一种适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液及其应用的制作方法

1.本发明属于化学发光分析技术领域，具体涉及一种适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.化学发光免疫分析(chemiluminescence analysis,clia)诞生于1977年。根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。clia具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。clia应用范围较广，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。clia与放射免疫分析(ria)、荧光免疫分析(ifa)及酶免疫分析(eia)相比，具有无辐射、标记物有效期长并可实现全自动化等优点。clia在环境、临床、食品、药物检测等领域得到了广泛应用，成为免疫分析方法的研究热点和发展趋势。
4.吖啶酯作为一种重要的化学发光试剂，在化学发光免疫分析中有着重要的作用，吖啶酯作为标记物用于免疫分析，具有发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低等优点。然而，目前针对吖啶酯类化学发光体系的化学发光底物液的研究鲜有报道，因此有必要研发更为适宜于吖啶酯类化学发光体系的化学发光底物液，从而在提高其稳定性、灵敏度、检测范围的同时，进一步降低生产和使用成本。


技术实现要素：

5.基于上述现有技术的不足，本发明提供一种适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液及其应用。本发明通过筛选优化适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液成分、用量、ph等，从而成功制备一种具有稳定性好、灵敏度高、检测范围宽、成本低等优点的适于吖啶酯发光体系的化学发光底物液。
6.本发明的第一个方面，提供一种适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液，所述化学发光底物液包括底物a液和底物b液。
7.其中，
8.底物a液包括氧化剂和无机酸，且所述底物a液的ph小于1.5；
9.底物b液包括无机碱和增强剂，且所述底物b液的ph大于13。
10.使用时，所述底物a液和底物b液的体积比为1:1。
11.所述底物a液中，
12.其中，所述氧化剂包括过氧化氢和/或过氧化脲，经本发明优化验证，相较于过氧化脲，过氧化氢在增强试剂稳定性，提高项目测试线性范围以及灵敏度方面更具有优势。因此，优选氧化剂为过氧化氢。
13.所述无机酸包括盐酸、硝酸和硫酸，经本发明优化验证，相较于盐酸、硝酸，硫酸在增强试剂稳定性，提高项目测试线性范围以及灵敏度方面更具有优势。因此，优选的，所述无机酸为硫酸，所述硫酸为9m的硫酸。
14.所述底物b液中，
15.其中，所述无机碱包括氢氧化钠和/或氢氧化钾，优选为氢氧化钠。
16.通过增加增强剂，可以有效提高底物液的稳定性以及项目测试的线性范围和灵敏度等，其中，所述增强剂选用表面活性剂，如triton x
‑
100和/或tween
‑
20。而选择triton x
‑
100作为增强剂其整体改善效果更佳。
17.本发明的第二个方面，提供上述化学发光底物液的制备方法，所述制备方法包括：底物a液的制备和底物b液的制备；
18.将制备得到的底物a液和底物b液分别独立包装。
19.其中，
20.所述底物a液的制备方法包括：向氧化剂溶液中加入无机酸后加水定容；
21.所述底物b液的制备方法包括：向无机碱液加入增强剂并加水定容。
22.本发明的第三个方面，提供上述化学发光底物液在化学发光检测和/或制备化学发光检测试剂盒中的应用。
23.其中，所述化学发光检测具体为采用吖啶酯发光体系进行。
24.本发明的第四个方面，提供一种化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述化学发光底物液；进一步的，所述检测试剂盒还包括吖啶酯。
