分散固相微萃取-氨基酸自动分析仪法同时测定化妆品中20种游离氨基酸的方法与流程

分散固相微萃取
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氨基酸自动分析仪法同时测定化妆品中20种游离氨基酸的方法
技术领域
1.本发明涉及一种分散固相微萃取
‑
氨基酸自动分析仪法同时测定化妆品中 20种游离氨基酸的方法，属于分析检测技术领域。


背景技术：

2.人体表皮细胞角质层存在大量的游离氨基酸，这些氨基酸能够完整透过皮肤表皮细胞，赋予肌肤活力，改善肤质而不影响皮肤屏障功能，使皮肤柔滑、细腻且富有弹性，在保湿及维持皮肤稳态方面发挥重要作用。牛磺酸、5
‑
氨基乙酰丙酸(以下简称5
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ala)均为非蛋白氨基酸。其中，牛磺酸具有赋活肌肤细胞的能力，可提高肌肤免疫力，抵抗外界对肌肤的侵袭。5
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ala广泛存在于动植物和微生物细胞中，保湿锁水能力是玻尿酸的两倍，具有光敏特性，主要作为保湿剂和祛痘剂应用于化妆品中。在化妆品工业中，氨基酸以游离型、多肽类、改性氨基酸表面活性剂三种形式应用于护肤品、清洁用品以及护发素等化妆品中。然而，由于化妆品中氨基酸用量微少，且存在油脂、蜡质、高级脂肪酸以及表面活性剂等基质干扰，如何有效评价此类化妆品中氨基酸的添加水平，成为当今的研究热点之一。
3.目前，氨基酸检测的主要方法有柱前衍生
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高效液相色谱法、柱后衍生
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阳离子交换色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、液相色谱
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质谱串联法、气相色谱
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质谱串联法等。其中，基于柱后衍生
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阳离子交换原理研发的氨基酸分析仪，由于具有稳定性高、重现性好、分析种类多等优点，已被广泛应用于检测食品、药品中的氨基酸。
4.化妆品中氨基酸的检测方法报道较少，目前以茚三酮显色后使用分光光度法测定的行标法，仅用于测定氨基酸总量，不能确定单个氨基酸的含量。然而，氨基酸种类众多，化妆品配方中通常添加一种甚至多种氨基酸，因此上述行业标准存在不能有效监测原料质量及配方工艺稳定性的局限性，不适宜行业的发展及化妆品日常安全风险监测的需求。因此，本发明选取乳、啫喱、面膜、膏霜及化妆水等不同类型基质样品，优化流动相梯度洗脱程序，考察提取净化条件，建立了氨基酸自动分析仪同时定量测定化妆品中的20种游离氨基酸(包括18种常规氨基酸以及牛磺酸、5
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ala等非蛋白氨基酸)，解决了化妆品提取过程中出现的共提取物多、基质干扰大、表面活性剂泡沫引起的定量误差等难题，为化妆品安全风险监测及质量控制提供高效、便捷、准确可靠的分析方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，本发明提供一种分散固相微萃取
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氨基酸自动分析仪法同时测定化妆品中20种游离氨基酸的方法，该法优化流动相梯度洗脱程序，考察提取净化条件，建立的氨基酸自动分析仪的分析方法可同时定量测定化妆品中的20种游离氨基酸(包括18种常规氨基酸以及牛磺酸、 5
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ala等非蛋白氨基酸)，解决了化妆品提取过程中出现的共提取物多、基质干扰大、表面活性剂泡沫引起的定量误差等难题，为化妆品安全风险监测及质量控制提供高效、便捷、准确可靠的分析方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
7.分散固相微萃取
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氨基酸自动分析仪法同时测定化妆品中20种游离氨基酸的方法，包括以下步骤：
8.s01，标准溶液的配制；
9.s02，样品前处理：
