以金纳米簇作为荧光探针检测马兜铃酸i的方法
技术领域
1.本发明涉及纳米材料应用技术领域。更具体地说，本发明涉及以金纳米簇作为荧光探针检测马兜铃酸i的方法。
背景技术：2.马兜铃酸，在结构上属于硝基菲酸类化合物，其广泛存在于马兜铃和细辛等马兜铃科植物中，这些植物曾广泛的作为原生药材入药。后经研究表明马兜铃酸可导致严重的肾损伤，甚至是引起癌症的发生。马兜铃酸类化合物中，主要的毒性成分为马兜铃酸ⅰ和马兜铃酸ⅱ，其中马兜铃酸ⅰ是马兜铃属植物中毒性最强的成分。目前，应用于马兜铃酸i检测的方法主要有薄层色谱(tlc)、高效液相色谱和紫外检测(hplc
‑
uv)、高效液相色谱质谱(hplc
‑
ms)、毛细管电泳与电化学检测(ce
‑
ecd)等方法，这些检测技术往往涉及大型且昂贵的检测设备，需要配备专业的人员进行操作，原料预处理步骤复杂，分析测试周期长，且多用于检测中药材及其制剂中的马兜铃酸i，在生物样本中马兜铃酸i检测的应用较少。用于马兜铃酸i检测方法还包括荧光检测法，荧光检测法具有操作方便，输出数据快速的优势，可用于多种毒性成分的定性和定量分析。但马兜铃酸i其本身并不具备荧光效应，通常在进行荧光检测前需要将马兜铃酸i进行一定的衍生化处理，利用其衍生物的荧光效应进行荧光检测。因此，如何结合荧光检测的优势，以实现马兜铃酸i的进一步快速、准确检测是发展马兜铃酸i检测技术的一个重点。
3.如今，纳米技术的发展引起各学科研究者们的关注，金属纳米簇是一种具有荧光特性的纳米级粒子，其具有较高的选择性、准确性和灵敏度，能够进行快速、实时检测、定量检测等优点。金纳米簇作为一类具有独特光学性质的新型纳米材料，近年来备受研究者的青睐，金纳米簇具有荧光强、无毒、水溶性好及较好的生物相容性等特点，目前主要用于生物小分子检测、酶活性检测、生物成像以及疾病诊断与治疗中。而以牛血清白蛋白为模板制备的金纳米簇拥有很好的稳定性、高荧光特性、优良的催化活性，牛血清白蛋白在金纳米簇的制备过程中充当的角色是稳定剂和还原剂，其合成条件简单、绿色温和，量子产率高，蛋白质的结构也提高了金纳米簇的稳定性。又马兜铃酸i能够使牛血清白蛋白发生荧光猝灭，因此本发明以牛血清白蛋白为生物模板合成具强烈荧光的金纳米簇，将金纳米簇作为荧光探针应用于生物样本中马兜铃酸i的荧光检测。
技术实现要素：4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，提供了以金纳米簇作为荧光探针检测马兜铃酸i的方法，该方法可用于检测生物样本中的马兜铃酸i，旨在解决现有检测马兜铃酸i的方法耗时长、检测步骤复杂的问题。
5.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了以金纳米簇作为荧光探针检测马兜铃酸i的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
6.以牛血清白蛋白作为生物模板制备金纳米簇溶液；
7.配制不同浓度的马兜铃酸i标准工作溶液；
8.针对每一浓度的马兜铃酸i标准工作溶液，取金纳米簇溶液，分别检测金纳米簇溶液加入该浓度的马兜铃酸i标准工作溶液前和加入后的荧光光谱，并根据荧光光谱计算金纳米簇的荧光淬灭程度；
9.根据不同浓度马兜铃酸i标准工作溶液引起的金纳米簇的不同荧光淬灭程度建立马兜铃酸i标准工作溶液浓度和金纳米簇的荧光淬灭程度的线性关系式；
10.取金纳米簇溶液，分别检测其加入待测溶液前和加入后的荧光光谱，并根据荧光光谱计算金纳米簇的荧光淬灭程度；
11.根据马兜铃酸i标准工作溶液浓度和金纳米簇的荧光淬灭程度的线性关系式及待测溶液引起的金纳米簇的荧光淬灭程度计算得到待测溶液的马兜铃酸i浓度。
12.优选的是，所述以牛血清白蛋白作为生物模板制备金纳米簇溶液是将牛血清白蛋白溶液和氯金酸溶液按体积比1:1混合均匀，然后逐滴加入氢氧化钠溶液调节混合溶液ph值至11.0
‑
12.0，最后在37℃
‑
40℃恒温温度下避光反应10h
‑
14h制得金纳米簇溶液。
13.优选的是，所述牛血清白蛋白溶液的浓度范围为5