25.本发明的第五个方面，提供一种化学发光检测方法，所述化学发光检测方法包括使用上述化学发光底物液和/或上述化学发光检测试剂盒。
26.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
27.上述技术方案提供一种适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液，通过对使用的酸、碱、氧化剂和增强剂等进行筛选优化，从而能够有效增强试剂稳定性，提高项目测试线性范围以及灵敏度；同时，上述技术方案的化学发光底物液原料廉价易得，配制方法简单，不需要复杂昂贵设备，非常适合工业化生产，因此具有良好的实际应用价值。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
30.如前所述，目前针对吖啶酯类化学发光体系的化学发光底物液的研究鲜有报道，因此有必要研发更为适宜于吖啶酯类化学发光体系的化学发光底物液，从而在提高其稳定性、灵敏度、检测范围的同时，进一步降低生产和使用成本。
31.有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种适用于吖啶酯发光体系
的化学发光底物液，所述化学发光底物液包括底物a液和底物b液。
32.其中，
33.底物a液包括氧化剂和无机酸，且所述底物a液的ph小于1.5；
34.底物b液包括无机碱和增强剂，且所述底物b液的ph大于13。
35.使用时，所述底物a液和底物b液的体积比为1:1。
36.本发明的又一具体实施方式中，所述底物a液中，
37.其中，所述氧化剂包括过氧化氢和/或过氧化脲，经本发明优化验证，相较于过氧化脲，过氧化氢在增强试剂稳定性，提高项目测试线性范围以及灵敏度方面更具有优势。因此，优选氧化剂为过氧化氢。同时，本发明对氧化剂浓度进行进一步优化，优选的，所述氧化剂的质量浓度为0.6
‑
1.5wt％，如0.6wt％、0.65wt％、0.8wt％、1.0wt％、1.2wt％、1.32wt％、1.4wt％、1.5wt％，当过氧化氢质量浓度为1.32wt％时，对测试项目的线性范围以及灵敏度改善最佳。
38.所述无机酸包括盐酸、硝酸和硫酸，经本发明优化验证，相较于盐酸、硝酸，硫酸在增强试剂稳定性，提高项目测试线性范围以及灵敏度方面更具有优势。因此，优选的，所述无机酸为硫酸，所述硫酸为9m的硫酸。
39.本发明的又一具体实施方式中，所述底物b液中，
40.其中，所述无机碱包括氢氧化钠和/或氢氧化钾，优选为氢氧化钠。同时，本发明针对氢氧化钠的浓度对试剂稳定性、测试的线性范围、灵敏度进行研究，发现其浓度高低对试剂检测结果影响较小，因此综合考虑，选用低浓度氢氧化钠进行试验，因此，在本发明的一个具体实施方式中，所述氢氧化钠的浓度为0.1
‑
0.5m，包括0.1m、0.2m、0.3m、0.35m、0.4m和0.5m，优选为0.35m。
41.通过增加增强剂，可以有效提高项目测试线性范围以及灵敏度等，其中，所述增强剂选用表面活性剂，如triton x
‑
100和/或tween
‑
20。而选择triton x
‑
100作为增强剂其整体改善效果更佳，同时，通过对triton x
‑
100的质量浓度进行研究，当triton x
‑
100的浓度小于2wt％时，随着浓度的提高，对试剂稳定性、线性范围以及灵敏度的改善效果逐渐提高，但当triton x
‑
100的浓度达到3wt％，测试项目的重复性以及灵敏度出现了显著下降，因此triton x
‑
100的质量浓度为1
‑
3wt％，包括1wt％、2wt％和3wt％，优选为2wt％。
42.本发明的又一具体实施方式中，提供一种适用于吖啶酯发光体系的化学发光底物液，所述化学发光底物液包括在使用前独立保存的底物a液和底物b液；
43.其中，
44.所述底物a液：h2o2浓度1.32wt％，9m硫酸，ph至1.0
±
0.05；
45.所述底物b液：0.35m naoh和2wt％triton x
‑
100，ph＝13.48
±
0.1；
