基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统

1.本发明属于单细菌检测领域，更具体的，涉及一种基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统。


背景技术：

2.随着人们生活水平的日益提高，微生物，尤其食源性微生物对健康的影响逐渐受到重视。因此，控制食品加工环境和快速检测食品中痕量微生物污染是目前确保食品安全的有效措施。单细菌检测技术可在食源微生物繁殖早期鉴别细菌种类，为食品生产、储藏、运输等步骤提供预警信息，是提高食品安全的重要一步。
3.目前对微米级单细菌的检测，通常采取电感耦合等离子体质谱(icp
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ms)、电感耦合等离子体发射光谱(icp
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aes)和单细胞拉曼等手段。icp
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ms和icp
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aes可以对低浓度、微尺寸的单细菌进行元素分析，测量精度约为0.1％，对大多数元素的检出限可达10
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12
(ppt级)，但存在一些使用上的局限：价格昂贵；制样复杂；无法结合成像系统对特定的单细菌进行检测；供电和维护成本高等。单细胞拉曼通过采集单细胞的拉曼散射信号，推断样品的理化成分，具有无损检测、不受细胞水分干扰的优点，但拉曼散射信号及其微弱，只能检测到极少数的生物大分子。
4.激光诱导击穿光谱(libs)是一种原子发射光谱，具有样品处理简单、成本低廉的优点。现有的基于libs的单颗粒检测系统，普遍使用明场照明定位待测单颗粒。然而，明场下透明的微米级单细菌在低倍物镜下图像对比度极低，无法实现单细菌的精确定位。因此本领域迫切需要一种可精确观察并定位微米级单细菌的libs检测技术。