10.准确称取样品1.00g，置于50ml聚丙烯具塞离心管中，先加入硫酸铝0.04 g、活性炭0.05g、psa 0.10g以及消泡剂0.10ml，再加入0.1mol/l盐酸10ml，涡旋1min使样品分散均匀，超声提取10min，2℃下以8000r/min冷冻离心5 min，残渣用0.1mol/l盐酸10ml分2次洗涤，离心，合并上清液，用0.1mol/l 盐酸定容至25ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取上清液，上机测定；
11.s03，色谱条件：
12.色谱柱：lca k06/na；
13.柱温程序：0～21min，58℃；21～26min，58～74℃；26～46min，74℃； 46～50min，74～58℃；50～57min，58℃；
14.进样量：50μl；
15.检测波长：570nm、440nm；
16.流动相流速：0.45ml/min；
17.茚三酮流速：0.25ml/min；
18.反应器温度：130℃；
19.流动相：a为0.04mol/l柠檬酸钠缓冲液，ph 3.45；b为0.07mol/l柠檬酸钠缓冲液，ph 10.85；c为0.50mol/l氢氧化钠再生液；
20.流动相梯度程序见下表：
[0021][0022]
检测波长570nm用于检测除脯氨酸外其余19种氨基酸，检测波长440nm 用于检测脯氨酸。
[0023]
所述消泡剂为t
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30f高效有机硅消泡剂，所述t
‑
30f高效有机硅消泡剂为液体。
[0024]
所述t
‑
30f高效有机硅消泡剂为市售商品，成分包括聚硅氧烷、改性聚硅氧烷或食品级乳化剂。
[0025]
所述20种游离氨基酸为天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、牛磺酸以及5
‑
氨基乙酰丙酸。
[0026]
s01中，标准溶液的配制的方法为：
[0027]
氨基酸混合标准溶液：包括天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸共17种，除胱氨酸含量为1.25μmol/ml 外，其余16种氨基酸含量均为2.50μmol/ml；
[0028]
精密称取色氨酸、牛磺酸以及5
‑
氨基乙酰丙酸标准品各10.0mg，用水溶解定容于10ml容量瓶中，作为标准储备溶液，备用；
[0029]
分别精密量取不同体积的氨基酸混合标准溶液和色氨酸、牛磺酸、5
‑
氨基乙酰丙酸标准储备溶液，用0.1mol/l盐酸逐级稀释成系列混合标准溶液，上机测定。
[0030]
化妆品包括乳、啫喱、面膜、膏霜和化妆水。本发明具有如下有益效果：
[0031]
本发明优化流动相梯度洗脱程序，考察提取净化条件，建立的氨基酸自动分析仪的分析方法可同时定量测定化妆品中的20种游离氨基酸(包括18种常规氨基酸以及牛磺酸、5
‑
ala等非蛋白氨基酸)，解决了化妆品提取过程中出现的共提取物多、基质干扰大、表
troemner公司；3
‑
18k冷冻离心机：德国sigma公司。
[0050]
氨基酸混合标准溶液(包括天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸共17种，除胱氨酸含量为1.25μmol/ml 外，其余16种氨基酸含量均为2.50μmol/ml)：德国sigma
‑
aldrich公司；色氨酸、牛磺酸标准品：中国药品生物制品检定研究院。5
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氨基乙酰丙酸盐酸盐，含量98％，北京百灵威科技有限公司。
[0051]
0.04mol/l柠檬酸钠缓冲液(ph 3.45)、0.07mol/l柠檬酸钠缓冲液(ph10.85)、0.50mol/l氢氧化钠再生液、茚三酮均为色谱纯，德国sykam公司；硫酸铝，分析纯，上海金山区塔美兴化工厂；活性炭，化学纯，西陇化工股份有限公司；乙二胺
‑
n
‑
丙基甲硅烷(psa)，德国sigma
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aldrich公司；t
‑
30f高效有机硅消泡剂，江苏腾达助剂有限公司。34批样品购于本地商场、超市、批发市场。
[0052]
1.2标准溶液的配制
[0053]
精密称取色氨酸、牛磺酸以及5
‑
ala标准品各10.0mg，用水溶解定容于 10ml容量瓶中，作为标准储备溶液，备用。
[0054]
分别精密量取不同体积的氨基酸混合标准溶液和色氨酸、牛磺酸、5
‑
ala 标准储备溶液，用0.1mol/l盐酸逐级稀释成系列混合标准溶液，上机测定。
[0055]
1.3样品前处理
[0056]