46.其中，所述底物a液、b液使用时体积比为1:1。
47.本发明的又一具体实施方式中，提供上述化学发光底物液的制备方法，所述制备方法包括：底物a液的制备和底物b液的制备；将制备得到的底物a液和底物b液分别独立包装。
48.其中，
49.所述底物a液的制备方法包括：向氧化剂溶液中加入无机酸后加水定容；
50.所述底物b液的制备方法包括：向无机碱液加入增强剂并加水定容。
51.本发明的又一具体实施方式中，提供上述化学发光底物液在化学发光检测和/或制备化学发光检测试剂盒中的应用。
52.其中，所述化学发光检测具体为采用吖啶酯发光体系进行。
53.本发明的又一具体实施方式中，提供一种化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述化学发光底物液；进一步的，所述检测试剂盒还包括吖啶酯。
54.本发明的又一具体实施方式中，提供一种化学发光检测方法，所述化学发光检测方法包括使用上述化学发光底物液和/或上述化学发光检测试剂盒。
55.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
56.实施例
57.待验证底物a液：
58.配方a1：h2o2浓度0.65wt％，用4m的盐酸调节ph至1.0
±
0.05；
59.配方a2：h2o2浓度0.65wt％，用8m的硝酸调节ph至1.0
±
0.05；
60.配方a3：h2o2浓度0.65wt％，用9m的硫酸调节ph至1.0
±
0.05；
61.配方a4：h2o2浓度1.32wt％，用9m的硫酸调节ph至1.0
±
0.05；
62.配方a5：过氧化脲浓度1.32wt％，用9m的硫酸调节ph至1.0
±
0.05；
63.以配方a1为例，其制备方法包括：称取10.8g的30％h2o2溶液、12.5ml浓度为4m的盐酸，然后用纯化水定容至500ml。搅拌混匀后得到缓冲液a1。以上方法制备的缓冲液ph为1.0
±
0.05，h2o2浓度为0.65wt％，ph为1.0
±
0.05。
64.以配方a2为例，其制备方法包括：称取10.8g的30％h2o2溶液、6.25ml浓度为8m的硝酸，然后用纯化水定容至500ml。搅拌混匀后得到缓冲液a2。以上方法制备的缓冲液ph为1.0
±
0.05，h2o2浓度为0.65wt％，ph为1.0
±
0.05。
65.以配方a3为例，其制备方法包括：称取10.8g的30％h2o2溶液、5.56ml浓度为9m的硫酸，然后用纯化水定容至500ml。搅拌混匀后得到缓冲液a3。以上方法制备的缓冲液ph为1.0
±
0.05，h2o2浓度为0.65wt％，ph为1.0
±
0.05。
66.以配方a4为例，其制备方法包括：称取22g的30％h2o2溶液、5.56ml浓度为9m的硫酸，然后用纯化水定容至500ml。搅拌混匀后得到缓冲液a4。以上方法制备的缓冲液ph为1.0
±
0.05，h2o2浓度为0.65wt％，ph为1.0
±
0.05。
67.以配方a5为例，其制备方法包括：称取6.6g的过氧化脲、5.56ml浓度为9m的硫酸，然后用纯化水定容至500ml。搅拌混匀后得到缓冲液a5。以上方法制备的缓冲液ph为1.0
±
0.05，h2o2浓度为0.65wt％，ph为1.0
±
0.05。
68.待验证底物b液：
69.配方b1：2.5m naoh+0.02m edta
‑
na2，ph＝13.32；
70.配方b2：0.35m naoh，ph＝13.48；
71.配方b3：0.35m naoh+1wt％tween
‑
20，ph＝13.48；
72.配方b4：0.35m naoh+1wt％triton x
‑
100，ph＝13.48；
73.配方b5：0.35m naoh+2wt％triton x
‑
100，ph＝13.48；
74.配方b6：0.35m naoh+3wt％triton x
‑
100，ph＝13.48；
75.对照底物a液：c
‑
a含有1.32wt％h2o2的酸性溶液(某进口品牌的底物a液，该成分为
说明书公开成分，其余组分不详)
76.对照底物b液：c
‑
