一种基于共价有机框架胶囊的SARS-CoV-2RNA裸眼检测方法

一种基于共价有机框架胶囊的sars-cov-2 rna裸眼检测方法
技术领域
1.本发明属于分析化学领域，尤其涉及一种基于共价有机框架胶囊用于裸眼检测sars-cov-2 rna的比色传感器的制备方法及应用。


背景技术：

2.由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的新型冠状病毒肺炎(covid-19)正在持续爆发，已在全球范围内蔓延，并造成了大量的感染和死亡。截至2021年3月中旬，新冠肺炎病毒的快速传播已影响到200多个国家，确诊病例超过1亿例，近270万人死亡。发展灵敏、准确的新型冠状病毒检测方法对促进新冠肺炎疫情防控具有重要意义。目前，逆转录聚合酶链反应是鉴定新型冠状病毒感染的主要方法。然而，逆转录聚合酶链反应需要昂贵的特殊设备和训练有素的技术人员，考虑到大流行的高度潜在威胁，迫切需要建立快速和简单的新型冠状病毒检测方法。
3.比色分析因其简单、经济、不需要复杂的仪器、特别容易用肉眼读出而受到广泛关注，这可能为新型冠状病毒检测提供新的机会。酶催化是将检测事件转化为颜色变化的最常见的比色方法之一。然而，酶在苛刻的条件下容易失活，如极性有机溶剂、极端的酸碱度、高温和蛋白酶的作用，酶的脆弱性限制了其广泛应用。受大自然的启发，“智能胶囊”的设计是一种巧妙的酶封装策略，可以有效克服游离酶的缺陷。无机纳米粒子和有机聚合物纳米材料是制备胶囊的常用材料，然而，它们可能受到诸如功能弱或结构不规则等缺点的困扰。共价有机框架(cof)是一种新兴的多孔晶体材料，具有优异的稳定性、规则的孔隙率、可预先设计的结构和可定制的功能，是酶封装的理想选择。cof不仅克服了大多数无机多孔材料结晶度差、孔分布不均匀的缺点，而且克服了金属有机骨架在水中易坍塌的缺点。这些显著的物理化学性质使其在生物分子封装应用中显示出巨大的潜力。然而，生物分子的存在会限制合成条件，用传统的“一锅法”直接制备用于生物分子包封的cof胶囊是不现实的。
4.在这里，我们首先提出了一个新颖而简单的策略来制作cof胶囊来封装酶，然后应用它们来建立一个新的肉眼检测新型冠状病毒核糖核酸的比色法。为了解决酶封装的难题，我们采用可被刻蚀的沸石咪唑盐骨架-90(zif-90)作为模板制备酶@zif90@cof核壳结构。酶分子通过原位封装被包裹在zif-90中，这可以保护它们免受下一步cofs的苛刻合成条件的影响。然后，在室温下，通过简单的反应，可在10分钟内在酶@zif90@cof核壳结构的表面反应形成cof壳。之后，将zif-90蚀刻掉，大量的酶被释放到中空的cof胶囊中。在形成的酶@cof胶囊中相对广阔的微环境可以提供优异的保护作用，同时保持酶的构象自由并促进底物和产物之间的传质，这对于酶的高催化效率是至关重要的。所提出的方法结合了cof和mof的优点，为提高酶的性能开辟了一条新的途径。更关键的是，cofs胶囊的卓越性能及其与比色生物测定的结合可以为sars-cov-2检测提供新的选择。


