一种可视化半定量快速评价梨果石细胞的方法

本发明涉及果品鉴定领域，特别是涉及一种可视化半定量快速评价梨果石细胞的方法。
背景技术：
：梨(pyrusspp.)是世界上种植和消费广泛的重要水果之一。中国梨栽培历史有3000多年，梨树适应性非常广，在中国从北至南均有栽培。梨果是药食同源的水果，为“百果之宗”，营养丰富，具有消炎润肺清热的作用。梨果主要以鲜食为主，部分加工为果汁、果酒等。梨果销售时，消费者更喜爱细嫩无颗粒感香甜可口的梨果；新品种选育时，优良的果肉内质是育种者筛选高品质梨果的一个重要指标。石细胞是影响梨果肉肉质的重要因素之一，是评价梨果肉质特性的重要指标。石细胞是薄壁组织细胞通过细胞壁次生加厚发育而来，由大量木质素和纤维素组成，在果肉中单个或成群存在，成群的石细胞成为石细胞团。石细胞含量直接影响果肉的内质，石细胞含量少则肉质细嫩无颗粒感，石细胞含量高则肉质紧密粗糙有明显颗粒感。石细胞含量的多少可以分为石细胞含量＜0.05g/100g的无或极少，0.05g/100g≤石细胞含量＜0.2g/100g的少，0.2g/100g≤石细胞含量＜0.5g/100g的中，0.5g/100g≤石细胞含量＜0.8g/100g的多，石细胞含量≥0.8g/100g的极多(梨种质资源描述规范和数据标准)。研究分析表明直径为250-500μm的石细胞团在果肉中所占比例较高，果肉中直径大于250μm的石细胞团的含量是影响果肉质地的重要指标，提出利用石细胞团评价果肉质地的标准，每百克果肉石细胞团(直径>250μm)含量(n)≤0.04g，果肉质地极细；0.04g<n≤0.12g，果肉质地细；0.12g<n≤0.3g，果肉质地中；0.3g<n≤0.8g，果肉质地粗；n>0.8g，果肉质地极粗。梨果实石细胞多少和大小的性状是种质资源评价和新品种选育重要鉴定性状。目前对梨果实石细胞的测定方法一般有冷冻法、冷冻硫酸处理法、酶解法、盐酸处理法、自然酶解法等，然而这些方法存在流程繁琐、费时较长、成本较高等缺陷。目前，缺少一种能够快速判断梨果石细胞的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种可视化半定量快速评价梨果石细胞的方法，以解决上述现有技术存在的问题，实现梨使细胞含量的快速判断。为实现上述目的，本发明提供了如下方案：技术方案之一，提供了一种可视化半定量快速评价梨果石细胞的方法，包括以下步骤：(1)取待测样品果实横切片，以盐酸溶液与间苯三酚溶液染色；(2)染色完成的果实横切片清洗后贴在竖式灯箱屏幕上开灯成像，获得待测样品石细胞染色图像；(3)待测样品石细胞染色图像与石细胞染色标准品比较，得出结论。优选的，步骤(1)中，所述待测样品果实横切片的厚度为1mm。优选的，步骤(1)中，所述盐酸溶液的体积浓度为50％。优选的，步骤(1)中，所述盐酸溶液用量为3ml。优选的，步骤(1)中，所述间苯三酚溶液中还含有吐温20。优选的，步骤(1)中，所述的间苯三酚溶液的配制方法为：取间苯三酚10g，兑入80ml85％酒精溶解充分溶解，再加入1ml吐温20混合均匀，再倒入100ml容量瓶中定容至100ml。优选的，步骤(1)中，所述的间苯三酚溶液的用量为3ml。优选的，步骤(3)中，所述的石细胞染色标准品分级如下所述：1级：染成红色的石细胞颗粒极小分布稀疏；2级：染成红色的石细胞颗粒较小间有少量较明显的红色石细胞团；3级：染成红色的石细胞颗粒小分布较密有少量较明显的红色石细胞团；4级：染成红色的石细胞颗粒多且密有明显的红色石细胞团；5级：染成红色的石细胞为大颗粒石细胞团且分布非常密。优选的，步骤(3)中，所述的石细胞染色标准品为：1级，翠冠；2级鄂梨2号；3级，新高；4级，大理砂糖梨；5级，梨园香梨。技术方案之二，提供了所述的可视化半定量快速评价梨果石细胞的方法在梨种质资源评价和筛选中的应用。本发明公开了以下技术效果：本发明公开了一种可视化半定量快速评价梨果石细胞的方法，对梨果实横切面进行徒手切片后，用间苯三酚-盐酸染料对石细胞染色立体成像再半定量测试样品的石细胞含量，石细胞切片染色后在灯箱上成像图片对比直接拍摄无水渍反光且图片更清晰立体。传统的冷冻法对石细胞含量进行测定时需要经过果肉切碎、冷冻、匀浆、浸洗、过滤、烘干和称量等繁琐的步骤，一个样品从取样到石细胞含量的结果至少需要36小时，本发明方法可以快速高效的在10分钟内得到石细胞鉴定评价的结果，图片清晰直观明确。