(methylcellulose)和赛璐酚(cellophane)等进行比较。对于通过红外检测确定的微塑料，记录下该微塑料在显微镜下的大小、形状和颜色。在体式显微镜szx2-fof下，与其它未进行红外检测的目标物的大小、形状和颜色相比较，排除显微镜下不是微塑料的目标物，对微塑料的含量进行精准定量。此外，本发明中，可以通过玻璃纤维滤膜(孔径2.7μm，直径47mm)将检测中所用到的所有液体试剂都过滤备用，例如，通过玻璃纤维滤膜将清洗检测中器具所用的超纯水均过滤备用。下面结合具体实施例对本发明中的检测方法进行详细说明。以下通过实施例1–3对机体组织消解的程度进行详细说明。实施例1随机从东太平洋秘鲁专属经济区以外海域采集6尾茎柔鱼(采集区域：9°50's–15°42's、79°45'w–85°03'w)。在通风橱内，将6尾茎柔鱼解剖，采集鳃、胃和肠道，清洗，80℃烘干24h，得到干燥的机体组织，并称重。通过解剖刀将每尾茎柔鱼中的鳃、胃和肠道切割成质量均为10g(±0.05g)的2份，得到2组(a和b)实验样品。实施例2通过解剖刀将a组样品中的鳃、胃和肠道分别切成1cm3块状，并置于锥形瓶中(每尾茎柔鱼中相同的机体组织置于同一个锥形瓶，例如：每尾茎柔鱼中所有的块状鳃置于同一个锥形瓶中)。使用玻璃纤维滤膜(孔径2.7μm，直径47mm)将超纯水和koh溶液分别过滤备用。锥形瓶在添加机体组织前，使用超纯水清洗3遍。按照机体组织的干重与koh溶液(5wt％)的体积为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的比例，分别加入50ml、100ml、150ml、200ml、250ml和300ml的koh溶液，铝箔封口。超声震荡10min，并将所有锥形瓶置于水浴恒温振荡器(70℃，130r/min)中消解36h。结果如表1所示：表1多组茎柔鱼样品的不同的机体组织的消解程度样品序号鳃胃肠道1消解完全未消解完全未消解完全2消解完全消解完全消解完全3消解完全消解完全消解完全4消解完全消解完全消解完全5消解完全消解完全消解完全6消解完全消解完全消解完全结果表明，机体组织的干重与koh溶液的体积为1:5时，大部分机体组织消解完全，胃和肠等机体组织未消解完全；其余5组的机体组织均消解完全。实施例3本实施例方案与实施例2基本相同，不同之处是本实施例中：采用b组样品，按照机体组织的干重与koh溶液的体积为1:10的比例，分别加入的浓度为5wt％、10wt％、15wt％、20wt％、25wt％和30wt％的koh溶液100ml。结果如表2所示：表2多组茎柔鱼样品的不同的机体组织的消解程度样品序号鳃胃肠道1消解完全消解完全消解完全2消解完全消解完全消解完全3消解完全消解完全消解完全4消解完全消解完全消解完全5消解完全消解完全消解完全6消解完全消解完全消解完全结果表明，6组的机体组织均消解完全。结合实施例2和实施例3可知，每克机体组织的干重对应的消解液的体积大于10ml，浓度大于5wt％。进一步地，为了解微塑料的检测情况，本发明中进行实施例4-7的实验。实施例4随机从东太平洋秘鲁专属经济区以外海域采集20尾茎柔鱼(采集区域：9°50's–15°42's、79°45'w–85°03'w)。在通风橱内，将20尾茎柔鱼解剖，采集鳃、胃和肠道，清洗，80℃烘干24h，得到干燥的机体组织，并称重。通过解剖刀将每尾茎柔鱼中的鳃、胃和肠道切割成质量均为10g(±0.05g)的3份，得到3组(c、d和e)实验样品。实施例5(1)通过解剖刀将c组样品中的鳃、胃和肠道分别切成1cm3块状，并置于锥形瓶中(每尾茎柔鱼中相同的机体组织置于同一个锥形瓶，例如：每尾茎柔鱼中所有的块状鳃置于同一个锥形瓶中)。使用玻璃纤维滤膜(孔径2.7μm，直径47mm)将超纯水和koh溶液分别过滤备用。锥形瓶在添加机体组织前，使用超纯水清洗3遍。按照机体组织的干重与koh溶液的体积为1:20的比例，在锥形瓶中加入200ml的koh溶液(10wt％)，铝箔封口。超声震荡10min，并将所有锥形瓶置于水浴恒温振荡器(70℃，130r/min)中消解36h。(2)使用玻璃纤维滤膜(孔径2.7μm，直径47mm)对消解后的机体组织进行抽滤，抽滤所用的漏斗在使用前使用超纯水清洗3遍。将抽滤后的样品进行干燥(70℃，1h)。在体式显微镜szx2-fof(olympus，日本)下观察，对于观察到的目标物，使用解剖针(直径：0.15mm)按压目标物，挑选不会碎裂的颗粒。(3)通过傅里叶变换红外光谱仪(透射模式，光谱范围：455–4000cm-1，采集时间：3s，光谱波数的分辨率：8cm-1，扫描次数：3次)。对不会碎裂的颗粒进行分析，得到样品的红外图谱。