DVL2蛋白在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用的制作方法

dvl2蛋白在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及dvl2蛋白在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用，属于分子生物学和医学技术领域。


背景技术：

2.心肌细胞肥大是临床多种心血管疾病所伴有的病理改变，是心脏对生物机械牵张和神经体液刺激的一种主要反应。虽然早期心肌肥大是心脏维持有效心输出量的一种代偿性机制，但持久的心肌肥大会导致心脏进入失代偿阶段，胎儿期基因(心肌细胞重塑标志基因)anp，bnp和β-mhc等重新表达，继而发生不可逆转的心肌肥大和扩张，心肌收缩力下降，导致心力衰竭。
3.dvl蛋白(包括dvl1、dvl2和dvl3)在进化上高度保守，并参与经典wnt信号通路和非经典wnt通路的调控。许多研究报道了dvl蛋白与多种癌症的不良预后相关，但dvl蛋白对心力衰竭疾病的作用尚不明确。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供dvl2蛋白在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
6.dvl2在筛选用于预防和/或治疗心力衰竭疾病的药物靶点的用途。
7.dvl2作为预防和/或治疗心力衰竭疾病治疗靶点或作为心力衰竭疾病诊断靶点的用途。
8.进一步的，所述心力衰竭疾病为压力过负荷所导致的心力衰竭疾病。
9.一种dvl2的抑制剂在制备预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的用途。
10.进一步的，所述dvl2的抑制剂为dvl2小干扰rna。
11.一种携带dvl2小干扰rna的腺相关病毒在预防和/或治疗心力衰竭疾病中的用途。
12.进一步的，所述携带dvl2小干扰rna的腺相关病毒中，所述腺相关病毒的载体为具有心肌特异启动子启动的腺相关病毒载体。
13.进一步的，所述腺相关病毒的载体为aav9载体。
14.进一步的，所述携带dvl2小干扰rna的腺相关病毒使用时采用静脉注射方式。
15.进一步的，所述dvl2小干扰rna的核苷酸序列如seq no.1所示。
16.有益效果
17.通过心衰心脏组织中dvl2的表达水平与心肌细胞重塑标志基因表达水平的相关性试验，证实了dvl2的表达水平在心衰心脏组织样本中明显高于正常心脏组织，即dvl2的表达与心衰程度呈正相关。在此基础上，dvl2可作为用于筛选预防和/或治疗心力衰竭疾病的药物靶点；且dvl2可作为预防和/或治疗心力衰竭疾病治疗靶点或作为心力衰竭疾病诊断靶点。
18.进一步的，可将dvl2的抑制剂作为预防和/或治疗心力衰竭疾病药物。在此基础上，可将dvl2小干扰rna作为dvl2的抑制剂。
19.进一步的，通过腺相关病毒包装dvl2小干扰rna尾静脉注射试验，可缓解主动脉缩窄手术(tac)导致的心脏指标变化，说明dvl2小干扰rna体外给药能够缓解tac导致的心肌肥大，预防心衰的发生。
附图说明
20.图1为实施例1中正常和心衰心脏组织中dvl2的蛋白水平分析(n＝5for each group)。
21.图2为实施例1中正常和心衰心脏组织中dvl1和dvl3的蛋白水平分析(n＝5for each group)。
22.图3为实施例1中正常和心衰心脏组织的dvl2蛋白的免疫化学染色分析。
23.图4为实施例1中正常和心衰心肌重塑标志基因表达结果。
24.图5为实施例1中心衰心脏组织dvl2蛋白表达水平与心肌重塑标志基因(anp和bnp)表达水平的相关性分析。
25.图6为实施例2中小鼠tac后dvl2的免疫化学染色分析。
26.图7为实施例2中假手术组和tac小鼠中心肌重塑标志基因表达结果。
27.图8为实施例3中转染dvl2小干扰rna后小鼠心肌细胞中dvl2的蛋白水平分析。
28.图9为实施例4中小鼠tac 4周以后心脏外观的代表图。
29.图10为实施例4中小鼠tac 4周以后心脏重量指数变化。
30.图11为实施例4中小鼠tac 4周以后射血分数的变化。