技术实现要素：

5.针对传统单细胞检测技术效率低、选择性差、成本高的缺点，结合现阶段食源性微生物快速检测的技术短板，发明人提供一种基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统。该系统通过暗视野显微成像技术对亚微米级单细菌进行成像和定位，利用高能量、强聚焦的脉冲激光束轰击待测单细胞并产生高温高压的等离子。通过等离子体辐射的原子发射光谱信号准确获取单细胞内部的元素信息，实现对关键元素组成的定性和定量分析。
6.为了解决上述技术问题，本发明提出的一种基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统，包括载物台、暗场照明单元、暗场显微成像单元和激光诱导击穿光谱检测单元；所述载物台包括透明薄膜和样品架，所述透明薄膜绷紧后固定在所述样品架上，所述透明薄膜作为细菌检测的载体；所述暗场照明单元包括led灯和聚光透镜；所述暗场显微成像单元包括物镜、反射镜、套筒透镜和cmos相机；所述激光诱导击穿光谱检测单元包括脉冲激光器、二向色镜、激光会聚镜、光纤和光谱仪；所述暗场显微成像单元的物镜和所述激光诱导击穿光谱检测单元的激光会聚镜是同一个聚焦透镜；
7.所述led灯发出照明光，所述聚光透镜将照明光以一定倾斜角度聚焦在所述载物
台上的待检测样品上；所述聚焦透镜对单细菌衍射光扩束，所述反射镜改变暗视野显微成像的光路走向，所述反射镜将单细菌样品的散射光反射后并通过所述套筒透镜将单颗粒物的衍射光汇聚成像于所述进入cmos相机的探测窗口，所述cmos相机采集单细菌的暗视野显微图像；与此同时，所述脉冲激光器产生的高能量纳秒脉冲经过二向色镜反射后被所述聚焦透镜聚焦于所述透明薄膜上的单细菌样品表面，瞬间气化电离并产生等离子体发光，并将激光诱导击穿光谱的脉冲激光束聚焦于待检测样品表面，气化单细菌样品并产生等离子体辐射；等离子体发光的光子由所述光纤捕获并传输给所述光谱仪，由所述光谱仪记录该单细菌的激光诱导击穿光谱，并从特征谱线解析出单细菌中的元素信息。
8.进一步讲，本发明所述的单细菌检测系统，其中：
9.所述led灯照明样品时的入射倾角应大于聚焦透镜的接收孔径半角。
10.所述透明薄膜为(但不限于)聚乙烯薄膜，所述透明薄膜的厚度小于6μm。
11.所述样品架的位置调节精度至少为1μm，且不低于单细菌的尺寸。
12.所述聚焦透镜的焦距小于20mm，数值孔径高于0.2，聚焦后光斑直径小于6μm。
13.所述脉冲激光器产生的纳秒激光脉冲宽度小于9ns，脉冲能量大于40mj。
14.所述光谱仪配置有iccd相机，光谱分辨率小于0.1nm，光谱测量范围至少覆盖300
‑
800nm波段。
15.所述二向色镜反射所述脉冲激光器发射出的1064nm激光，透射1064nm以下的单细菌散射光。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.(1)本发明采用的暗视野照明和无限远放大透镜组，能够提高单个微米级微生物细菌的成像对比度以及定位准确度；
18.(2)本发明采用的激光诱导击穿光谱，能够对单细菌样品中的多种元素组分进行同时检测，检测速度快，检测通量高；
19.(3)本发明采用成分简单的透明薄膜作为载物基底，大大降低基底干扰，提高单细菌样品元素定量检测的准确性。
附图说明
20.图1为本发明基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统的结构示意图；
21.图中：1
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led灯，2
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聚光透镜，3
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聚焦透镜，4
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反射镜，5
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套筒透镜，6
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cmos相机，7
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透明薄膜，8
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样品架，9
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脉冲激光器，10
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二向色镜，11
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光纤，12
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光谱仪。
22.图2为集成的暗视野显微成像系统记录的单芽孢样品的暗视野图像(a)和普通显微成像系统记录的同一视场下的明场图像(b)。
23.图3为本发明系统检测出的单芽孢样品的代表性激光诱导击穿光谱图。
具体实施方式
24.下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。
25.本发明提出的一种基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统，包括
载物台、暗场照明单元、暗场显微成像单元和激光诱导击穿光谱检测单元。载物台承载单细菌并精密移动单细菌至检测位置；暗场显微成像单元收集暗场照明单元提供的单细菌成像的散射光，将微米级待测单细菌以高亮形态呈现在暗视野图像中；激光诱导击穿光谱检测单元产生的高强度电场能瞬间电离单细菌样品，诱导等离子体发光，并探测等离子体发光解析待测单细菌的元素成分。本发明能够提高单个微米级微生物细菌的成像对比度以及定位准确度；能够对单个细菌中的多种元素组分进行同时检测，检测速度快，检测通量高；大大降低基底干扰，提高单细菌元素定量检测的准确性。