该方法简单易行，操作简单，快速高效，结果直观，通过本发明可以高效快速且直观的得到梨果实石细胞分布和半定量的结果，从而提高种质资源评价和新品种筛选的效率，适合在产业上推广应用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明操作步骤图；图中a为梨果实横切准备切片；b为横切1mm厚度的梨果实横切片；c为梨果实横切片用染色液染色90秒；d为纯水洗去染色液；e为染色果实片上灯箱立体成像；f为根据石细胞染色标准品半定量测试样品的石细胞含量；图2为本发明实施例1制备的石细胞染色标准品图；图中a为1级标准品；b为2级标准品；c为3级标准品；d为4级标准品；e为5级标准品；图3为本发明实施例2中6个梨品种的石细胞染色图；图中a为苏翠1号，判定为1级；b为金碧，判定为2级；c为美黄，判定为3级；d为丰水，判定为2级；e为柳城凤山梨，判定为3级；f为金吊子，判定为5级。具体实施方式现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本发明所使用的材料、试剂及仪器如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。本发明中部分试剂配制方法如下：50％盐酸溶液：将浓盐酸缓慢倒入等体积纯水中混合为50％盐酸。10％间苯三酚溶液：准确称取间苯三酚10g，兑入80ml85％酒精溶解充分溶解，再加入1ml吐温20混合均匀，再倒入100ml容量瓶中定容至100ml。本发明操作步骤如图1所示。实施例1石细胞染色标准品的建立(1)样品筛选自湖北省农业科学院果树茶叶研究所国家果树种质武昌砂梨圃选取853份不同品种的梨果实，梨树为管理水平一致的8～12年生健壮树，每个品种从梨树不同方位取成熟果实10个，采用四分法每份样品取梨果肉90～110g于-20℃冷冻，每个品种至少3次重复。梨果肉-20℃冷冻24h后在榨汁机中搅拌成果汁，加水静置倒出上层悬浮物，漂洗4次，下层石细胞经滤纸过滤收集后置烘箱70℃烘3h，称量干燥石细胞。石细胞含量＝称量的石细胞质量(g)/每份样品实际果肉质量(g)×100％。根据853份梨种质资源石细胞不同含量和果肉质地的鉴定评价结果，筛选出不同石细胞含量的样品。(2)梨果实横切面切薄片在梨果实直径最大的位置用水果刀将果实横切为两半，从其中一半上切下厚度为1mm左右完整的梨果实横切片。(3)梨果实横切片染色将一片完整的梨果实横切片放入培养皿中，先在果实横切面上滴上3ml50％盐酸，再立即滴入3ml10％间苯三酚溶液。染色90s后倒出染液，用纯净水清洗梨果实横切片残留染液3次。(4)染色果实片上灯箱立体成像用镊子将清洗后完整的梨果实切片从培养皿中轻轻提起贴在竖式灯箱屏幕上，灯箱打开并拍照。最终确定石细胞染色标准样品分为5个级别(表1)，标准品染色图如图2所示。表1石细胞染色标准品分级实施例2梨果实石细胞的快速分析(1)采集果实样品2020年7-9月在国家果树种质武昌砂梨圃按照梨果实成熟期采集成熟的苏翠1号、金碧、美黄、丰水、柳城凤山梨、金吊子果实3-5个。(2)梨果实横切面切薄片在梨果实直径最大的位置用水果刀将果实横切为两半，从其中一半上切下厚度为1mm左右完整的梨果实横切片，同一品种至少从不同果实上取出3片梨果实横切薄片。(3)梨果实横切片染色将一片完整的梨果实横切片放入培养皿中，先在果实横切面上滴上3ml50％盐酸，再立即滴入3ml10％间苯三酚溶液。染色90s后倒出染液，用纯净水清洗梨果实横切片残留染液3次。(4)染色果实片上灯箱立体成像用镊子将清洗后完整的梨果实切片从培养皿中轻轻提起贴在竖式灯箱屏幕上，灯箱打开并拍照，每个品种至少选择来自不同果实的3份清晰照片。(5)参照不同石细胞染色标准品半定量测试样品石细胞含量对比不同石细胞染色标准品对测试样品进行石细胞含量的半定量，石细胞染色图片及半定量结果如表2及图3所示，并且与冷冻法检测结果比对，证明本发明检测方法准确性高。表26个品种染色半定量标准染色分级品种分级染色图石细胞含量苏翠1号2级图3a0.063％金碧2级图3b0.191％美黄4级图3c0.616％丰水2级图3d0.053％柳城凤山梨5级图3e0.823％金吊子5级图3f2.095％用上述方法对梨果实横切面进行徒手切片，用间苯三酚-盐酸染料对石细胞染色立体成像后再半定量测试样品的石细胞含量，石细胞切片染色后在灯箱上成像图片对比直接拍摄无水渍反光且图片更清晰立体。传统的冷冻法对石细胞含量进行测定时需要经过果肉切碎、冷冻、匀浆、浸洗、过滤、烘干和称量等繁琐的步骤，一个样品从取样到石细胞含量的结果至少需要36小时，该方法可以快速高效的在10分钟内得到石细胞鉴定评价的结果，图片清晰直观明确。该方法简单易行，操作简单，快速高效，结果直观，通过本发明可以高效快速且直观的得到梨果实石细胞分布和半定量的结果，从而提高种质资源评价和新品种筛选的效率。以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。当前第1页12