‑
100mg/ml，所述氯金酸溶液的浓度范围为40
‑
100mmol/l，所述氢氧化钠溶液的浓度范围为0.5
‑
2mol/l。
14.优选的是，所述制得的金纳米簇的平均粒径为5nm
‑
8nm。
15.优选的是，所述金纳米簇溶液与各浓度马兜铃酸i标准工作溶液均按体积比1:1混合。
16.优选的是，所述马兜铃酸i标准工作溶液中加入金纳米簇溶液后还需再加入缓冲溶液，所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液或tris
‑
hcl缓冲溶液或超纯水，所述缓冲溶液的ph值为7.0
‑
7.4。
17.优选的是，所述马兜铃酸i标准工作溶液中加入金纳米簇溶液后再加入缓冲溶液进行混合反应步骤中，混合反应温度为37℃
‑
40℃。
18.优选的是，所述荧光检测采用荧光分光光度计进行检测，荧光检测条件为激发波长为328nm时，检测660nm发射峰值处荧光值。
19.优选的是，所述待测溶液中加入金纳米簇溶液后还需再加入缓冲溶液进行混合反应，其中，缓冲溶液为ph＝7.4的pbs缓冲溶液，混合反应温度为37℃。
20.优选的是，所述的以金纳米簇作为荧光探针检测马兜铃酸i的方法应用范围包括大鼠尿液样本中马兜铃酸i的检测。
21.本发明至少包括以下有益效果：
22.本发明以牛血清白蛋白作为稳定剂和还原剂成功制备了具有强烈荧光的金纳米簇，制备方法过程简单，易操作，成本低。当向所制备的金纳米簇溶液中加入马兜铃酸i时，牛血清白蛋白的构象会发生改变，进而导致整个团簇状结构被破坏，使其荧光强度降低，即马兜铃酸i能够使金纳米簇的荧光淬灭，金纳米簇对马兜铃酸i具有特异的选择性和高敏感性，利用这一性质，将金纳米簇应用于大鼠尿液中马兜铃酸i的检测，检测过程无需任何的衍生化，操作简便、检测结果灵敏度强、准确度高，检测范围宽，无需借助其他精密贵重仪器，整个检测过程耗时短，易于推广。
23.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
24.图1为实施例1所制的金纳米簇的荧光光谱图。
25.图2为实施例1所制的金纳米簇和牛血清白蛋白的紫外—可见吸收光谱图。
26.图3为实施例1所制的金纳米簇和牛血清白蛋白的红外光谱图。
27.图4为实施例1所制的金纳米簇的透射电镜图。
28.图5为实施例1所制的金纳米簇在不同溶剂体系、溶剂ph值、检测温度、孵育时间条件下应用于检测马兜铃酸i的结果图。
29.图6为实施例1所制的金纳米簇应用于检测马兜铃酸i的荧光光谱图。
30.图7为实施例1所制的金纳米簇应用于检测马兜铃酸i的线性关系图。
31.图8为金纳米簇对马兜铃酸i识别的抗干扰性能。
32.图9为马兜铃酸i与牛血清白蛋白相互作用的分子对接结果图。
具体实施方式
33.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
34.实施例1：
35.金纳米簇的制备方法
36.首先，将体积比为3:1的盐酸溶液与硝酸溶液配制成王水，将实验过程中需要使用的所有玻璃器皿置于新配置的王水中浸泡过夜，然后依次使用无水乙醇、超纯水冲洗干净后烘干备用。将1.0g haucl4·
4h2o溶解在50ml超纯水中，得到50mmol/l的haucl4溶液。
37.其次，在三颈烧瓶中分别加入5ml的10mmol/lhaucl4溶液、5ml的50mg/ml牛血清白蛋白溶液，于37℃水浴加热条件下磁力搅拌混合均匀。经剧烈反应2min后，在体系中加入0.5ml1mol/lnaoh溶液，调整混合溶液ph值为11.0，继续在37℃水浴中反应12h。反应过程中溶液的颜色由淡黄色变为浅棕色，然后变成深棕色，反应结束后将所得金纳米簇溶液密封储存在4℃冰箱。
38.由上述步骤得到的金纳米簇溶液在日光灯下呈棕色，在365nm紫外手电筒照射下发射明亮的红色荧光，其最大激发波长在328nm，最大发射波长为660nm，如图1所示。图2为牛血清白蛋白和金纳米簇的紫光—可见吸收光谱图，说明制备的金纳米簇未表现出类似大尺寸金纳米粒子的表面等离子体共振性质。图3为牛血清白蛋白和加入马兜铃酸i前、后所制的金纳米簇的红外光谱图，图中牛血清白蛋白在3280.46cm
