脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量测定方法与流程

1.本发明属于分析化学领域，具体而言，本发明涉及一种脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量测定方法。


背景技术：

2.脑脉利颗粒是由益母草、三七、黄芪、姜黄、川芎、红花、丹参、赤芍、当归、白芍、川牛膝十一味中药经过提取加工制备而成的中药颗粒剂。具有活血化瘀，益气通脉的功效，用于气虚血瘀型性中风病(脑梗塞)中经络急性期，症见半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜、语言蹇涩等。
3.其中，益母草为君药，盐酸水苏碱为其有效活性成分。目前脑脉利颗粒质量控制标准中含量测定方法是采用薄层扫描法(tlcs)控制盐酸水苏碱的含量。此检测方法具有准确度低，精密度差等缺点；且供试品溶液制备需要通过732型氢型阳离子交换树脂柱处理，操作费时费力。
4.现有技术中有采用hplc紫外检测器进行检测盐酸水苏碱含量，盐酸水苏碱属于季铵碱，结构中无共轭体系，在192nm处有微弱吸收，通过hplc紫外检测器选择末端吸收检测益母草中盐酸苏碱含量。2020年药典中益母草颗粒采用hplc紫外检测方法，选择强阳离子交换树脂柱，以乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾-磷酸为流动性。cn201510876597.0公开了一种检测益母草中盐酸水苏碱的方法，采用hplc紫外检测方法，选择强阳离子交换(scx)色谱柱，以磷酸二氢钾为流动性，供试品通过氧化铝活性炭低压层析柱进行制备。虽然采用hplc紫外检测益母草中的盐酸水苏碱是可行的，但是对于含有多种复方成分的中成药相关干扰较大，检测较不准确。
5.现有技术中有采用hplc-elsd方法检测益母草中盐酸水苏碱含量。现有技术中采用hplc-elsd方法时，色谱柱的选择多为氨基柱、丙基酰胺键合硅胶柱等。脑脉利颗粒中盐酸水苏碱检测采用氨基柱、丙基酰胺键合硅胶柱等色谱柱，需要进行复杂的前处理。cn201610058048.7公开了一种采用hplc-elsd法检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定方法，采用丙基酰胺键合硅胶为色谱柱，乙腈-冰醋酸为流动相。但实施例1中供试品的制备中需要经过732型氢型阳离子交换树脂柱进行过柱，操作繁琐；且脑脉利颗粒样品中盐酸水苏碱峰形较差。现有技术相关期刊文献公开了hplc-elsd法测定益母草中的盐酸水苏碱，色谱柱为强阳离子交换柱，以甲醇-醋酸铵为流动相，此方法主要针对益母草单味药材中的盐酸水苏碱含量测定，由于脑脉利颗粒成分复杂，干扰较多，并不适用于脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的检测。


技术实现要素：

6.本发明目的在于，针对现有技术中的检测方法不适用于脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定，提供一种灵敏度高、专属性强、准确度高、精密度高，操作简单易行，有效控制脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量测定方法。
7.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
8.一种检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定方法，包含如下步骤：
9.采用hplc检测供试品溶液中盐酸水苏碱的含量，采用色谱条件如下：采用强阳离子交换键合硅胶为填充剂的色谱柱；检测器采用蒸发光散射检测器；流动相为乙腈-有机盐水溶液；所述有机盐选自甲酸铵、乙酸铵中的一种或多种。
10.在一个优选的实施例中，本发明所述流动相为乙腈-甲酸铵。
11.进一步地，所述流动相ph值为1.9～3.5，优选为1.95～2.05或2.8～3.5，更优选为1.95～2.05；；所述ph值采用乙酸或甲酸调节，优选为甲酸。
12.进一步地，所述有机盐水溶液的摩尔浓度为0.03～0.05mol/l，优选为0.03mol/l；所述乙腈与有机盐的配比为10:90～20:80，优选为13:87～17:83，更优选为15:85。
13.进一步地，所述色谱柱为agilent zorbax 300-scx，优选地，所述色谱柱规格为4.6mm
×
250mm，5μm。
14.进一步地，所述hplc检测的柱温为25～50℃，优选为30～40℃。
15.进一步地，所述流动相流速为0.7-1.2ml/min，优选为0.7-1.0ml/min。
16.进一步地，检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定方法中还包括脑脉利颗粒供试品溶液的制备；
17.所述供试品溶液的制备方法为脑脉利颗粒加入提取溶剂进行超声或回流提取，制成供试品溶液；所述提取溶剂为水、盐酸溶液、乙醇、乙醇水溶液、甲醇或甲醇水溶液中的一种或多种。在一些实施例中，所述提取溶剂为乙醇水溶液或甲醇水溶液；
