一种基于SERS技术的微量乙酰胆碱酯酶快速检测方法

一种基于sers技术的微量乙酰胆碱酯酶快速检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于sers技术的微量乙酰胆碱酯酶快速检测方法，属于离体生物传感技术领域。


背景技术：

2.随着社会工业的发展，周围神经损伤的发病率逐年上升。目前常用的治疗方式有周围神经断端神经外膜缝合法和神经束膜缝合法。而神经缝合最大的难题在于如何在手术中快速准确鉴别神经干内运动束和感觉束。目前临床上尚缺乏能在短时间内准确鉴别周围神经束性质的方法，不同性质神经束的错误吻合必将严重影响术后神经功能的恢复。因此如何快速准确鉴别周围神经束性质成为当今显微外科中正确连接神经手术中迫切的技术需求。国内外众多学者为快速准确鉴别神经束性质、提高神经吻合术的成功率，进行了大量的研究：依据周围神经组织的形态学特点的解剖学方法、电刺激神经束所产生不同反应的电刺激方法、酶底物不同代谢速度的同位素方法、酶组织化学染色方法、酶联免疫吸附试验方法、免疫组织化学法等等。
3.但是受限于实验设备、实验条件及检测时间等因素，目前尚无一种简单有效的方法可以应用于临床中。随着科学技术的不断发展，周围神经外科会不断借鉴、吸收更好的检测方法，使神经束性质的鉴别更加准确、快速、简单、经济，一直是临床显微外科手术中的迫切需要。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明目的是提供一种基于sers技术的微量乙酰胆碱酯酶快速检测方法。
5.技术方案：本发明所述的一种基于sers技术的微量乙酰胆碱酯酶快速检测方法，所述的检测方法包括将含有巯基的芳香化合物共价吸附到sers基底作为拉曼内参分子，含季铵盐的杂环化合物作为竞争分子和硫代胆碱竞争结合到sers基底，根据含季铵盐的杂环化合物的拉曼特征峰强度和含有巯基的芳香化合物的拉曼特征峰强度比值即可得到乙酰胆碱酯酶含量。
6.所述竞争结合是含季铵盐的杂环化合物作为竞争分子和硫代胆碱两者都可以结合到基底上，共存时，就竞争结合到基底上，具体的结合量和各自的相对数量有关。竞争结合到sers基底的含季铵盐的杂环化合物的量和乙酰胆碱酯酶的浓度呈反比。
7.进一步地，所述含有巯基的芳香化合物为硫代苯酚、巯基苯甲酸、巯基苯胺或巯基苯酚。
8.进一步地，所述含季铵盐的杂环化合物为亚甲基蓝、尼罗蓝a或罗丹明。
9.进一步地，所述sers基底包括基于光纤的sers基底、基于针灸针的sers基底或基于毛细管的sers基底。
10.进一步地，所述硫代胆碱为乙酰胆碱酯酶催化底物硫代乙酰胆碱生成的。
11.本发明所述一种基于sers技术的微量乙酰胆碱酯酶快速检测方法，包括以下步骤：
12.(1)建立标准曲线：在不同浓度的乙酰胆碱酯酶标样中分别加入等体积的含季铵盐的杂环化合物和硫代乙酰胆碱的混合溶液，反应温育得到的反应液，将含有巯基的芳香化合物的功能化sers基底浸入反应液中，浸泡温育，采集经过浸泡温育后的功能化sers基底的拉曼光谱，制作乙酰胆碱酯酶含量与含季铵盐的杂环化合物的拉曼特征峰强度和含有巯基的芳香化合物的拉曼特征峰强度比值的标准曲线；
13.(2)样品检测：用待测样品代替步骤(1)中的乙酰胆碱酯酶标样，重复步骤(1)的操作，根据含季铵盐的杂环化合物的拉曼特征峰强度和作为内标的含有巯基的芳香化合物的拉曼特征峰强度比值即可在步骤(1)得到的标准曲线中查得对应待测样品中乙酰胆碱酯酶的含量。
14.进一步地，所述含有巯基的芳香化合物的浓度为1
×
10
‑9‑1×
10
‑3m。
15.进一步地，所述不同浓度的乙酰胆碱酯酶标样的浓度为10u/ml、1u/ml、0.1u/ml、0.01u/ml、0.001u/ml、0.0001u/ml，所用不同浓度的乙酰胆碱酯酶标样的体积为0.1
‑
100μl。
16.进一步地，所述所述含季铵盐的杂环化合物和硫代乙酰胆碱混合液中含季铵盐的杂环化合物的浓度为1
×
10
‑9‑3×
10
‑3m，硫代乙酰胆碱的浓度为0.5
×
10
‑5‑5×