b含有0.35m naoh的碱性溶液(同底物a液配套使用的底物b液，该成分为说明书公开成分，其余组分不详)
77.以配方b3为例，其制备方法包括：称取7g的naoh固体，用400ml纯化水溶解，然后称取10g的triton x
‑
100，然后用纯化水定容至500ml，定容后测定ph值，要求ph在13.48
±
0.1范围内。
[0078] 底物液a底物液b对比例1c
‑
ac
‑
b实施例1a1c
‑
b实施例2a2c
‑
b实施例3a3c
‑
b实施例4a4c
‑
b实施例5a5c
‑
b实施例6c
‑
ab1实施例7c
‑
ab2实施例8c
‑
ab3实施例9c
‑
ab4实施例10c
‑
ab5实施例11c
‑
ab6实施例12a4b5
[0079]
(1)测试底物液本底发光值
[0080][0081]
底物a液选择盐酸作为无机酸的实施例1本底高于对比例1，选择硝酸和硫酸作为无机酸的实施例2、3，本底与对比例1基本一致；将过氧化氢浓度提高或者将选择过氧化脲作为氧化剂的实施例4、5本底显著低于对比例1。三种无机酸中，选择硝酸或硫酸，底物本底更低；过氧化脲或更高浓度的过氧化氢对降低底物本底作用显著。
[0082]
底物b液几种配方，在本底测试中均表现出比对比例1更低的本底，提高氢氧化钠
浓度对降低底物本底无显著作用。
[0083]
(2)测试ae加样重复性
[0084][0085]
底物a液的过氧化氢浓度为0.65wt％的实施例1、2、3，无论采用何种无机酸，底物直接测试afp项目ae的发光值均显著低于对比例1；底物a液的过氧化氢浓度为1.32wt％的实施例4，底物直接测试afp项目ae的发光值与对比例1基本一致；将底物a液的过氧化氢更换为过氧化脲后的实施例5，底物直接测试afp项目ae的发光值仍显著低于对比例1。提高过氧化氢浓度对提高底物发光值有显著改善。
[0086]
底物b液中氢氧化钠浓度为0.35m的实施例7比氢氧化钠浓度为2.5m的实施例6底物直接测试afp项目ae的发光值更高，提高氢氧化钠浓度对提高直接测试afp项目ae的发光值无显著改善；加1％tween
‑
20作为增强剂的实施例8与未加增强剂的实施例7相比，直接测试afp项目ae的发光值有显著升高；将增强剂更换为1％的triton x
‑
100的实施例9与实施例8相比，直接测试afp项目ae的发光值进一步提高，基本能达到对比例1的水平，当进一步提高triton x
‑
100的浓度到2％、3％时的实施例10、11，直接测试afp项目ae的发光值持续提升，能够达到显著优于对比例1的情况。添加增强剂能显著提高发光值，其中triton x
‑
100比tween
‑
20作用更为明显，并且随着浓度提高，增强效果更为明显。
[0087]
(3)测试项目
[0088]
抗原浓度(ng/ml)对比例1实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例7实施例8实施例9实施例10实施例11实施例12081699320115828951667089363701517986541002999871384373017.8335703900932391370123408634092938813497257033362043652482143796831.25875881013547232792785872918302923184347396469491447145761156351128751125307906328513206541309963348270319047737331097552276033130025587215498114871235009880859697204657389345711120456920017241494362750740539926299193786318763241698635200026882322406172120879126839013326437273509165689694664716478142236233539087548054124702898拉开梯度对比例1实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例7实施例8实施例9实施例10实施例11实施例12b/a4.14.22.84.15.13.82.52.63.03.44.43.55.2c/b2.62.62.22.52.62.42.52.62.52.73.33.23.4d/c3.53.22.93.34.03.83.23.23.53.43.83.53.8e/d3.23.02.33.03.22.93.33.33.33.03.53.43.5f/e2.72.52.62.93.03.02.72.62.22.42.82.62.8
