基于高光谱成像技术的玉米籽粒中黄曲霉毒素鉴别方法

1.本技术属于高光谱成像应用领域和毒物检测领域，具体地，本技术提供了一种基于高光谱成像技术的玉米籽粒中黄曲霉毒素鉴别方法。


背景技术：

2.黄曲霉毒素是某些曲霉属真菌产生的有毒次级代谢产物，对人类和其他动物有很强的致癌性(可诱发肝癌)、致突变性和致畸性，是自然界中毒性最强的化合物之一。目前已知的十几种黄曲霉毒素中，以黄曲霉毒素b1(afb1)毒性最强，污染玉米籽粒后，即便是十亿分之一的含量(ppb量级)，长期食用也会造成人类和其他动物死亡。采用经济、高效的检测方式对被黄曲霉毒素污染的玉米籽粒进行判别和剔除，对防止污染籽粒流入食物链、减少死亡和疾病负担至关重要。
3.检测黄曲霉毒素的传统化学方法，如酶联免疫、薄膜层析等，操作费时费力、检测材料造价昂贵、且往往需要有专业人员操作，很难满足大宗玉米籽粒的快速无损检测需求。本领域总需要一种操作简单、速度快的适用大宗玉米籽粒的黄曲霉素检测方法。


技术实现要素：

4.针对上述问题，我们利用高光谱成像技术结合化学计量学方法，建立了一种能够快速、无损鉴别以玉米为代表的谷物中是否被黄曲霉毒素污染的方法。
5.一方面，本技术提供了一种基于高光谱成像技术的玉米籽粒中黄曲霉毒素鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.步骤一，选择不同品种的玉米在生长阶段接种产毒黄曲霉菌，获得黄曲霉毒素污染的玉米籽粒，采用高光谱成像仪器对所述样品进行数据采集；
7.步骤二，对采集的高光谱图像进行黑白校正和裁剪预处理；
8.步骤三，使用波段运算对不同灰度图像进行计算，构建玉米籽粒与背景差异明显的新图像；
9.步骤四，利用阈值对新图像分割，掩膜得到只包含籽粒的感兴趣区；
10.步骤五，提取感兴趣区的平均光谱，并进行z
‑
socre标准化；
11.步骤六，建立随机森林判别模型；
12.步骤七，应用模型识别毒素污染籽粒。
13.进一步地，所述黄曲霉毒素为afb1。
14.进一步地，步骤一中所述的不同品种玉米采用杂交玉米tzei11*phw53和转基因玉米dkc62
‑
08。
15.进一步地，接种的产毒黄曲霉菌型号为nrrl 3357。
16.进一步地，黄曲霉毒素污染的玉米籽粒选自产毒黄曲霉菌接种区域的周围。
17.进一步地，采集的高光谱数据波段范围为400
‑
1000nm。
18.进一步地，用于波段运算的两个灰度图像，是根据玉米籽粒和背景板的光谱曲线
中，玉米籽粒反射率差值相差最大的两点所在波段确定的。
19.进一步地，步骤四中，应用阈值将步骤三得到的新图像中背景等无关区域选中，掩膜将玉米籽粒所在区域标记为1，将背景区域标记为0。
20.进一步地，步骤五中还包括使用高效液相色谱仪串联柱后衍生定量检测籽粒中黄曲霉毒素。
21.进一步地，步骤五中还包括将得到的所有籽粒平均光谱数据按照2：1的比例随机分为训练集和验证集。
22.进一步地，在步骤五中，将标记为1的玉米籽粒区域分别选为不同的感兴趣区，每个感兴趣区为一个玉米籽粒，并计算每个籽粒的平均光谱。
23.进一步地，步骤七的识别标准为判别准确率。
24.本技术中的黄曲霉毒素优选afb1。
25.本发明地有益效果主要在于：
26.本发明所述的玉米籽粒中afb1鉴别方法，利用高光谱成像技术结合化学计量学方法，建立了随机森林判别模型，可以对玉米籽粒中是否污染了afb11进行判别，操作简单，可满足快速、无损等在线检测需求。
附图说明
27.图1为籽粒伪彩色图像和对应不同区域的光谱曲线；
28.图2为阈值选择和背景区域选择。
具体实施方式
29.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方法中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
30.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
31.实施例1试验材料
32.实施例中选用的玉米籽粒，来自自然生长过程中接种了产毒黄曲霉菌的玉米植株，包括转基因玉米dck62
‑