31.图12为实施例4中小鼠tac 4周以后左室短轴缩短率的变化。
具体实施方式
32.以下的实验例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实验例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买所得。以下实验例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
33.实施例1心衰病人心脏组织中dvl2的表达水平与心肌重塑标志基因表达水平的相关性
34.1、临床心衰病人的收集标准
35.正常对照心脏(healthy)来自车祸意外死亡人员，心衰心脏(heart fallure)样本来自于进行心脏移植的心力衰竭患者(左室射血分数低于40％)，以上样本均来自于北京安贞医院。
36.2、心脏组织中dvl1/dvl2/dvl3蛋白提取及检测
37.剪取20mg心脏组织称重，放入1.5ml ep管中；加入600ul蛋白裂解液(50mm tris,ph 7.5,250mm nacl,0.1％sodium dodecyl sulfate,2mm dithiothreitol,0.5％np-40,1mm pmsf，1mm protease inhibitor cocktail)，剪碎，冰浴中超声匀浆(每次2-3s，重复3-4次)；12000g，4℃，离心15min，取上清于新ep管中；加入1/5体积的5
×
上样缓冲液，用移液
器吹打充分混匀，100℃煮沸10min，变性；利用蛋白免疫印迹法(western blot,wb)检测dvl1/dvl2/dvl3表达。
38.dvl2的表达结果如图1所示，结果显示心脏组织dvl2蛋白表达图和量化结果，表明dvl2在人的心衰心脏组织样本中的表达水平明显高于正常心脏组织。
39.dvl1和dvl3的表达结果如图2所示，结果显示心脏组织dvl1和dvl3的蛋白表达图和量化结果，表明dvl1和dvl3在人的心衰心脏组织样本中的表达水平与正常人的心脏组织中的表达没有差异。
40.3、免疫组化染色
41.剪取心脏组织用多聚甲醛固定1天，20％的乙二胺四乙酸(edta)脱钙液脱钙3天(4℃摇床)，蔗糖脱水，包埋剂包埋、切片，烤片1-2小时，磷酸缓冲盐溶液(pbs)小心洗片，将pbs滴加到切片上，用吸水纸将水吸走，抗原修复，山羊血清封闭1小时，一抗孵育过夜，pbs洗3遍，二抗室温1小时，pbs洗3遍，dab显色。
42.免疫组织化学分析如图3所示，结果表明，dvl2在心衰心脏组织中表达量显著升高。
43.4、实时定量pcr检测细胞中心肌重塑标志基因的表达
44.(1)组织rna的提取
45.剪取心脏组织加入含1ml trizol试剂的1.5ml ep管中；用电动匀浆仪将组织充分匀浆，室温静置5min后；加入1/5trizol体积的氯仿，剧烈振荡ep管15s，室温静置2min；12000g，4℃，离心15min，取上层水相置于一新的ep管中；加入等体积(0.5ml)异丙醇，轻微振荡15s，室温静置10min；12000g，4℃，离心10min，弃上清留沉淀；加入1ml 75％的乙醇，上下颠倒ep管数次，7500g，4℃，离心5min，弃上清；室温晾5-10min至半干，加入适量灭菌depc水使rna溶解；取1μl溶解好的rna，利用超微量紫外分光光度计(q5000)进行浓度测定及质量检测；置于-80℃保存备用。
46.(2)rna的反转录反应
47.使用takara公司rt kit
48.具体方法如下：
49.反转录反应如下：
[0050][0051]
混匀，37℃反应15min；85℃，5s，放置冰上；将得到的10μl反转录反应后的cdna稀释20倍，到200μl，-20度保存以备下一步实时定量pcr检测。
[0052]
(3)实时定量pcr检测
[0053]
使用takara公司sybr进行实时定量pcr检测。
[0054]
具体步骤如下：
[0055]
pcr反应体系如下：
[0056][0057]
混匀，realtime pcr反应程序如下：
[0058]
预变性：95℃，15min；
[0059]
变性：94℃，15sec；
[0060]
退火：60℃，30sec；
[0061]
延伸：72℃，30sec；共40次循环；
[0062]
