【
技术领域：
：】本发明涉及生物
技术领域：
：，特别涉及一种用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品的制备方法。
背景技术：
：：蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodification，ptm)是指蛋白质翻译后的化学修饰，几乎参与了细胞所有的正常生命活动过程，并发挥着十分重要的调控作用。ptm作为蛋白质功能调节的一种方式，对蛋白质的结构和功能至关重要。研究表明，人体内50％-90％的蛋白质发生了翻译后修饰。目前已经确定的翻译后修饰方式超过400种，常见的修饰方式包括甲基化、磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化、sumo化、亚硝基化和氧化等。因此，ptm已经成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的领域。其中，蛋白质乙酰化是一种普遍存在的、可逆而且高度调控的蛋白质翻译后修饰方式，主要发生在蛋白质赖氨酸残基的ε-nh2位。乙酰化修饰由乙酰基转移酶和去乙酰化酶共同调节，且参与了几乎所有的生物学过程，如转录、应激反应、新陈代谢以及蛋白合成与降解等。蛋白质乙酰化修饰的检测不同于磷酸化，磷酸化可通过原位磷酸化标记、灵敏的磷酸化特异性抗体等稳定有效的手段进行研究，相对来说易于检测。而对于蛋白质乙酰化修饰检测的的手段和方法十分有限，这些技术上的困难限制了蛋白质乙酰化作用的研究和发展。目前制备检测蛋白质赖氨酸乙酰化的主要方法包括：(1)用赖氨酸乙酰化特异性抗体富集乙酰化肽段，再利用液相色谱质谱联用(hplc/ms)的方法进行检测；(2)采用细胞培养条件下稳定同位素标记氨基酸(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，silac)技术和高分辨率、高灵敏度的电场轨道阱回旋共振组合(ltqorbitrap)质谱仪完成了蛋白质乙酰化的鉴定。但是，以上方法都是基于蛋白质组学水平研究赖氨酸乙酰化修饰，无法用于检测某一特定蛋白质的乙酰化修饰。技术实现要素：鉴于上述内容，有必要提供一种用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品的制备方法，采用本发明制备方法制备得到的蛋白样品能显著增强质谱鉴定出特异性蛋白质乙酰化修饰位点的成功率。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品的制备方法，包括以下步骤：1)通过内源性实验选择具有乙酰化修饰的蛋白质a，并通过外源性实验确定蛋白质a的乙酰化转移酶b；2)制备共转染质粒a和质粒b的蛋白样品以及单独转染质粒a的蛋白样品：(1)在至少20个细胞培养皿中分别接种293t细胞，当细胞密度达到78-82％后，用转染试剂将质粒a单独转染一个细胞培养皿的细胞，同时，用转染试剂将质粒a与质粒b共转染其余的细胞培养皿的细胞；(2)将上述转染后的细胞培养皿放入培养箱中，于恒温和恒定二氧化碳浓度下培养6h后，去除含转染试剂-dna复合物的培养液，更换新的培养液继续培养48h；(3)将上述培养好的细胞收集于第一离心管中，将细胞沉淀离心后，往所述第一离心管中加入ripa裂解液；(4)将上述第一离心管置于垂直旋转摇床上裂解1h后离心，并将离心所得细胞上清液转入第二离心管，向所述第二离心管中加入抗体后在垂直旋转摇床上孵育过夜；(5)第二天往所述第二离心管中加入琼脂糖珠后，继续在垂直旋转摇床上孵育过夜；(6)第三天对所述第二离心管内的抗原-抗体-琼脂糖珠三者复合物离心后，用冷的ripa裂解液洗3次，最后一次清洗后吸干液体；(7)往所得的复合物中加入两倍浓度的上样缓冲液后，于100℃煮5-8min，再瞬时离心，得到一个单独转染质粒a的蛋白样品和至少19个共转染质粒a和质粒b的蛋白样品；3)从以上共转染质粒a和质粒b的蛋白样品中随机抽取1个蛋白样品，与单独转染质粒a的蛋白样品一起完成免疫印迹分析；4)将其余的共转染质粒a和质粒b的蛋白样品跑sds-page胶后，在考马斯亮蓝染液中孵育过夜，第二天在摇床上将胶脱色，直至胶的背景为白色而泳道中蛋白条带特别是目的条带为蓝色而终止脱色；根据a的分子量，将目的条带切下来放入第三离心管中，做好标记，即得所述用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品。进一步的，步骤2)的(1)中，所述293t细胞的接种量为5.2x106个/每个细胞培养皿。进一步的，步骤2)的(1)中，所述转染试剂为eztrans转染试剂。进一步的，步骤2)的(2)中，所述恒温的温度为37℃，所述二氧化碳的浓度为5％。进一步的，步骤2)的(1)中，当细胞密度达到80％后，用转染试剂将质粒a单独转染一个细胞培养皿的细胞，同时，用转染试剂将质粒a与质粒b共转染其余的细胞培养皿的细胞。进一步的，步骤1)中，所述外源性实验为：在293t细胞中，将质粒a与质粒b共转染，48h后收细胞，先进行免疫共沉淀，然后做免疫印迹分析。