技术实现要素：

5.克服了现有技术存在的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用mof做模板制
作cof胶囊包酶，不仅提供了的简便、快速、高清晰度的cof胶囊的制备方法，而且提供了一种裸眼检测sars-cov-2 rna的新方法。
6.本发明公开了一种基于共价有机框架胶囊的sars-cov-2 rna裸眼检测方法，包括如下步骤：
7.(1)酶@zif-90的制备：利用金属前驱体、酶、有机配体溶解在10ml水中，超声反应。所述的金属前驱体，浓度为10-20mg/ml；所述的酶，浓度为0.1-2mg/ml；所述的有机配体，浓度为15-25mg/ml；反应温度为常温；所述的反应时间为5-10min。
8.(2)酶@cof胶囊的制备：
9.将酶@zif-90和有机配体溶解在乙腈中，超声混合。所述的酶@zif-90浓度为5-20mg/ml；所述的有机配体浓度为5-10mg/ml。此后，向溶液中滴加质子酸，体积为0.5-3ml，搅拌5-10分钟。通过离心收集产物(酶@zif-90@cof)，用丙酮洗涤，然后真空干燥。之后，将获得的酶@zif-90@cof用于制备酶@cof胶囊。将酶@zif-90@cof在磷酸盐缓冲液中蚀刻4-6小时。通过离心收集沉淀物，用去离子水洗涤。最后，将获得的酶@cof胶囊在室温下真空干燥。
10.(3)igg-酶@cof的制备：
11.将酶@cof溶于水中制成分散液，加入免疫球蛋白(igg)，搅拌1-2小时。所述的酶@cof，浓度为0.1-1.5mg/ml，所述的igg浓度为0.5-2mg/ml。
12.(4)进行sars-cov-2 rna的检测。
13.本发明所述的使用方法：
14.(1)在96孔微孔板中，将一定浓度的探针dna分别移加到每个孔中，并在25-40℃的环境中孵育30-90分钟。
15.(2)加入含有不同浓度的sars-cov-2 rna，在25-40℃的环境中孵育60-180分钟。
16.(3)添加一定浓度的s9.6抗体，在25-40℃的环境中孵育30-120分钟。
17.(4)添加一定量的igg-酶@cof胶囊，25-40℃的环境中反应30-120分钟。
18.(5)滴加tmb显色液，在25-40℃的环境中孵育5-20分钟，并测量吸收强度(a)，用作吸光度响应变化值。
19.(6)用相应的软件对原始数据进行线性判别分析。
20.其中，本发明所述的共价有机框架胶囊用于裸眼检测sars-cov-2 rna的比色传感器可以对sars-cov-2 rna进行低浓度的分析检测。
21.其中，本发明所述的共价有机框架胶囊用于裸眼检测sars-cov-2 rna的比色传感器可以对咽拭子样本进行分析检测。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.1.本发明首次使用封装酶的cof胶囊，应用于生物样本的检测中；
24.2.本发明制备的比色传感器不仅可以实现sars-cov-2 rna的检测，也可用于分析临床样本；
25.3.本发明制备的比色传感器，其制作成本低廉，工艺简单，操作容易并且反应体系稳定，不受样本的影响；
26.4.本发明也可有望用于其他疾病的诊断，肿瘤细胞的分析，预后诊断，对疾病的临床检测提供了新的思路，具有广泛的应用前景。
附图说明
27.图1为材料的表征图；
28.图2为传感器的构建示意图；
29.图3为sars-cov-2 rna的检测分析图
30.图4为实际样本检测分析图；
具体实施方式
31.为了更清楚地阐释本发明的目的、技术方案及优势，下面结合附图与实施例，对本发明做进一步说明：
32.实施例1：基于共价有机框架胶囊的比色传感器用于检测sars-cov-2 rna
33.1)酶@zif-90的制备：
34.利用金属前驱体、酶、有机配体溶解在10ml水中，超声反应。所述的金属前驱体，浓度为10-20mg/ml；所述的酶，浓度为0.1-2mg/ml；所述的有机配体，浓度为15-25mg/ml；反应温度为常温；所述的反应时间为5-10min。
35.2)酶@cof胶囊的制备：