10
‑3m。
17.进一步地，所述反应温育的时间为2
‑
10min，所述浸泡温育的时间为1
‑
5min。
18.进一步地，所述基于光纤的sers基底制作，包括以下步骤：
19.将石英光纤用无水乙醇清洗，干燥，得到表面洁净的石英光纤，再用3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液或3
‑
巯丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡石英光纤截面的一端，再用无水乙醇清洗，干燥得到氨基化或巯基化石英光纤截面；将银纳米粒子悬浮液滴加于氨基化或巯基化石英化的光纤截面的一端，干燥后即可得到基于光纤的sers基底。
20.进一步地，所述基于针灸针的sers基底制作，包括以下步骤：
21.将针灸针用无水乙醇清洗，干燥，得到表面洁净的针灸针，再用3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液或3
‑
巯丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡针灸针针身，再用无水乙醇清洗，干燥得到氨基化或巯基化的针灸针；再在距离氨基化或巯基化的针灸针的针尖一定距离处滴加金银合金纳米粒子的悬浮液，干燥后得到基于针灸针的sers基底。
22.进一步地，所述基于毛细管的sers基底制作，包括以下步骤：
23.将毛细管用无水乙醇清洗，干燥，得到表面洁净的毛细管，再用3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液或3
‑
巯丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡毛细管；用无水乙醇清洗，干燥得到氨基化或巯基化的毛细管；将氨基化或巯基化的毛细管插入金纳米壳的悬浮液，干燥后可得基于毛细管的sers基底。
24.本发明是基于拉曼技术，提供一种可应用于临床手术的快速检测微量乙酰胆碱酯酶含量的方法。目前已有的众多乙酰胆碱酯酶检测方法受限于设备，环境，检测时间等因素，不适合应用于手术过程中快速检测微小神经组织乙酰胆碱酯酶含量。本发明通过功能化具有拉曼信号增强功能的sers基底，并在含有巯基芳香化合物的溶液中浸泡，使得该含巯基分子的化合物结合在基底的大部分位点上。之后，将其浸泡在含有含季铵盐的杂环化合物、乙酰胆碱和生物组织提取液中，充分反应后进行拉曼光谱检测，将得到的数据与拉曼
标准曲线对照，得出乙酰胆碱酯酶的浓度。
25.本发明基于拉曼技术，构建一种乙酰胆碱酯酶的快速检测方法，该方法可以实现对神经切片的运动束与感觉束乙酰胆碱酯酶含量的快速检测，快速鉴定周围神经运动束与感觉束，为显微外科等神经相关手术提供一种更加准确、快速、简单、经济的分析方法和工具。
26.有益效果：本发明和现有技术相比，具有以下显著优点：(1)相比于其他检测方法，本发明的方法不仅操作简单，而且检测所需组织样少。(2)本发明的方法在实施中，乙酰胆碱酯酶的反应时间和拉曼光谱的获取时间短，在对临床神经切片组织的检测时间可以短到5min。(3)本发明的方法是一种超灵敏的乙酰胆碱酯酶的检测方法，即使是神经切片这样微量的生物组织，其检测限也比其他(anal chem.，2008，80，3769
‑
3776；sens.actua.b，2018，259，75
‑
82)方法低1
‑
2个数量级；(4)本发明的方法拉曼信号采集的仪器成熟，便携式拉曼光谱仪价格便宜、操作简单、且大小仅与智能手机相当，易与现有临床手术平台整合。
附图说明
27.图1为本发明乙酰胆碱酯酶检测示意图；
28.图2为不同浓度乙酰胆碱酯酶的酶含量的拉曼光谱图；
29.图3为不同浓度乙酰胆碱酯酶的酶含量与拉曼特征峰强度比值的标准曲线图；
30.图4为五组神经切片组织检测结果图。
具体实施方式
31.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