26.如图1所示，本发明所述的单细菌检测系统中，所述载物台包括透明薄膜7和样品架8。所述透明薄膜7作为基底材料，用于承载待检测单细菌样品，其厚度小于6μm，在libs检测时可与单细菌样品一起迅速汽化。此外，所述透明薄膜7表面应光滑平整，组成元素简单并且纯度高(比如但不限于聚乙烯薄膜)，不干扰单细菌样品的元素检测结果。所述样品架8是一个三维精密调节平台，固定所述透明薄膜7，用于支撑所述透明薄膜7并微调样品位置；所述样品架8可在三个维度精细调节位置，调节精度小于1μm且不低于单细菌尺寸，能够将待测单细菌准确移动到聚焦激光束的焦点位置。所述透明薄膜7作为细菌检测的载体绷紧后固定在所述样品架8上。
27.所述暗场照明单元包括led灯1和聚光透镜2；所述led灯1用于暗视野显微成像的照明光源；所述聚光透镜2用于会聚所述led灯1的出射光，并以大角度入射到待测单细菌表面。所述led灯1提供暗场显微成像的照明光束的入射倾角应该大于聚焦透镜3的接收孔径半角。
28.所述暗场显微成像单元包括物镜、反射镜4、套筒透镜5和cmos相机6；所述物镜为聚焦透镜3，用于对单细菌衍射光扩束；所述反射镜4用于改变暗视野显微成像的光路走向；所述套筒透镜5用于将单颗粒物的衍射光汇聚成像于cmos相机6上；所述cmos相机6用于采集单细菌的暗视野显微图像。
29.所述激光诱导击穿光谱检测单元包括脉冲激光器9、二向色镜10、激光会聚镜、光纤11和光谱仪12；所述脉冲激光器9用于产生高能量纳秒脉冲，击穿单细菌样品产生等离子体辐射，为激光诱导击穿光谱的激发光源；将待检测单细菌样品瞬间电离，并产生等离子体发光光子；所述脉冲激光器9产生1064nm的脉冲激光输出，脉冲宽度小于9ns，脉冲能量大于40mj。脉冲功率稳定度优于3％，保证了单细菌定量检测的准确度。所述二向色镜10用于分离激光诱导击穿光谱的脉冲激光束和暗视野显微成像的照明光束；所述二向色镜10反射1064nm的激光束，但允许可见光波长的照明光透过。所述二向色镜将脉冲激光器9发射的脉冲激光束反射进入聚焦透镜3中。同时，由单细菌散射的可见光可由此透过进入暗场图像采集系统。所述光纤11由7个光纤芯组成的光纤束，其接收端与石英准直透镜连接，对准聚焦透镜3的焦点，用于将等离子发光的光子耦合进入光纤11中，所述光纤11的另一端分为7根独立的光纤，分别通过sma接口与所述光谱仪12的7个通道连接。所述光纤11经由sma接口与所述光谱仪12相连接。所述光谱仪12用于记录经由所述光纤11传输进入的等离子体发光的原子发射光谱，从而解析待测单细菌中的多种元素。所述光谱仪12的谱分辨率小于0.1nm，光谱测量范围至少覆盖300
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800nm波段；所述光谱仪12包括iccd相机，用于探测等离子体发光的光子；所述iccd相机记录的原子发射光谱中包含有待测样品中所含元素的特征谱线，通过对照特征谱线的峰值位置及强度可以解析出单颗粒物中所含元素、元素含量等信息。
所述光谱仪12具有0.1nm的光谱分辨率，光谱覆盖从紫外到近红外(300
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800nm)波段，涵盖单细菌的元素信息。
30.本发明中，所述激光诱导击穿光谱检测单元的激光会聚镜和所述暗场显微成像单元的物镜是同一个聚焦透镜3，所述聚焦透镜3将脉冲激光束聚焦于单细菌样品表面，从而产生等离子发光。所述透镜同时作为暗视野显微成像的物镜，收集从单细菌样品散射的光子。所述聚焦透镜3的焦距小于20mm，数值孔径高于0.2，聚焦后光斑直径小于6μm，峰值功率密度高达10
13
w/cm2左右，确保可以完全击穿单细菌样品。所述聚焦透镜3对单细菌衍射光扩束的同时，并将激光诱导击穿光谱的脉冲激光束聚焦于待检测样品表面，气化单细菌样品并产生等离子体辐射。
31.本发明提供了一种基于暗视野显微和激光诱导击穿光谱的单细菌检测系统，该系统通过暗视野显微成像技术对亚微米待检测单细菌进行成像和定位，然后利用高能量、强聚焦的脉冲激光，将待测单细菌样品等离子化，产生高温、高密度的等离子体，由高分辨率的光谱仪记录其元素特征谱线，用于单细菌的元素检测及定性分析。
32.采用本发明系统的单细菌检测的基本步骤是：将透明薄膜7绷紧后安装在样品架8上；将待测细菌悬浮液滴落在在透明薄膜7上，采集单细菌的暗视野图像；调节样品架8的位置，将待测单细菌移入到聚焦透镜3的焦点位置；设置激光诱导击穿光谱的参数，发射激光脉冲，采集单细菌的光谱；对单细菌的激光诱导击穿光谱进行分析，解析其元素组成和丰度信息。如图1所示，所述led灯1提供暗视野显微成像的照明光源，其发出的光束经由聚光透镜2后会聚，并以大于所述聚焦透镜3的接收孔径半角的角度入射到所述载物台上的单细菌样品表面。所述聚焦透镜3对单细菌样品散射光扩束，所述反射镜4改变暗视野显微成像的光路走向，所述反射镜4将单细菌样品的散射光反射后并通过所述套筒透镜5将单细菌样品的散射光汇聚成像于所述进入cmos相机6的探测窗口，所述cmos相机6采集单细菌的暗视野显微图像，并记录单细菌暗场散射下的图像；与此同时，所述脉冲激光器9产生的高能量纳秒脉冲经过二向色镜10反射后被所述聚焦透镜3聚焦于所述透明薄膜7上的单细菌样品表面，瞬间气化电离并产生等离子体发光，并将激光诱导击穿光谱的脉冲激光束聚焦于待检测样品表面，气化单细菌样品并产生等离子体辐射。当焦平面上没有单细菌时没有光线进入图像采集系统，显示为全黑的暗视野。当有单细菌存在时，经由单细菌散射的光子由所述聚焦透镜3收集后，透过所述二向色镜10，被所述反射镜4反射进入套筒透镜5，由套筒透镜5将散射光聚焦成像于cmos相机6上，等离子体发光的光子由所述光纤11捕获并传输给所述光谱仪12，由所述光谱仪12记录该单细菌的激光诱导击穿光谱，并从特征谱线解析出单细菌中的元素信息。
33.如图2所示，利用本发明的暗视野显微成像系统记录的枯草芽孢杆菌暗视野图像和明场显微成像系统记录的明场图像。通过成像图对比可以看出，对于同一单细菌，暗视野显微成像具有非常高的对比度，可以对亚微米单细菌进行准确定位，从而方便激光诱导击穿光谱进行检测。图3示出了一个典型枯草芽孢杆菌的激光诱导击穿光谱图，通过与美国国家标准局的原子发射光谱数据库进行对比，可发现本发明能够检测亚微米单细菌中所含的多种元素信息。
34.综上，本发明所述的单细菌检测系统通过暗视野显微成像技术对亚微米待检测单细菌进行成像和定位，然后利用高能量、强聚焦的脉冲激光，将待测单细菌样品等离子化，
产生高温、高密度的等离子体，由高分辨率的光谱仪记录其元素特征谱线，用于单细菌的元素检测及定性分析。
35.尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。