将红外图谱与红外分析软件(omnic)中的图谱库进行检索对比，如图1、图3、图5、图7所示，将各不同的颗粒(各图中最上方的峰值图谱)与其下方的标准物质的峰值图谱进行比较，确定目标物是否为微塑料。对于确定是微塑料的目标物，如图2、图4、图6、图8所示，记录下该目标物在体式显微镜szx2-fof下的大小、形状和颜色，并与体式显微镜szx2-fof下的其它未进行红外检测的目标物的大小、形状和颜色相比较，由此计算出微塑料的含量。在上述检测过程中，可以使用超纯水将检测中所用的所有容器冲洗至少3遍，并烘干后备用。在消解及干燥的过程中，盛放样品的容器可以密封保存。在检测过程中，操作人员可以穿戴丁腈手套和纯棉实验服。所有的实验过程可以在通风橱内操作完成。结果分析图1中可以看出目标物一的峰值图谱与赛璐酚(cellophane)的峰值图谱匹配率大于70％。因此，该目标物为微塑料。而该目标物一的显微图如图2所示，图2示出了通过红外检测的蓝色微塑料，该微塑料的长度在400–500μm，形状为长条纤维状。图3中可以看出目标物二的峰值图谱与赛璐酚(cellophane)的峰值图谱匹配率达到80％。因此，该目标物二为微塑料。而该目标物二的显微图如图4所示，图4示出了通过红外检测确定的红色微塑料，该微塑料的长度在750–850μm，形状为长条纤维状。图5中可以看出目标物三的峰值图谱与醇酸树脂(alkydresin)的峰值图谱匹配率达到79％。因此，该目标物三为微塑料。而该目标物三的显微图如图6所示，图6示出了通过红外检测确定的蓝色微塑料，该微塑料为碎片状，各边长的长度为100–200μm。图7中可以看出目标物四的峰值图谱与醇酸树脂(alkydresin)的峰值图谱匹配率达到70％。因此，该目标物四为微塑料。而该目标物四的显微图如图8所示，图8示出了通过红外检测确定的彩色的微塑料。该微塑料为碎片状，各边长的长度为100–300μm。将上述图中经红外图谱确定的微塑料的颜色、大小和形状与显微镜下其他未经红外检测的目标物进行比较，实现茎柔鱼中各机体组织的微塑料计数，计数结果如表3所示：表3多组茎柔鱼样品的不同的机体组织中的微塑料含量(单位：个数)样品序号鳃胃肠道1152297238334066502467127901866590731000411700122231309114870159271685017898180341920520577在本实施例中，对20尾茎柔鱼进行了微塑料检测，如上表所示，可以看出在20尾茎柔鱼的大部分机体组织中均检测出微塑料；并且鳃中的微塑料含量相比其他机体组织较高，总数达到89个；其次是胃，总数达到81个。实施例6本实施例方案与实施例5基本相同，不同之处是本实施例中：采用d组机体组织样品，按照机体组织的干重与koh溶液(25wt％)的体积为1:30的比例，在锥形瓶中加入300ml的koh溶液。将所有锥形瓶置于水浴恒温振荡器(70℃，130r/min)中消解36h。将镜检下的所有目标物与实施例5中已经确定的微塑料的显微图进行比较，计算微塑料的含量。结果显示，微塑料的检出率极低，这能是因为在每克干重对应加入30ml的koh溶液(25wt％)的情况下，微塑料大部分被消解。实施例7本实施例方案与实施例5基本相同，不同之处是本实施例中：采用e组机体组织样品，按照机体组织的干重与koh溶液(20wt％)的体积为1:30的比例，在锥形瓶中加入300ml的koh溶液。将所有锥形瓶置于水浴恒温振荡器(70℃，130r/min)中消解36h。将镜检下的所有目标物与实施例5中已经确定的微塑料的显微图进行比较，计算微塑料的含量，得到如表4结果：表4多组茎柔鱼样品的不同的机体组织中的微塑料含量(单位：个数)在本实施例中，对20尾茎柔鱼进行了微塑料检测，如上表所示，可以看出20尾茎柔鱼的各机体组织中检出有微塑料，与实施例5中每克机体组织对应加入20ml浓度为10wt％的消解液相比较，本实施例与实施例5均将各机体组织消解完全，但本实施例中的微塑料检出率偏低，这可能是当每克组织干重加入30ml浓度为20wt％的koh溶液时，koh溶液在消解机体组织时，将一部分微塑料消解掉了，使得微塑料的检出率相比于实施例5偏低。本实施例与实施例6中每克机体组织对应加入30ml浓度为25wt％的消解液相比较，本实施例中能够在各机体组织中检测出微塑料，而实施例6中微塑料检测率极低，这可能是因为实施例6中的消解液对微塑料的消解程度较大。而本实施例中，虽然将一部分微塑料消解掉了，但是各机体组织中基本能够检测出微塑料。因此，本发明中每克机体组织的干重对应的消解液的体积小于30ml，浓度小于20wt％。以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的
技术领域：
均包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12