32.实施例1制备sers基底
33.1、基于光纤的sers基底制作
34.取一长4厘米芯径150微米的石英光纤，用无水乙醇清洗三次，干燥后得到表面洁净的石英光纤。再用10％(v/v)3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡石英光纤截面的一端，再用无水乙醇清洗，干燥得到氨基化石英光纤截面。在氨基化石英光纤截面的一端上滴加直径40纳米的银纳米粒子悬浮液(1
×
108个纳米粒子/ml)，干燥后即可得到基于光纤的sers基底。
35.2、基于针灸针的sers基底制作
36.取一长3厘米直径260微米的针灸针，用无水乙醇清洗三次，干燥后得到表面洁净的针灸针。再用0.1％(v/v)3
‑
巯丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡针灸针针身；再用无水乙醇清洗，干燥得到巯基化针灸针。再在巯基化针灸针距离针尖0.5厘米处滴加金银合金纳米粒子(金核直径25纳米、银壳厚度6纳米)的悬浮液(0.1
×
108个纳米粒子/ml)，干燥后得到基于针灸针的sers基底。
37.3、基于毛细管的sers基底制作
38.取一长6厘米内径300微米的毛细管，用无水乙醇清洗三次，干燥后得到表面洁净的毛细管。再用10％(v/v)3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡毛细管；再用无水乙醇清洗，干燥得到氨基化毛细管；将氨基化的毛细管插入金纳米壳(二氧化硅核直径110纳米、金壳厚度30纳米)的悬浮液(1
×
108个纳米粒子/ml)，由于毛细现象，金纳米壳悬浮液会进入毛细
管。取出毛细管，干燥后可得基于毛细管的sers基底。
39.实施例2乙酰胆碱酯酶的酶含量和拉曼特征峰比值的标准曲线
40.1)将实施例1中制作的针灸针sers基底浸泡于5
×
10
‑5m的4
‑
巯基苯甲酸中，即得含有4
‑
巯基苯甲酸的sers基底作为拉曼内参分子。
41.2)将乙酰胆碱酯酶标样用0.2m的pbs缓冲液(ph为8.0)稀释成10u/ml、1u/ml、0.1u/ml、0.01u/ml、0.001u/ml、0.0001u/ml的浓度，分别取乙酰胆碱酯酶标样90μl加入等体积的3
×
10
‑3m的罗丹明b和1
×
10
‑3m的硫代乙酰胆碱的混合溶液，37℃反应温育10min，得到反应液。
42.3)将基于针灸针的sers基底浸入步骤2)的反应液中，37℃浸泡温育2min。
43.4)采集上述步骤3)中经过浸泡温育的基于针灸针的sers基底拉曼光谱，计算罗丹明b的拉曼特征峰强度和作为内标的4
‑
巯基苯甲酸拉曼特征峰强度比值，并制作乙酰胆碱酯酶的酶含量和拉曼特征峰强度比值的标准曲线，用于乙酰胆碱酯酶定量检测，结果如图2和图3。图2为不同浓度乙酰胆碱酯酶的酶含量的拉曼光谱图，由图2可知，619cm
‑1是罗丹明b的特征峰，1078cm
‑1是4
‑
巯基苯甲酸的特征峰。图3为不同浓度乙酰胆碱酯酶的酶含量与拉曼特征峰强度比值的标准曲线图，由图2中中已知罗丹明b的特征峰强度和4
‑
巯基苯甲酸的特征峰强度，计算可得图3的曲线为y＝
‑
0.246x+0.126。
44.实施例3血液中乙酰胆碱酯酶含量的检测
45.1)按照实施例1的步骤流程制备基于针灸针的sers基底。
46.2)将5
×
10
‑5m的4
‑
巯基苯甲酸固定到上述步骤1)制备的sers基底上，作为拉曼内参分子。
47.3)在50μl兔子静脉血液中加入等体积的3
×
10
‑3m的罗丹明b和1
×
10
‑3m的硫代乙酰胆碱的混合溶液，37℃反应温育5min，得到反应液。
48.4)将基于针灸针的sers基底浸入上述步骤3)的反应液中，37℃浸泡温育5min。
49.5)采集上述步骤4)中经过浸泡温育的基于针灸针的sers基底拉曼光谱，计算罗丹明b的拉曼特征峰强度和作为内标的4
‑
巯基苯甲酸拉曼特征峰强度比值，比值为0.37，在实施例2中得到的曲线上即可检测血液中乙酰胆碱酯酶含量为102mu/ml。图1为本发明乙酰胆碱酯酶检测示意图。
