一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法与流程

本发明属于中药领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法。

背景技术：

现有研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制小肠中的α-葡萄糖苷酶，阻断1，4-糖苷键水解，有效降低餐后血糖水平，市场上存在多种α-葡萄糖苷酶活性抑制药物，但是成本高且会产生不良反应。我国中草药资源丰富，且中医药治疗糖尿病历史悠久疗效显著，现有研究发现部分中药能有效抑制餐后血糖快速升高，如桑叶、升麻等。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法主要有对-硝基苯基α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)法、葡萄糖氧化酶法和固定化酶法。其中较为常用的为pnpg法，该法操作方便简单，但目前该研究多采用终点法(测定反应某一时间点的结果作为最终评估结果)进行测定，反应过程不明朗，反应终点的选取对测定结果影响较大；同时测定样品数量有限，目前仍缺乏一种能够快速筛选并验证具有抑制α-葡萄糖苷酶活性物质的有效方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提出一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，提高具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材筛选效率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，包括以下步骤：

体外高通量筛选模型构建：建立α-葡萄糖苷酶和底物pnpg的体外反应模型，利用酶标仪检测生成物pnp的吸光值变化，进而反映中药材对酶的抑制活性；

药材库的建立：选取不同种类的中药材，粉碎后用不同浓度的有机试剂进行提取，获得提取液，建立药材库；

活性筛选：对药材库中的提取液进行过滤，取上清液稀释后加入反应模型使用酶标仪记录起吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算抑制效果。

优选的是，所述体外反应模型的反应底物组分为0.05-0.1mol/l、ph6.8-7.2的磷酸钠缓冲液50-150μl，0.8-1u/mlα-葡萄糖苷酶10～25μl，0.00193-0.00232mol/lpnpg溶液10-25μl。

优选的是，所述药材库建立步骤中，药材粉碎粒度为20-100目。

优选的是，所述药材库建立步骤中，分别用30％-90％浓度的乙醇溶液对药材进行提取，提取料液比为1:10-20，提取时间40-60min。

优选的是，所述活性筛选步骤中，使用酶标仪对生成物吸光度进行测定时，测定波长为400-405nm。

优选的是，所述活性筛选步骤中，每1min进行一次测定，持续90min。

优选的是，所述活性筛选步骤中，用空白吸光度曲线下面积(auc空白)减去样品作用曲线下的积分面积(auc样品)，得出曲线下净面积(netauc)，曲线下净面积(netauc)与空白曲线下面积的比值即为抑制率，计算公式为：

抑制率％＝(auc空白-auc样品)/auc空白×100。

优选的是，当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。

本发明产生的有益效果是：可以利用酶标仪多孔板进行活性测定，短时间内完成几十甚是上百种样品的活性测定，节约资源同时极大提升效率。本发明中建立的高通量分析模型通过酶标仪在400-405nm处全程监控α-葡萄糖苷酶与pnpg反应过程，使反应过程表现为吸光度数值变化，全面且直观掌控反应变化过程。本发明采用曲线积分法测定，通过测定样品与空白反应曲线下面积之差，客观且精准地反映样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，排除假阳/阴性现象，使结果更具有可信度。

附图说明

图1是实施例1中的阿卡波糖标准曲线；

图2是实施例2中的阿卡波糖标准曲线；

图3是实施例3中的阿卡波糖标准曲线。

具体实施方式

实施例1

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的构建

实验在96孔板中进行，在96孔板中加入0.08mol/l、ph6.8磷酸钠缓冲溶液125μl、0.8-u/mlα-葡萄糖苷酶溶液25μl、25μl样品溶液或阳性对照(阿卡波糖，acarbose)，31℃保温孵育10min，然后迅速加入0.00213mol/lpnpg溶液25μl，于酶标仪中摇匀后迅速开始测定400nm处吸光值。利用酶标仪配备软件记录吸光度od值，每1min测定一次，持续90min，当出现fx为最大值且稳定时标志着反应结束。无样品的空白曲线下面积(auc空白)减去样品作用曲线下的积分面积(auc样品)，得出曲线下净面积(netauc)。

抑制率计算公式为：抑制率％＝(auc空白-auc样品)/auc(空白)×100；

当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。

精确配制阿卡波糖母液浓度1mg/ml，稀释成不同浓度，分别加入0.08mol/l、ph6.8磷酸钠缓冲溶液125μl、0.8-u/mlα-葡萄糖苷酶溶液25μl，31℃孵育10min，再迅速加入0.00213mol/lpnpg溶液25μl，于400nm波长下测定其吸收值，以阿卡波糖浓度为横坐标，曲线下净面积(netauc)为纵坐标，建立如图1的标准曲线。求得回归曲线方程为:y＝27.316x+2.9985(r²＝0.9985)，说明在阿卡波糖浓度0.05mg/ml-0.8mg/ml范围内线性关系良好。药材库的建立