18.进一步地，所述乙醇水溶液或甲醇水溶液的体积百分含量不小于50％，在一些实施例中，提取溶剂为乙醇水溶液，乙醇水溶液体积百分含量为50％～80％。
19.在一些实施例中，所述供试品溶液的制备方法为脑脉利颗粒加入提取溶剂进行超声提取，不需要过柱处理。
20.进一步地，所述超声时间为20min以上，优选为20～60min。
21.进一步地，检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定方法中还包括盐酸水苏碱对照品溶液的制备；脑脉利颗粒供试品溶液的制备。所述对照品溶液制备为取盐酸水苏碱对照品加70％乙醇溶解；所述供试品溶液制备为取脑脉利颗粒供试品加入70％乙醇，超声提取30分钟。
22.优选地，本发明具体方案为：
23.一种检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定方法，包含以下步骤：
24.色谱条件与系统适用性试验：以强阳离子交换键合硅胶为填充剂(agilent zorbax300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以乙腈-0.03mol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至2.0)(15：85)为流动相；流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于2000。
25.对照品溶液的制备：取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml约含0.2mg的溶液，即得。
26.供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物，混匀，取适量，研细，取约1g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续
滤液，即得。
27.测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl，供试品溶液20～30μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
28.本品每袋含益母草以盐酸水苏碱(c7h
13
no2·
hcl)计，不得少于25mg。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果：
30.1.本发明提供脑脉利颗粒检测方法，以盐酸水苏碱为有效成分对脑脉利颗粒中益母草进行检测。采用hplc-elsd较hplc-uv检测方法，盐酸水苏碱峰形良好，不易受其他峰干扰，与邻色谱峰分离度良好。采用hplc-elsd检测方法，较薄层扫描法(tlcs)检测方法，精密度高，准确度好。
31.2.现有技术公开的色谱条件均不适用于脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的检测，发明人研究发现以乙腈-甲酸铵或乙腈-乙酸铵为流动相时，可以有效分离盐酸水苏碱和其他杂质。经研究发现本方法对ph值比较敏感，通过选择合适的ph适用范围使待测成分与其他杂质有效分离，达到准确定量的目的。
32.3.脑脉利颗粒是由多种中药制成的中成药制剂，成分复杂，采取hplc检测时会影响干扰盐酸水苏碱的检测。发明人发现通过采用强阳离子交换键合硅胶柱，流动相为乙腈-有机盐水溶液，供试品溶液制备相比操作繁琐的过柱操作和回流提取过程，采用超声提取制备，省时省力，减少操作误差；减少了检测样品量；样品制备操作仅需1h，大大节省了检测时间，节省了检测成本(省去了薄层板、填充柱、填料等，节省溶剂)，操作安全简便，样品处理方便快捷。
33.4.选用强阳离子色谱柱对检测过程分离除杂，采用高效液相仪-蒸发光散射检测器(hplc-elsd)检测盐酸水苏碱含量。优化后的方法可快速、准确地重复检测出脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量，具有操作简便、耗时短、准备度高，具有良好的精密度、稳定性、线性关系、重复性，耐用性好等优点，能够有效保证产品质量的稳定性和可控性。
34.5.本发明方法能够有效检测出脑脉利颗粒中盐酸水苏碱，分离度、峰形和柱效好，并且分离度能达1.5以上，分离效果好。
35.6.检出盐酸水苏碱含量较之前tlc薄层法高，脑脉利颗粒每袋含益母草以盐酸水苏碱(c7h
13
no2·
hcl)计，限度由之前的17mg/袋提高至25mg/袋。
附图说明
36.图1为采用丙基酰胺键合硅胶柱，乙腈-冰醋酸为流动相的(hplc-elsd检测器)hplc色谱图；
37.图2为实施例1中强阳离子交换键合硅胶色谱柱(紫外检测器)的hplc色谱图；
38.图3为按照文献方法检测盐酸水苏碱含量的hplc色谱图；
39.图4为流动相为乙腈-0.2％冰醋酸的hplc色谱图；
40.图5为流动相为乙腈-0.05mol/l甲酸铵(ph值为2.0)(15:85)的hplc色谱图；
41.图6为流动相为乙腈-0.05mol/l乙酸铵(ph值为3.5)(15:85)的hplc色谱图；
42.图7为流动相为乙腈-0.05mol/l甲酸铵(ph值为3.5)(15:85)的hplc色谱图；