36.将酶@zif-90和有机配体溶解在乙腈中，超声混合。所述的酶@zif-90浓度为5-20mg/ml；所述的有机配体浓度为5-10mg/ml。此后，向溶液中滴加质子酸，体积为0.5-3ml，搅拌5-10分钟。通过离心收集产物(酶@zif-90@cof)，用丙酮洗涤，然后真空干燥。之后，将获得的酶@zif-90@cof用于制备酶@cof胶囊。将酶@zif-90@cof在磷酸盐缓冲液中蚀刻4-6小时。通过离心收集沉淀物，用去离子水洗涤。最后，将获得的酶@cof胶囊在室温下真空干燥。
37.3)igg-酶@cof的制备：
38.将酶@cof溶于水中制成分散液，加入免疫球蛋白(igg)，搅拌1-2小时。所述的酶@cof，浓度为0.1-1.5mg/ml，所述的igg浓度为0.5-2mg/ml。
39.参见附图1，为本实施例中所制备材料的xrd图谱以及fitc-igg-酶@cof的激光共聚焦扫描图，表明了材料的成功制备。不同苛刻条件下处理后游离酶、酶@zif-90和酶@cof胶囊的活性对比，表明了cof胶囊对于酶具有优越的保护作用。酶@cof在5次循环后仍保持其原始活性的90％，表明其具有优异的可重复使用性。
40.4)进行sars-cov-2 rna的检测：
41.在96孔微孔板中，将一定浓度的探针dna分别移加到每个孔中，并在25-40℃的环境中孵育30-90分钟。加入含有不同浓度的sars-cov-2 rna，在25-40℃的环境中孵育60-180分钟。添加一定浓度的s9.6抗体，在25-40℃的环境中孵育30-120分钟。添加一定量的igg-酶@cof胶囊，25-40℃的环境中反应30-120分钟。滴加tmb显色液，在25-40℃的环境中孵育5-20分钟，并测量吸收强度(a)，用作吸光度响应变化值。用相应的软件对原始数据进行线性判别分析。
42.参见附图2，为传感器的构建示意图。
43.参见附图3，在5pm到5
×
104pm的范围内，吸光度随着新型冠状病毒核糖核酸浓度的增加而增加，并且吸光度和sars-cov-2 rna浓度的对数之间存在线性关系。
44.实施例2：基于共价有机框架胶囊的比色传感器用于新冠病人咽拭子样本的检测
45.1)酶@zif-90的制备：
46.利用金属前驱体、酶、有机配体溶解在10ml水中，超声反应。所述的金属前驱体，浓度为10-20mg/ml；所述的酶，浓度为0.1-2mg/ml；所述的有机配体，浓度为15-25mg/ml；反应温度为常温；所述的反应时间为5-10min。
47.2)酶@cof胶囊的制备：
48.将酶@zif-90和有机配体溶解在乙腈中，超声混合。所述的酶@zif-90浓度为5-20mg/ml；所述的有机配体浓度为5-10mg/ml。此后，向溶液中滴加质子酸，体积为0.5-3ml，搅拌5-10分钟。通过离心收集产物(酶@zif-90@cof)，用丙酮洗涤，然后真空干燥。之后，将获得的酶@zif-90@cof用于制备酶@cof胶囊。将酶@zif-90@cof在磷酸盐缓冲液中蚀刻4-6小时。通过离心收集沉淀物，用去离子水洗涤。最后，将获得的酶@cof胶囊在室温下真空干燥。
49.3)igg-酶@cof的制备：
50.将酶@cof溶于水中制成分散液，加入免疫球蛋白(igg)，搅拌1-2小时。所述的酶@cof，浓度为0.1-1.5mg/ml，所述的igg浓度为0.5-2mg/ml。
51.4)进行新冠病人咽拭子样本的检测：
52.在96孔微孔板中，将一定浓度的探针dna分别移加到每个孔中，并在25-40℃的环境中孵育30-90分钟。加入含有不同病例的咽拭子样本，在25-40℃的环境中孵育60-180分钟。添加一定浓度的s9.6抗体，在25-40℃的环境中孵育30-120分钟。添加一定量的igg-酶@cof胶囊，25-40℃的环境中反应30-120分钟。滴加tmb显色液，在25-40℃的环境中孵育5-20分钟，并测量吸收强度(a)，用作吸光度响应变化值。用相应的软件对原始数据进行线性判别分析。
53.参见附图4，新冠肺炎患者测试样品的吸光度明显高于健康人，散点图可以显示出新冠患者和健康个体之间的显著差异。结果表明，我们的方法可以实现新型冠状病毒核糖核酸的检测，这可能有助于在资源有限的地区对新冠肺炎进行紧急诊断。
54.以上对本发明的技术方案与应用进行了详细介绍。具体实施例的说明仅用于更清楚地阐释本发明的实施方法而非对本发明的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明技术方案的实质范围下，可以进行修饰或改进，这些修饰和改进也应涵盖在本发明的权利要求范围中。