‑1、1657.09cm
‑1、1533.78cm
‑1和2961.16cm
‑1处的特征吸收带分别代表其主链肽键中存在酰胺a、酰胺i、酰胺ii和c
‑
h振动；合成金纳米簇后，酰胺a、酰胺i、酰胺ii和c
‑
h振动分别体现为3297.08cm
‑1、1654.99cm
‑1、1538.09cm
‑1和2961.58cm
‑1这几个红外特征峰；当加入马兜铃酸i后，bsa
‑
auncs酰胺i、酰胺ii的吸收强度有所下降，同时在3549.69cm
‑1、3472.78cm
‑1和3416.69cm
‑1处出现了新的红外吸收峰。图4为金纳米簇的透射电镜图，图中可以看出金纳米簇在水溶液中呈球形，具有良好的单分散性能，对合成的金纳米簇的粒径通过动态光散射仪进行初步分析，得到的结果如图4的内插图所示，其平均粒径为7nm。
39.实施例2：
40.应用金纳米簇检测马兜铃酸i的方法
41.1、最佳检测条件的优化
42.为了让合成的金纳米簇对检测马兜铃酸i有最佳响应，对实验溶剂体系、溶液体系的ph值、实验温度、金纳米簇与马兜铃酸i的共孵育时间等因素进行了优化。实验中选取的溶剂有pbs缓冲盐溶液、tris
‑
hcl缓冲盐溶液和超纯水；设置的溶剂体系的ph范围为5.5
‑
9.0；设置的实验温度为4℃，15℃，25℃，37℃和50℃；设置的金纳米簇与马兜铃酸i的共孵育时间为0min，5min，10min，15min，20min，30min，40min和50min。
43.将400μl等浓度的马兜铃酸i标准工作溶液(10.0μg/ml)、400μl的bsa
‑
auncs溶液按照设定的条件混匀后，在bsa
‑
auncs最大激发波长处，采集所配制溶液在最大发射波长处的荧光光谱。如图5a所示，在5.5
‑
9.0的ph范围内，bsa
‑
auncs的荧光强度变化不明显，说明得到的bsa
‑
auncs溶液在酸性、中性和弱碱性溶液环境中可保持稳定，有潜力成为荧光检测探针应用于生物体液样本中。由图5可知，最后确定利用bsa
‑
auncs构建荧光探针检测马兜铃酸i的优选条件为：使用ph＝7.4的pbs缓冲盐溶液作为溶剂体系，实验温度为37℃，当将实验所需的马兜铃酸i标准工作溶液加入bsa
‑
auncs溶液混合均匀后，即刻用荧光分光光度计进行检测。
44.(1)标准溶液的制备：
45.称量12.8mg马兜铃酸i，用甲醇溶解并定容至刻度线，配制成马兜铃酸i标准储备溶液并储存于4℃冰箱，使用时用甲醇稀释成不同浓度的工作溶液，马兜铃酸i标准工作溶液的浓度为0.1
‑
12.8μg/ml。
46.(2)荧光光谱检测：
47.取400μl的马兜铃酸i标准工作溶液、400μl的bsa
‑
auncs溶液置于四通荧光比色皿中混合均匀后加入pbs缓冲溶液稀释，使溶液体系的终体积达到4ml，将不同浓度的马兜铃酸i标准工作溶液按上述步骤分别配置成样品溶液，并分别在37℃下将样品溶液混合均匀后立即上机检测，在328nm激发波长处采集各样品溶液在500
‑
800nm范围内的荧光发射光谱，并记录加入马兜铃酸i标准工作溶液前、后bsa
‑
auncs在最大发射波长660nm处的荧光值，同时计算在加入马兜铃酸i标准工作溶液后对bsa
‑
auncs荧光淬灭程度。根据加入的马兜铃酸i标准工作溶液浓度和bsa
‑
auncs的荧光淬灭程度建立函数关系，计算标准曲线方程。
48.(3)线性关系、检测限的确定：
49.加入马兜铃酸i标准工作溶液前、后金纳米簇的荧光强度分别记为f0、f，荧光光谱图及绘制标准曲线如图6及图7所示，该标准曲线为f0‑
f/f0＝0.02194c
aai
+0.02848，r2为0.9909，线性范围为0.1
‑
12.8μg/ml，定量限为0.08μg/ml。
50.2、大鼠尿液中马兜铃酸i含量的检测
51.(1)样品预处理：
52.动物购回后进行持续7天的适应性喂养，将动物房的温度维持在23
±