43.图8为流动相为乙腈-0.05mol/l乙酸铵(ph值为2.8)(15:85)的hplc色谱图；
44.图9为流动相为乙腈-0.05mol/l甲酸铵(ph值为2.5)(15:85)的hplc色谱图；
45.图10为实施例3中供试品
①
制备的hplc色谱图；
46.图11为实施例3中供试品
②
制备的hplc色谱图；
47.图12为流动相为0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)-乙腈(83：17)的hplc色谱图；
48.图13为流动相为0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)-乙腈(87：13)的hplc色谱图；
49.图14为流动相为乙腈-0.02mol/l甲酸铵(用甲酸调节不同ph值)(15:85)的hplc色谱图；
50.图15为流动相为乙腈-0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至1.95)(15:85)的hplc色谱图；
51.图16为流动相为乙腈-0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)(15:85)的hplc色谱图；
52.图17为流动相为乙腈-0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.05)(15:85)的hplc色谱图；
53.图18为对照品溶液进样体积为5μl时的hplc色谱图；
54.图19为对照品溶液进样体积为20μl时的hplc色谱图。
具体实施方式
55.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
56.实施例中未注明具体实验步骤或条件的，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
57.本发明经过大量的研究和试验，得到一种脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量测定方法，该方法提供了能够有效分离盐酸水苏碱和其他杂质，分离度(resol.)简称r可达1.5以上。
58.分离度，用于考察色谱峰之间分离情况的参数；通常两个峰型峰高相当的色谱峰，其分离度大于等于1.5则认为两峰的分离达到99％以上；r值越大分离情况越好。
59.本实施例提供一种脑脉利颗粒的检测方法，具体条件如下：
60.仪器和色谱柱：agilent 1260型号高效液相色谱仪；蒸发光散射检测器，强阳离子交换键合硅胶(agilent zorbax 300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm)。
61.药品：脑脉利颗粒(批号：11-210110)，南京柯菲平盛辉制药有限公司。
62.试剂：乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。
63.对照品盐酸水苏碱购自中国食品药品检定研究院。
64.操作中，取对照品溶液5μl、20μl与供试品溶液20～30μl注入液相色谱仪。
65.测试例1
66.对比例1：按照cn201610058048.7中公开的hplc-elsd法检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量，采用丙基酰胺键合硅胶为色谱柱，乙腈-冰醋酸为流动相。
67.具体方法如下：
68.对照品溶液制备：取盐酸水苏碱2mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加70％乙醇溶解并稀释至刻度。
69.供试品溶液制备：取脑脉利颗粒约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1mol/l的盐酸溶液40ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250w，频率33khz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用1mol/l的盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液20ml，置已处理好的732型氢型阳离子交换树脂柱(内径约0.9cm，柱高18cm)上，收集流出液，重新通过树脂柱，如上再重复二次，加水200ml分次洗涤至中性，弃去水洗液，再用浓氨试液-甲醇(20∶80)混合液100ml分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用70％乙醇使溶解，定量转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。
70.色谱条件为：
71.色谱柱：丙基酰胺键合硅胶sepax polar-propylamide，4.6
×
250mm，5μm
72.流动相：乙腈-0.2％乙酸水(80：20)，流速为1ml/min，柱温30℃。
73.检测器：蒸发光散射检测器(elsd)
74.测定法：取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪。