[0089]
底物a液的无机酸选择硝酸的实施例2测试项目的信号范围更窄，显著低于对比例
1以及选择盐酸和硫酸作为无机酸的实施例1、3；将过氧化氢浓度提高到1.32wt％的实施例4测试afp项目整体信号范围更宽，具有更高的灵敏度，显著优于对比例1以及实施例1、2、3；含有过氧化氢的实施例4，测试项目灵敏度优于含有过氧化脲的实施例5。三种无机酸中，盐酸和硫酸在测试项目时显著优于硝酸；与过氧化脲相比，过氧化氢对提高项目测试的灵敏度的改善更为明显，且浓度为1.32wt％的过氧化氢比浓度为0.65wt％的过氧化氢，对灵敏度的改善效果更为明显。
[0090]
底物b液选择不同浓度氢氧化钠的实施例6、7测试项目整体偏比与信号值均显著低于对比例1；加入1％tween
‑
20作为增强剂的实施例8，测试项目信号值有提升，但整体信号值以及低值部分灵敏度仍显著低于对比例1；将增强剂更换为1％的triton x
‑
100的实施例9与实施例8相比，测试项目信号值和灵敏度均有明显改善，但仍显著低于对比例1；当进一步提高triton x
‑
100的浓度到2％的实施例10，整体信号值以及偏比均达到了优于对比例1的情况；当triton x
‑
100的浓度再次提升到3％的实施例11，发光值没有进一步提升，且灵敏度变差。添加增强剂能显著提高发光值以及测试项目的灵敏度，其中triton x
‑
100比tween
‑
20作用更为明显，并且随着浓度提高，增强效果更为明显，但当triton x
‑
100的浓度达到2％以上时，改善作用不再显著，且测试项目的灵敏度有变差的趋势。
[0091]
(4)测试项目重复性
[0092]
[0093][0094]
底物a液的三种无机酸实施例1、2、3与对比例1相比在重复性测试上无显著差异，不同浓度过氧化氢的实施例3、4在重复性上也无显著差异，与同浓度的过氧化氢相比过氧化脲在测试项目重复性上cv稍差，但整体结果仍可接受。在重复性测试上，底物a液的几种配方无显著差异。
[0095]
底物b液选择不同浓度氢氧化钠的实施例6、7以及添加不同种类增强剂的实施例8、9在测试项目重复性上无显著差异，但当triton x
‑
100的浓度提高到3％时，测试项目的重复性显著变差。在底物液b中，当增强剂浓度过高时，会导致测试的重复性显著变差。
[0096]
(5)37℃加速稳定性测试
[0097][0098]
底物a液的三种无机酸中，选择盐酸和硝酸的实施例1、2在37℃加速稳定性测试中，发光值下降程度比对比例1以及选择硫酸的实施例3更为明显；不同浓度的过氧化氢的实施例3、4在37℃加速稳定性测试中，发光值下降程度基本无明显差异；相同浓度的过氧化脲与过氧化氢相比，含有过氧化脲的实施例5比含有过氧化氢的实施例4，在37℃加速稳定性测试中，发光值下降程度更明显。三种无机酸中，选择硫酸对底物a液稳定性的提升有明显改善；过氧化氢比过氧化脲更能提高底物a液的稳定性。
[0099]
底物液b未加增强剂时的实施例6、7以及选择tween
‑
20作为增强剂的实施例8在稳定上表现稍差，发光值下降较快，选择triton x
‑
100作为增强剂的实施例9对底物稳定性有所改善，但持续提高triton x
‑
100浓度的实施例10、11对进一步提高稳定性，改善不明显。在底物液b中添加增强剂能提高底物的稳定性，其中triton x
‑
100比tween
‑
20对稳定性的改善作用更为明显，但提高triton x
‑
100的浓度对稳定性的改善并不明显。
[0100]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。