选择表1中的常见中药材170味，选择35％、75％乙醇溶剂对每味中药材进行提取。称取适量中药材，粉碎，准确称取2g，按中药材：溶剂＝1:10(mg:ml)超声提取40min，滤纸过滤，上清液冷藏于4℃。

表1

35％乙醇提取成分的筛选

将35％乙醇提取溶液加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下6个样品：高良姜、肉桂、丁香、墨旱莲、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。

75％乙醇提取成分的筛选

将75％乙醇提取溶液加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下9个样品：高良姜、肉桂、丁香、盐补骨脂、补骨脂、墨旱莲、赤芍、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。

实施例2

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的构建

实验在96孔板中进行，在96孔板中加入0.07mol/l、ph7.1磷酸钠缓冲溶液50μl，0.9u/mlα-葡萄糖苷酶溶液10μl、10μl样品溶液或阳性对照(阿卡波糖，acarbose)，34℃保温孵育20min，然后迅速加入0.00198mol/lpnpg溶液10μl，于酶标仪中摇匀后迅速开始测定402nm处吸光值。利用酶标仪配备软件记录吸光度od值，每1min测定一次，持续90min，当出现fx为最大值且稳定时标志着反应结束。无样品的空白曲线下面积(auc空白)减去样品作用曲线下的积分面积(auc样品)，得出曲线下净面积(netauc)。

抑制率计算公式为：抑制率％＝(auc空白-auc样品)/auc(空白)×100；

当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。

精确配制阿卡波糖母液浓度1mg/ml，稀释成不同浓度，分别加入0.07mol/l、ph7.1磷酸钠缓冲溶液50μl，0.9u/mlα-葡萄糖苷酶溶液10μl、10μl阿卡波糖溶液，34℃孵育20min，再迅速加入0.00198mol/lpnpg溶液10μl，于402nm波长下测定其吸收值，以阿卡波糖浓度为横坐标，曲线下净面积(netauc)为纵坐标，建立如图2的标准曲线。求得回归曲线方程为:y＝26.261x+2.9649(r²＝0.9973)，说明在阿卡波糖浓度0.05mg/ml-0.8mg/ml范围内线性关系良好。

药材库的建立

选择表2中的常见中药材170味，选择35％、75％乙醇溶剂对每味中药材进行提取。称取适量中药材，粉碎，准确称取2g，按中药材：溶剂＝1:15(mg:ml)超声提取50min，滤纸过滤，上清液冷藏于4℃。

表2

35％乙醇提取成分的筛选

将35％乙醇提取溶液稀释30倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下6个样品：高良姜、肉桂、丁香、墨旱莲、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。

75％乙醇提取成分的筛选

将75％乙醇提取溶液稀释30倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下9个样品：高良姜、肉桂、丁香、盐补骨脂、补骨脂、墨旱莲、赤芍、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。

实施例3

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的构建

实验在96孔板中进行，在96孔板中加入0.1mol/l、ph7.0磷酸钠缓冲溶液100μl、1u/mlα-葡萄糖苷酶溶液20μl、20μl样品溶液或阳性对照(阿卡波糖，acarbose)，37℃保温孵育30min，然后迅速加入0.00228mol/lpnpg溶液20μl，于酶标仪中摇匀后迅速开始测定405nm处吸光值。利用酶标仪配备软件记录吸光度od值，每1min测定一次，持续90min，当出现fx为最大值且稳定时标志着反应结束。无样品的空白曲线下面积(auc空白)减去样品作用曲线下的积分面积(auc样品)，得出曲线下净面积(netauc)。

抑制率计算公式为：抑制率％＝(auc空白-auc样品)/auc(空白)×100；

当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。

精确配制阿卡波糖母液浓度1mg/ml，稀释成不同浓度，分别加入0.1mol/l、ph7.0磷酸钠缓冲溶液100μl、1u/mlα-葡萄糖苷酶溶液20μl、20μl阿卡波糖溶液，37℃孵育30min，再迅速加入0.00228mol/lpnpg溶液20μl，于405nm波长下测定其吸收值，以阿卡波糖浓度为横坐标，曲线下净面积(netauc)为纵坐标，建立如图3的标准曲线。求得回归曲线方程为:y＝27.658x+2.4865(r²＝0.9979)，说明在阿卡波糖浓度0.05mg/ml-0.8mg/ml范围内线性关系良好。

药材库的建立

选择表3中的常见中药材170味，选择35％、75％乙醇溶剂对每味中药材进行提取。称取适量中药材，粉碎，准确称取2g，按中药材：溶剂＝1:20(mg:ml)超声提取60min，滤纸过滤，上清液冷藏于4℃。

表3

35％乙醇提取成分的筛选

将35％乙醇提取溶液稀释50倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下6个样品：高良姜、肉桂、丁香、墨旱莲、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。

75％乙醇提取成分的筛选

将75％乙醇提取溶液稀释50倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下9个样品：高良姜、肉桂、丁香、盐补骨脂、补骨脂、墨旱莲、赤芍、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。

综上所述，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，但上述优选实施例并非用以限制本发明，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。