准确称取样品1.00g，置于50ml聚丙烯具塞离心管中，先加入硫酸铝0.04 g、活性炭0.05g、psa 0.10g以及消泡剂0.10ml，再加入0.1mol/l盐酸10ml，涡旋1min使样品分散均匀，超声提取10min，2℃下以8000r/min冷冻离心5 min，残渣用0.1mol/l盐酸10ml分2次洗涤，离心，合并上清液，用0.1mol/l 盐酸定容至25ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取上清液，上机测定。
[0057]
1.4色谱条件
[0058]
色谱柱：lca k06/na；柱温程序：0～21min，58℃；21～26min，58～ 74℃；26～46min，74℃；46～50min，74～58℃；50～57min，58℃；进样量：50μl；检测波长：570nm(除脯氨酸外其余19种氨基酸)、440nm(脯氨酸)；流动相流速：0.45ml/min；茚三酮流速：0.25ml/min；反应器温度： 130℃；流动相梯度程序见表1。
[0059]
表1流动相梯度程序
[0060][0061]
a为0.04mol/l柠檬酸钠缓冲液(ph 3.45)；b为0.07mol/l柠檬酸钠缓冲液(ph 10.85)；c为0.50mol/l氢氧化钠再生液。
[0062]
2结果与讨论
[0063]
2.1氨基酸色谱分离情况
[0064]
如图1所示，在“1.4”项下的色谱条件下，20种氨基酸均能很好的分离效果，且峰型较好。
[0065]
2.2样品前处理条件的优化
[0066]
化妆品的基质原料多为油脂、蜡质、烃类、高级脂肪酸、高级脂肪醇、水溶性高分子材料以及表面活性剂等，成分复杂，易包裹被测物，干扰测定，故考虑选用蛋白沉淀剂或絮凝剂、吸附剂净化，提高提取效率。因膏剂基质最复杂，选用膏剂样品进行净化试剂量的试验，以空白基质加标溶液待测物峰面积与同浓度的标准水溶液待测物峰面积之比来考察沉淀剂去除基质干扰提取效率。
[0067]
2.2.1硫酸铝溶液浓度的确定
[0068]
经考察，本发明的硫酸铝可以破坏表面活性剂的等电点，从而有助于沉淀大分子物质。取膏剂样品4份，照“1.3”项下试验，硫酸铝添加量分别为20mg、 40mg、100mg、200mg。硫酸铝的用量会影响离子交换柱的活性，随着用量增大，色谱峰型钝化，苏氨酸与丝氨酸分离度变差，综合考虑净化效果，最终拟定硫酸铝溶液浓度为40mg。
[0069]
现实中，未加其他金属离子竞争阳离子，峰型尖锐，分离度良好。加了硫酸铝阳离子后，竞争性抑制解离，峰型变钝，分离度随之变差，所以要考察硫酸铝的用量，兼顾沉淀大分子蛋白和色谱峰型及分离度影响。
[0070]
如图2所示，为硫酸铝用量对20种氨基酸回收率的影响(n＝3)图，分别考察了硫酸铝添加量为20mg、40mg、100mg、200mg时对20种氨基酸的回收率，进一步确定了硫酸铝的添加量为40mg。
[0071]
2.2.2活性炭用量的优化
[0072]
洗面奶、洁面膏中的表面活性剂等大分子物质易干扰测定，而本发明研究发现，活性炭能用于吸附脱除大分子物质。在提取过程中，分别考察了50mg、100mg、200mg和500mg活性炭的回收率，其他条件不变。结果如图3所示， 50mg活性炭就能吸附脱除样品中的大分子物质，溶液较澄清，提取回收率合理；随着活性炭用量的增大，色氨酸回收率逐渐降低。因此，最终选择活性炭的用量为50mg。
[0073]
2.2.3psa及消泡剂用量的确定
[0074]
经考察，psa可通过极性吸附作用、阴离子交换作用去除脂肪酸、有机酸、部分色素、金属离子、糖类干扰物等。取膏剂样品4份，照“1.3”项下试验， psa用量为50mg、100mg、200mg和500mg。图4为psa及消泡剂用量对 20种氨基酸回收率的影响(n＝3)图；如图4(a)所示，实验所得各溶液均澄清。psa自带游离铵，随着用量的增加，干扰峰氨峰响应逐渐增大，精氨酸回收率下降。故拟定psa用量为100mg。
[0075]
氨基酸类成分经常出现在洗面奶、洁面膏中，化妆品中含表面活性剂，产生丰富泡沫，影响测定。取膏剂样品4份，照“1.4”项下试验，消泡剂加入量为0.10ml、0.20ml、0.30ml、1.00ml。如图4(b)所示，结果消泡剂用量在0.10ml已能完全消泡，回收率结果差异不大，故拟定消泡剂用量为0.10ml。
[0076]
如图5所示，在570nm色谱图中，本发明的配比，硫酸铝：活性炭：psa：消泡剂＝40mg：50mg：100mg：0.10ml，20种氨基酸均能很好的分离效果，且峰型较好，组分苏氨酸、丝氨酸分离度最佳，待分析组分均峰型尖锐。
[0077]
2.3线性范围、检出浓度及定量下限
[0078]