本发明具有以下有益效果：首先，本发明先通过内源性实验确定选择的蛋白质具有乙酰化修饰，再通过外源性实验进一步确认选择的蛋白质具有乙酰化修饰，双重确定，准确度达100％，同时通过外源性实验可确定该蛋白质的乙酰化转移酶；其次，本发明再通过ip技术有效富集发生和未发生乙酰化修饰的蛋白样品；第三，本发明在送样品进行质谱鉴定前先通过免疫印迹分析确保所有待检样品已发生乙酰化修饰，避免存在无效样品；第四，进行质谱鉴定的蛋白样品通过合样使得其具有足够高的丰度而更易鉴定出乙酰化修饰位点。通过以上步骤的有机结合，使得应用本发明制备方法制备得到的蛋白样品能显著增强质谱鉴定出特异性蛋白质乙酰化修饰位点的成功率。【附图说明】图1是本发明odn诱导内源性tlr9发生乙酰化修饰的结果图(即内源性实验结果图)。图2是本发明tlr9外源性乙酰化修饰的检测结果图(即外源性实验结果图)。图3是采用免疫印迹分析技术对随机抽样的蛋白样品进行乙酰化修饰检测的结果图。图4是共转染ha-a和ha-b的蛋白样品跑胶后的考马斯亮蓝染色图。图5-图11均是tlr9乙酰化位点的二级质谱图。如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。【具体实施方式】在本发明的一种较佳实施例中，以鉴定tlr9乙酰化修饰位点为例进行说明。一种用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品的制备方法，包括以下步骤：1)通过内源性实验确定tlr9具有乙酰化修饰，并通过外源性实验确定tlr9的乙酰化转移酶cbp；其中，内源性实验具体为：用同一浓度tlr9受体激活剂odn(0.5μm)在不同时间点(0min、15min、30min)刺激小鼠巨噬细胞raw264.7，并在odn刺激30min基础上加入去乙酰化酶抑制剂(trichostatina，tsa)刺激以上细胞，然后收集细胞做免疫沉淀(immunoprecipitation，ip)和免疫印迹(westernblot，wb)分析,实验结果如图1所示：由图1可知，随着odn刺激时间的延长，tlr9乙酰化水平呈现逐渐上升的趋势，并且tsa能够显著增强odn诱导的tlr9乙酰化水平，证明tlr9具有乙酰化修饰；外源性实验具体为：在293t细胞中，将ha-tlr9和ha-cbp质粒共转染，48h后收细胞，完成免疫共沉淀后做免疫印迹分析，实验结果如图2所示：由图2可知，乙酰化转移酶cbp介导tlr9发生乙酰化修饰，再次证明tlr9(即蛋白质a)具有乙酰化修饰以及cbp(即乙酰化转移酶b)是tlr9的乙酰化转移酶；2)制备共转染ha-tlr9和ha-cbp的蛋白样品以及单独转染ha-tlr9的蛋白样品：(1)在20个6cm细胞培养皿中分别接种5.2x106个293t细胞，第二天当细胞密度达到80％后，用24ul的eztrans转染试剂将质粒8ug的ha-tlr9单独转染其中一个细胞培养皿的细胞，同时，用24ul的eztrans转染试剂将4ug的质粒ha-tlr9与4ug的质粒ha-cbp共转染其余19个细胞培养皿的细胞；(2)将上述转染后的细胞培养皿放入培养箱中，于37℃和浓度为5％的co2下培养6h后，去除含eztrans-dna复合物的培养液，更换新的培养液继续培养48h；(3)将上述培养好的细胞收集于1.5ml的第一离心管中，于4℃下以5000转的转速将细胞沉淀离心10min后，往每管所述第一离心管中加入500ul的ripa裂解液；(4)将上述第一离心管置于垂直旋转摇床上，在4℃下裂解1h后，于4℃下以20000转的转速离心20min，并将离心所得的细胞上清液转入1.5ml的第二离心管中，向所述第二离心管中加入4μl的ha抗体后在垂直旋转摇床上孵育过夜；(5)第二天往所述第二离心管中加入40ul的琼脂糖珠(proteingplus-agarose)后，于4℃下在垂直旋转摇床上孵育过夜；(6)第三天对所述第二离心管内的抗原-抗体-琼脂糖珠三者复合物离心后，用冷的ripa裂解液洗3次，最后一次清洗后吸干液体；(7)往所得的复合物中加入20ul的两倍浓度上样缓冲液后，于100℃煮5min，再瞬时离心，得到一个单独转染ha-a的蛋白样品和19个共转染ha-tlr9和ha-cbp的蛋白样品，所得的蛋白样品可以直接用于做wb分析，也可冻存于-80℃的冰箱备用；3)从以上19个共转染ha-tlr9和ha-cbp的蛋白样品中随机抽取1个蛋白样品，与单独转染ha-tlr9的蛋白样品一起完成免疫印迹分析，检测分析结果见图3：由图3可知，共转染ha-tlr9和ha-cbp的蛋白样品已发生乙酰化修饰；4)将其余18个共转染ha-tlr9和ha-cbp的蛋白样品放到sds-page胶上的五个泳道一起跑后，在考马斯亮蓝染液中孵育过夜，第二天在摇床上将胶脱色，直至胶的背景为白色而泳道中蛋白条带特别是目的条带为蓝色而终止脱色，结果如图4所示；根据a的分子量，将目的条带切下来放入第三离心管中，做好标记，即得所述用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品。将上述制备得到的所述用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品送往有资质的生物公司做tlr9乙酰化修饰位点质谱(lcmsms)鉴定，具体鉴定过程包括：供试品酶解、质谱分析、质谱数据采集和数据分析，最终鉴定7个tlr9乙酰化修饰位点，如图5-11所示。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12当前第1页12