反应结束后得到pcr熔解曲线，根据溶解曲线均一性判断产物纯度。其中，实时定量pcr检测中心肌重塑标志基因的引物序列如表1所示：
[0063]
表1
[0064]
gapdh-fseq no.2：5
’‑
tcaccaccatggagaaggc-3’gapdh-rseq no.3：5
’‑
gctaagcagttggtggtgca-3’anp-fseq no.4：5
’‑
ttcgggggtaggattgacag-3’anp-rseq no.5：5
’‑
cacaccacaagggcttagga-3’bnp-fseq no.6：5
’‑
tgtttctgcttttcctttatctg-3’bnp-rseq no.7：5
’‑
tctttttgggtgttcttttgtga-3’β-mhc-fseq no.8：5
’‑
cctcagcagaggagtacagc-3’β-mhc-rseq no.9：5
’‑
ggctgagccttggattctca-3’[0065]
心肌重塑标志基因的表达结果如图4所示，结果表明，心衰后心肌重塑标志基因anp、bnp和β-mhc表达均显著升高。
[0066]
心衰心脏组织中dvl2表达水平与心肌重塑标志基因anp和bnp表达水平的相关性分析结果如图5所示，结果表明，心衰心脏组织样本中dvl2的表达升高则心肌重塑标志基因anp和bnp表达随之升高，说明dvl2的表达与心脏组织心肌重塑标志基因的表达呈正相关。
[0067]
实施例2 dvl2在tac致心肌肥大模型小鼠心脏中表达变化
[0068]
1、小鼠tac手术建立病理性心肌肥大模型
[0069]
c57bl/6小鼠(野生型(wt)小鼠)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，spf级。
[0070]
6-8周龄雄性c57bl/6小鼠，麻醉后暴露气管，对小鼠进行气管插管，接呼吸机控制呼吸，呼吸参数：潮气量以肺部扩张为准9-11ml，呼吸比：1:1，频率：90-100开胸，小鼠仰卧位固定于操作台恒温垫(30℃)，清洁手术区域，双目体视显微镜下操作，取胸前正中切开皮
肤，上至胸骨上窝，下至第二肋骨水平。用牵引器拉开纵隔4～6mm宽，用无齿显微镊分离胸腺暴露主动脉弓，用5号丝线在右颈总动脉和左颈总动脉分出中间处，用25～27g垫扎针头(直径1.2～1.6mm)垫扎(造成60％左右狭窄)，对主动脉及垫扎针进行结扎，结扎确实后抽出垫扎针，检查主动脉弓近心端波动增强，逐层关胸，缝皮。手术切口处用红霉素眼膏涂敷并皮下注射0.5ml生理盐水，待小鼠自主呼吸恢复后脱机拔管，移至加热垫继续观察至苏醒。假手术组(sham)开胸但不进行主动脉弓结扎。
[0071]
2、免疫组化染色
[0072]
取小鼠心脏组织进行免疫组化染色，实验操作同实施例1。
[0073]
免疫组织化学分析如图6所示，结果表明dvl2蛋白在小鼠心肌肥大模型后显著升高。
[0074]
3、实时定量pcr检测细胞中心肌重塑标志基因的表达
[0075]
取小鼠心脏进行实时定量pcr检测，其中，中心肌重塑标志基因的引物序列如表2所示，其余实验操作同实施例1。
[0076]
表2
[0077]
gapdh-fseq no.10：5
’‑
tcaccaccatggagaaggc-3’gapdh-rseq no.11：5
’‑
gctaagcagttggtggtgca-3’anp-fseq no.12：5
’‑
ttcgggggtaggattgacag-3’anp-rseq no.13：5
’‑
cacaccacaagggcttagga-3’bnp-fseq no.14：5
’‑
tgtttctgcttttcctttatctg-3’bnp-rseq no.15：5
’‑
tctttttgggtgttcttttgtga-3’β-mhc-fseq no.6：5
’‑
cctcagcagaggagtacagc-3’β-mhc-rseq no.17：5
’‑
ggctgagccttggattctca-3’[0078]
心肌重塑标志基因的表达结果如图7所示，结果表明，心衰后心肌重塑标志基因anp、bnp和β-mhc表达均显著升高。
[0079]
实施例3 dvl2小干扰rna(sirna)的设计
[0080]
设计dvl2小干扰rna序列，其核苷酸序列为seq no.1：5