50.实施例4神经切片中乙酰胆碱酯酶含量的检测
51.1)按照实施例1的步骤流程制备基于针灸针的sers基底。
52.2)将5
×
10
‑5m的4
‑
巯基苯甲酸固定到上述步骤1)制备的sers基底上，作为拉曼内参分子。
53.3)分别在50μl兔子的脊神经前跟切片提取液和脊神经后跟切片提取液中加入等体积的3
×
10
‑3m的罗丹明b和1
×
10
‑3m的硫代乙酰胆碱的混合溶液中，37℃反应温育10min，得到反应液。
54.4)将基于针灸针的sers基底浸入上述步骤3)的反应液滴中，37℃浸泡温育5min。
55.5)采集上述步骤4)中经过浸泡温育的基于针灸针的sers基底拉曼光谱，计算含罗丹明b的拉曼特征峰强度和作为内标的4
‑
巯基苯甲酸拉曼特征峰强度比值，在实施例2中得到的曲线上即可检测脊神经前跟切片中乙酰胆碱酯酶含量为24.5
±
8mu/ml，脊神经后跟切片中乙酰胆碱酯酶含量为33
±
10mu/ml,检测结果见图4。
56.实施例5血清中乙酰胆碱酯酶含量的检测
57.1)按照实施例1的步骤流程制备基于针灸针的sers基底。
58.2)将1
×
10
‑9m的4
‑
巯基苯胺固定到上述步骤1)制备的sers基底上，作为拉曼内参分子。
59.3)在50μl兔血清中加入等体积的1
×
10
‑9m尼罗兰a和0.5
×
10
‑5m硫代乙酰胆碱，37℃反应温育10min，得到反应液。
60.4)将基于针灸针的sers基底浸入上述步骤3)的反应液中，37℃浸泡温育5min。
61.5)采集上述步骤4)中经过浸泡温育的基于针灸针的sers基底拉曼光谱，计算罗丹明b的拉曼特征峰强度和作为内标的4
‑
巯基苯甲酸拉曼特征峰强度比值，比值为0.17，在实施例2中得到的曲线上即可检测血液中乙酰胆碱酯酶含量为911mu/ml。
62.实施例6唾液中乙酰胆碱酯酶含量的检测
63.1)按照实施例1的步骤流程制备基于针灸针的sers基底。
64.2)将1
×
10
‑3m的4
‑
巯基苯酚固定到上述步骤1)制备的sers基底上，作为拉曼内参分子。
65.3)在50μl唾液中加入等体积的1
×
10
‑5m亚甲基蓝和5
×
10
‑3m硫代乙酰胆碱，37℃反应温育2min，得到反应液。
66.4)将基于针灸针的sers基底浸入上述步骤3)的反应液中，37℃浸泡温育1min。
67.5)采集上述步骤4)中经过浸泡温育的基于针灸针的sers基底拉曼光谱，计算罗丹明b的拉曼特征峰强度和作为内标的4
‑
巯基苯甲酸拉曼特征峰强度比值，比值为0.63，在实施例2中得到的曲线上即可检测血液中乙酰胆碱酯酶含量为313mu/ml。
68.对比例1
69.用传统ellman法测ache活性：用ph为8.0浓度为0.2m的pbs缓冲液稀释乙酰胆碱酯酶3ml，加入100μl终浓度为1
×
10
‑3m硫代乙酰胆碱溶液和100μl终浓度为1
×
10
‑3m 5,5
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)溶液，37℃温育20min，分光光度计测定412nm的消光值。
70.本发明方法测ache活性：用ph为8.0浓度为0.2m的pbs缓冲液稀释乙酰胆碱酯酶0.08ml，加入10μl终浓度为1
×
10
‑3m硫代乙酰胆碱溶液和10μl终浓度为1
×
10
‑3m5,5
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)溶液，37℃温育5min，浸入用5
×
10
‑5m的4
‑
巯基苯甲酸固定的基于针灸针的sers基底，37℃浸泡温育5min，拉曼光谱仪测定经过浸泡温育的基于针灸针的sers基底光谱。
71.上述ellman法ache检测范围是0.05
‑
50u/ml,本发明的检测范围是0.001
‑
10u/ml；ellman法需要的乙酰胆碱酯酶的量是本发明的30倍，即使使用微量比色皿测定，乙酰胆碱酯酶的用量也是本发明的10倍，时间是本发明的2倍以上。