75.具体结果见图1，图1中盐酸水苏碱保留时间在23.070min，结果显示，按照对比例1方法进行检测，脑脉利颗粒样品中盐酸水苏碱峰形较差，且与前一峰的分离度为0.71，分离度较差，且保留时间长。
76.可见其结果并不如专利cn201610058048.7中所述的主成分与其他杂质峰完全分离，该方法重现性差。
77.对比例2参考2020年药典中益母草颗粒检测方法，采用hplc紫外检测方法，色谱柱为阳离子交换键合硅胶色谱柱，流动相为乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(15：85)，检测波长192nm。
78.具体方法如下：
79.对照品溶液制备：取盐酸水苏碱2mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
80.供试品溶液制备：本品约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1mol/l的盐酸溶液40ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250w，频率33khz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用1mol/l的盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液20ml，置已处理好的732型氢型阳离子交换树脂柱(内径约0.9cm，柱高18cm)上，收集流出液，重新通过树脂柱，如上再重复二次，加水200ml分次洗涤至中性，弃去水洗液，再用浓氨试液-甲醇(20∶80)混合液100ml分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，加入水10ml，超声溶解后，过滤，即得。
81.色谱柱为agilent zorbax 300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm；流动相为乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(15：85)；检测波长为192nm；流速为1.0ml/min，柱温为35℃。取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪。
82.结果如图2，黑色线为盐酸水苏碱对照品溶液，红色线为供试品溶液。盐酸水苏碱保留时间在4.5分钟附近，盐酸水苏碱为末端吸收，选择波长192nm，脑脉利颗粒成分较多，虽然供试品在盐酸水苏碱对照品峰位有出峰，但此处基底干扰大，前后杂质众多，不能确定
此处仅为盐酸水苏碱峰，包含其他杂质峰，方法专属性差，不能作为含量测定方法。
83.对比例3按照文献《hplc-elsd法测定益母草中的盐酸水苏碱》方法检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量
84.对照品溶液的制备：精密称取盐酸水苏碱对照品，加乙醇溶液制成每lml含盐酸水苏碱0.4mg的溶液，即得。
85.供试品溶液的制备：取脑脉利颗粒粉末(过二号筛)约lg,精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml时，称定重量，加热回流1.5h，取出放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
86.色谱条件：选用强阳离子交换键合硅胶为填充剂(agilent zorbax 300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.05mol/l醋酸铵(15：85)，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，用蒸发光散射检测器检测。
87.分别取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪。
88.表1按照文献方法检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量结果
[0089][0090]
结论：按照文献方法检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量，盐酸水苏碱峰形较差，且样品中盐酸水苏碱峰与其余杂峰未分开。
[0091]
综上所述，按照上述三个对比例检测方法和条件均不适用于检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的含量，可见脑脉利颗粒中其他杂质峰干扰盐酸水苏碱含量检测，需要进一步研究开发出合适的检测方法和色谱条件，满足分离度和峰形等多方面要求。
[0092]
测试例2流动相的考察
[0093]
实施例1不同流动相组分的考察
[0094]
对照品溶液制备：取盐酸水苏碱2mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
[0095]