’‑
tccacaatgtctctcaaca-3’。委托吉玛基因进行合成。
[0081]
利用rnaimax将所述sirna转染入hl-1小鼠心肌细胞系中，然后用western blot对dvl2蛋白进行检测，如图8所示，结果表明，转染dvl2小干扰rna后，小鼠心肌细胞中dvl2蛋白水平显著下降。
[0082]
实验例4针对dvl2靶点的基因沉默对小鼠tac后心脏功能和结构的影响
[0083]
1、tac小鼠dvl2小干扰rna尾静脉注射
[0084]
(1)小干扰rna病毒载体构建
[0085]
将dvl2小干扰rna克隆至具有心肌特异启动子启动的腺相关病毒载体aav9中，构建小干扰rna病毒aav9-ctctnt-shdvl2。病毒构建及包装纯化由汉恒生物完成。
[0086]
(2)尾静脉给药
[0087]
对wt小鼠进行tac手术，实验操作同实施例2，一周后尾静脉注射dvl2小干扰rna病毒(1*10
11
vg/只)，三周后进行心脏超声分析。
[0088]
2、超声分析小鼠心脏功能
[0089]
将小鼠在小动物麻醉机容器内麻醉(2％(体积分数)异氟烷混合0.5l/min的氧气)；麻醉后，利用脱毛剂对小鼠胸部脱毛；小鼠置于内嵌心电监护的保温台，并在四肢涂抹电极胶；利用vevo公司随机配置的770b 30mhz的超声探头进行小鼠心脏功能测试，利用b-model中二维图像从小鼠心脏短轴获取图像，利用系统自带软件获取超声心动图心功能观察指标：室间隔收缩末期厚度(systolic interventricular septal thickness，ivss)；左室舒张末期后壁厚度(diastolic left ventricular posterior wall thickness，lvpwd)和左室收缩末期后壁厚度(systolic left ventricular anterior wall thickness，lvpws)；左室舒张末期内径(diastolic left ventricular internal diameter，lvidd)和左室收缩末期内径(systolic left ventricular internal diameter，lvids)；左室舒张末期容积(diastolic left ventricular volume，lv vold)和左室收缩末期容积(systolic left ventricular internal volume，lv vols)；根据容量公式ef＝[(lv vold－lv vols)/lv vold]
×
100％计算左室射血分数ef，根据公式fs＝[(lvidd
–
lvids)/lvidd]
×
100％计算短轴缩短率fs。
[0090]
小鼠tac 4周以后心脏外观如图9所示，小鼠tac 4周以后心脏重量指数变化如图10所示，结果表明，注射对照病毒的小鼠tac心脏体重指数显著增高，而注射dvl2小干扰rna病毒能够有效缓解以上情况。
[0091]
小鼠tac 4周以后射血分数的变化如图11所示，小鼠tac 4周以后左室短轴缩短率的变化如图12所示，结果表明，注射对照病毒的小鼠tac后出现心室射血分数ef和短轴缩短率fs显著下降，提示心脏功能下降，而注射dvl2小干扰rna病毒能够对抗tac导致的心脏功能下降。
[0092]
综上可知：1、心衰病人心脏组织中dvl2的表达水平与心肌细胞重塑标志基因表达水平的相关性试验，证实dvl2的表达水平在心衰心脏组织样本中明显高于正常心脏组织，dvl2的表达与心衰程度呈正相关。2、在小鼠主动脉缩窄手术(tac)导致心肌肥大中的作用试验，证实tac小鼠心脏组织中dvl2表达升高，tac小鼠心脏的射血分数(ef)和短轴缩短率(fs)降低，心室壁厚度、纤维化程度、胚胎基因表达水平等参数比假手术组(sham)小鼠高。3、通过腺相关病毒包装dvl2小干扰rna尾静脉注射试验，可缓解tac导致的心脏指标变化，说明dvl2小干扰rna体外给药能够缓解tac导致的心肌肥大，预防心衰的发生。
[0093]
本发明通过动物实验和对临床中心衰患者心脏组织样本的分析，得出如下结论：1、心衰病人心脏组织dvl2表达水平与心衰程度呈正相关。2、dvl2小干扰rna能够通过静脉给药的方式治疗主动脉缩窄导致的心肌肥大，并预防心衰发生。