08和杂交玉米tzei11*phw53两个品种。两种玉米分别种植在26个不同的种植实验区内，每个实验区内有4行植株，每行种植12棵玉米。在玉米植株开花20天后，选取每个实验区中间两行中间的12棵玉米植株上的玉米籽粒，用灭菌手术刀划破部分玉米外皮，伤口长度约5厘米，并在伤口处接种浓度为106个孢子/ml的产毒黄曲霉菌孢子悬浮液(本研究中接种的菌株型号为nrrl 3357，为野生高产毒黄曲霉菌)，作为实验组，剩
余未接种的玉米植株(共36棵)作为控制组。玉米收获后干燥，每个实验区内挑选一个接种组和一个控制组样本，在黑光灯下，从实验组接种真菌的玉米籽粒周围挑选3个有黄绿色荧光的完整籽粒，作为潜在被污染玉米籽粒；从控制组玉米植株上挑选1粒健康完整的籽粒，作为实验对照玉米籽粒；最终用于本研究的玉米籽粒共104粒。
33.实施例2建模过程
34.建立玉米籽粒中是否存在超过安全标准的afb1的判别模型，其包括以下步骤：
35.步骤一：采集玉米籽粒的高光谱图像数据，波段范围在400
‑
1000nm。采集玉米籽粒高光谱图像过程中，为保障实验人员的身体健康，待测玉米籽粒被放置在白色teflon板上，并加盖高透有机玻璃的盖子，防止样品在转移和数据采集过程中，有毒孢子飘散到空气当中。
36.步骤二：采集白色标准板的图像作为白参考，关闭光源并盖上镜头盖后采集的图像作为黑参考，用黑白参考对采集到的高光谱图像进行黑白校正，以抑制仪器本身和暗电流带来的随机噪声。
37.步骤三：将高光谱数据中背景板和标签等无关区域进行裁剪，只保留中间样本区域用于后续分析，以减少噪声信息，提高后续分析效率。
38.步骤四：考虑背景板的反射率在不同波段变化不大，首先手动勾选了玉米籽粒(胚乳和胚芽区域)，籽粒阴影以及背景板所在区域，并计算对应区域的平均光谱(图1)。随着波长的增加，背景板的光谱反射率小幅下降，而玉米籽粒胚乳和胚芽的光谱反射率先下降后大幅上升，籽粒阴影处的光谱反射率先下降再小幅上升，之后基本保持稳定。选择玉米籽粒反射率差别最大的两个波段863nm和438nm，图1中两虚线标示处的灰度图像做差值运算，得到玉米籽粒与背景亮度值差别最大的新图像，在新图像应用阈值，如图2,选择背景等无关信息所在区域，并做掩膜扣除无关背景，只保留玉米籽粒的信息用于后续分析。
39.步骤五：高光谱数据采集完成后，将玉米籽粒按照顺序分别放入样品带内，送至微生物实验室进行黄曲霉毒素b1(afb1)的定量检测；以安全标准规定的20ppb为阈值，afb1含量高于阈值的标记为污染组，afb1含量低于阈值的标记为健康组。本实施例中，选用高效液相色谱串联柱后衍生检测afb1的含量，检测前粉碎每个玉米籽粒分别放入10ml离心管内，加1ml甲醇震荡2小时，用afb1免疫亲和柱富集震荡后上清液中的afb1，本研究选用的是美国romer公司的afb1免疫亲和柱，玉米籽粒中afb1含量如表1所示。
40.表1玉米籽粒中afb1含量统计
[0041][0042]
步骤六：计算每个玉米籽粒的平均光谱，将所有光谱按2：1的比例划分为训练集和验证集；使用z
‑
score标准化算法对平均光谱进行预处理，计算公式如公式(1)
[0043][0044]
其中μ为玉米籽粒光谱的均值，σ为玉米籽粒光谱的标准差。
[0045]
步骤七：建立随机森林判别模型，将输入样本输入到每棵决策树中进行分类；每棵决策树都是独立的，对于每棵决策树而言，随机且有放回地从训练集中的抽取70个训练样
本，作为训练集；将若干个弱分类器(决策树)组成一个强分类器(森林)。根据网格搜索结果，设定模型的“叶子”数量为5，“树”的数量为100棵，导入训练集数据对模型进行训练。
[0046]
步骤八：应用训练好的模型对玉米籽粒中污染的afb1进行判别。所述步骤八的判别标准为模型的判别准确率。采用所建立的模型对训练集和验证集进行判别，训练集和验证集准确率分别为97.1％及94.1％，能较好的区分健康和afb1污染的玉米籽粒。
[0047]
表2模型判别结果
[0048][0049][0050]
最后应说明的是：以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。