2℃，相对湿度为50％，并采用12h昼夜节律(8:00
‑
20:00)，大鼠可以自由饮水和进食。采集样本前将所有大鼠置于代谢笼中，空腹12h后收集尿液，收集尿液样本期间大鼠可以自由取水。尿液样本收集完毕后立即低温离心以除去尿液样本中的蛋白质，转速为12000rpm，离心30分钟，取离心后的上清液通过0.22μm有机滤膜过滤，制得大鼠空白尿液样本。
53.(2)荧光光谱检测：
54.取三份大鼠空白尿液样品，分别向大鼠尿液样品中加入标准添加马兜铃酸i的浓度为0.4μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml；取400μl上述添加浓度为0.4μg/ml的马兜铃酸i的大鼠尿液样本、400μl的bsa
‑
auncs溶液置于四通荧光比色皿中混合均匀后加入pbs缓冲溶液稀释，使溶液体系的终体积达到4ml；添加浓度为3.2μg/ml、12.8μg/ml的马兜铃酸i的大鼠尿液样本同上述步骤分别配置成样品溶液；将上述配置的三种样品溶液分别在37℃下将溶液混合均匀后立即上机检测，在328nm激发波长处采集样品溶液在500
‑
800nm范围内的荧光发射光谱，记录加入含马兜铃酸i尿液样本前、后bsa
‑
auncs在最大发射波长660nm处的荧光吸收值。每个样品平行测定3次，将每个样品的荧光吸收值代入实施例2获得的荧光淬灭程度与马兜铃酸i浓度的线性关系式中，计算出每个样品的实际测量浓度，并进一步计算回收率及标准偏差，结果见表1，实验结果显示回收率在96.1％
‑
120.9％之间。使用hplc法检测的结果为，在设定的三个马兜铃酸i检测浓度下，加标回收率为104.9
‑
130.2％，且相对标准偏差rsd为5.6％。bsa
‑
auncs荧光测定法与hplc测定法相比，所花的检测时长更短，从数据结果来看bsa
‑
auncs测定法得到的加标回收率结果令人满意，说明本方法可用于检测实际尿液样品中的马兜铃酸i含量，在生物医学和临床检测中有着很大的应用潜力。
55.表2.4大鼠尿液样本中aai的检测
[0056][0057]
实施例3：
[0058]
方法的特异性
[0059]
实验选取干扰物质zn
2+
、ca
2+
、fe
3+
、pb
2+
、mg
2+
、k
+
、na
+
、so
42
‑
、cl
‑
、天冬酰胺、葡萄糖、谷氨酸和尿酸作为对比。
[0060]
取400μl的干扰物质分别加入到400μl bsa
‑
auncs溶液中，用ph＝7.4的pbs缓冲盐溶液稀释到4ml，充分反应后按照优化好的实验条件上机检测，测定加入干扰物质前、后bsa
‑
auncs的荧光值，并计算bsa
‑
auncs的荧光淬灭程度。
[0061]
实验考察了常见金属离子以及氨基酸对检测的影响。如图8所示，实验结果显示它们不会影响对于马兜铃酸i的检测。
[0062]
实施例4：
[0063]
马兜铃酸i对淬灭bsa
‑
auncs荧光的机理分析
[0064]
首先，利用分析软件sybyl
‑
x 2.0软件画好马兜铃酸i的化学结构，并将其保存为“mol2”格式的文件。然后，从rcsb蛋白数据库中下载bsa的晶体结构(pdb id:3v03)(http://www.rcsb.org/structure/3v03)，利用sybyl
‑
x 2.0对蛋白质结构进行补充氢原子，去除蛋白结构侧链和水分子等处理，优化残基的质子化状态和将蛋白质能量最小化，完成后运行surflex
‑
dock模式进行对接。待程序运行结束后，基于pymol软件中晶体结构的分
子构象对分子对接分析得到的分子构象进行优化修饰。如图9所示，马兜铃酸i中的羧基和甲氧基基团与lys
‑
132、asp37、tyr139和phe36的nh2基团形成氢键。这样的结合使得马兜铃酸i进入了蛋白质的疏水空腔结构，从而增大了bsa
‑
auncs的体积，诱导金簇之间的相互聚集，从而表现出对bsa
‑
auncs荧光的淬灭效应。
[0065]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。