在优化的色谱条件下，分别对系列质量浓度的混合标准工作溶液进行测定，以各化合物的质量浓度(x，mg/l)为横坐标、色谱峰面积(y)为纵坐标进行线性回归分析。结果显示，20种化合物在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.999。将混合标准溶液加入空白基质中，加标浓度逐级递减，按“1.3”项下进行样品处理，以3倍信噪比时计算检出浓度(lod)， 10倍信噪比时计算定量下限(loq)，结果如表2所示。
[0079]
表2 20种氨基酸的线性范围、线性方程、相关系数、检出浓度及定量下限
[0080]
[0081][0082]
2.4回收率和精密度
[0083]
分别在乳、啫喱、面膜、膏霜、化妆水的空白基质中加入低、中、高3个不同浓度水平的混合标准溶液，每组进行6次平行实验，加标回收率定量结果及相对标准偏差(rsd)结果见表3。结果显示，不同基质中各组分的加标回收率为80.4％～115％，rsd为0.1％～3.5％，在3个不同水平下加标回收率均能满足日常检测的需要。
[0084]
表3空白化妆品中20种氨基酸的加标回收率和精密度(n＝6)
[0085]
[0086]
[0087][0088]
[0089]
2.5实际样品的测定
[0090]
采用本方法对市售的34份化妆品样品(包括膏、霜、乳、水、啫喱、面膜等)中20种氨基酸类化合物进行了测定，结果均未检出5
‑
ala，出现检测结果与标签投料不吻合的产品有13份，不符合率达38％，其中7份样品未检出标签标示的组分，6份样品检出标签未标识的组分。
[0091]
3结论
[0092]
本研究建立了用氨基酸分析仪测定化妆品中氨基酸类成分的方法。优化了样品净化前处理方法，可测定化妆水、乳液、膏霜、啫喱面膜等化妆品中的20 种氨基酸类组分。经实际检测，市售34份化妆品中38％的产品检验结果与标签标识不符，说明在检验标准缺失的情况下，氨基酸类化妆品存在较大监管漏洞，本研究填补了这一空白。实验结果表明，本研究方法快速简便、重现性和耐用性好，结果准确可靠，兼顾绿色环保，有助于氨基酸类化妆品的质量监控。
[0093]
图5～图12，其中的峰号均为：1.牛磺酸(tau)；2.天门冬氨酸(asp)；3. 苏氨酸(thr)；4.丝氨酸(ser)；5.谷氨酸(glu)；7.甘氨酸(gly)；8.丙氨酸 (ala)；9.胱氨酸(cys)；10.缬氨酸(val)；11.蛋氨酸(met)；12.异亮氨酸 (ile)；13.亮氨酸(leu)；14.络氨酸(tyr)；15.苯丙氨酸(phe)；16.5
‑
氨基乙酰丙酸(5
‑
ala)；17.组氨酸(his)；18.色氨酸(trp)；19.赖氨酸(lys)； 20.精氨酸(arg)。
[0094]
对比例1
[0095]
本对比例与实施例1的区别仅在于：硫酸铝：活性炭：psa：消泡剂＝100mg： 50mg：200mg：0.20ml；如图6所示，在该配比下，组分苏氨酸、丝氨酸未达到基线分离，天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸峰型较钝。
[0096]
对比例2
[0097]
本对比例与实施例1的区别仅在于：硫酸铝：活性炭：psa：消泡剂＝200mg： 50mg：100mg：0.10ml；如图7所示，在该配比下，组分苏氨酸、丝氨酸未达到基线分离，天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸峰型很钝。
[0098]
对比例3
[0099]
本对比例与实施例1的区别仅在于：活性炭用量200mg，硫酸铝：psa：消泡剂＝100mg：200mg：0.10ml；如图8所示，在该配比下，组分色氨酸回收率较低，仅达33％。
[0100]
对比例4
[0101]
本对比例与实施例1的区别仅在于：
[0102]
硫酸铝用量100mg，活性炭：psa：消泡剂＝50mg：100mg：0.10ml，如图9所示，为该配比下的570nm色谱图。
[0103]
对比例5
[0104]
本对比例与实施例1的区别仅在于：硫酸铝用量200mg，活性炭：psa：消泡剂＝50mg：100mg：0.10ml，如图10所示，为该配比下的570nm色谱图。
[0105]
由对比例4和5可见，随着硫酸铝用量的加大，竞争性影响离子交换柱的活性，色谱峰型越来越钝化，苏氨酸、丝氨酸分离度越来越差。
[0106]
对比例6
[0107]
本对比例与实施例1的区别仅在于：psa用量200mg，硫酸铝：活性炭：消泡剂＝
40mg：50mg：0.10ml，如图11所示，为该配比下的570nm色谱图。
[0108]
对比例7
[0109]
本对比例与实施例1的区别仅在于：psa用量500mg，硫酸铝：活性炭：消泡剂＝40mg：50mg：0.10ml，如图12所示，为该配比下的570nm色谱图。
[0110]
由对比例6和7可见，psa自带游离铵，随着用量的增加，干扰峰氨峰响应逐渐增大，干扰精氨酸积分，导致其回收率下降。
[0111]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。