供试品溶液制备：本品约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1mol/l的盐酸溶液40ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250w，频率33khz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用1mol/l的盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液20ml，置已处理好的732型氢型阳离子交换树脂柱(内径约0.9cm，柱高18cm)上，收集流出液，重新通过树脂柱，如上再重复二次，加水200ml分次洗涤至中性，弃去水洗液，再用浓氨试液-甲醇(20∶80)混合液100ml分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，加入水10ml，超声溶解后，过滤，即得。
[0096]
色谱条件：选用hplc-elsd检测方法，色谱柱为agilent zorbax 300-scx，4.6mm cx00-s，5.6；检测器为蒸发光散射器，流速为1.0ml/min，柱温为35℃。具体流动相条件如下表3。取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪。
[0097]
表2流动相的比较
[0098][0099]
结论：选用乙腈-0.2％冰醋酸溶液为流动相时，对照品未出峰，因此该流动相不适用于脑脉利颗粒中盐酸水苏碱的检测。选用乙腈-甲酸铵体系作为流动相，可以检测出盐酸水苏碱，且盐酸水苏碱峰形良好，且脑脉利颗粒中盐酸水苏碱峰与相邻色谱峰分离度良好。
[0100]
可见不同流动相成分会直接影响是否可检测到盐酸水苏碱。
[0101]
实施例2缓冲盐的种类的考察
[0102]
对照品溶液制备和供试品溶液制备同实施例1中供试品溶液制备方法。
[0103]
除流动相外，其余色谱条件同实施例1中色谱条件。
[0104]
取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，分别考察缓冲盐的种类及流动相的ph对色谱行为的影响。
[0105]
表3缓冲盐的种类及流动相的ph考察
[0106][0107][0108]
针对脑脉利中多种成分，流动相中不同ph值对盐酸水苏碱分离度和保留时间影响较大。
[0109]
结果显示，ph值在2.5～3.5范围内，盐酸水苏碱前后均有杂质峰，且ph为2.5时，盐酸水苏碱与后一杂质峰的分离度为1.28，小于1.5，分离度不好，影响含量测定的准确度。虽然ph值为2.8和3.5时，与前后杂质峰的分离度较好，但保留时间小于4分钟，保留时间较短，
在检测时会存在仪器、操作等多方面误差，导致结果受干扰，重现性差。
[0110]
ph值在2.0左右时，盐酸水苏碱理论塔板数(plates)较高，且盐酸水苏碱后面未见杂质峰，受杂质峰干扰小。
[0111]
因此，基于乙酸铵的缓冲范围为3.76-5.76，甲酸铵的缓冲范围为2.75-4.75，将ph值调整到2.0附近的范围，需要合适的缓冲体系进行，不同缓冲液的缓冲范围不同，需要选取合适缓冲范围的缓冲盐。故优选甲酸铵(用甲酸调节ph值为2.0)作为缓冲盐。
[0112]
综上所述，选择乙腈-甲酸铵作为流动相，可以检测和分离出盐酸水苏碱。
[0113]
测试例3供试品溶液制备方法的考察
[0114]
实施例3超声加过柱与单独超声方法的比较
[0115]
供试品溶液
①
的制备：取脑脉利颗粒2g，置于250ml锥形瓶中，加入40ml的0.1mol/l盐酸溶液，超声1小时，滤过，洗液并入滤液中，减压蒸干，精密加入溶剂20ml溶解，过滤，精密量取1ml，置于2ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度。
[0116]
供试品溶液
②
的制备：取脑脉利颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0117]
色谱条件：选用强阳离子交换键合硅胶为填充剂(agilent zorbax 300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，柱温为35℃；用蒸发光散射检测器检测。
[0118]
分别取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，考察使用不同配制方法的供试品溶液对色谱行为的影响。
[0119]
表4不同配制方法的供试品溶液察结果
[0120][0121]
结果显示：三份供试品溶液中均无杂质干扰盐酸水苏碱峰，可见选用色谱柱采用agilent zorbax 300-scx强阳离子交换键合硅胶，流动相采用乙腈-甲酸铵后，对供试品样品不需要经过柱子处理，可以有效分离和检测出样品中盐酸水苏碱含量，且不受其他杂质峰的影响。
[0122]
样品的制备过程中，供试品
①
中需要盐酸超声后，由于样品含有盐酸不能直接进样，需要蒸干等繁琐操作；而研究发现供试品
②
采用超声处理，操作简便，且不会影响最终样品的检测。
[0123]
实施例4超声和回流方法的比较
[0124]
取脑脉利颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0125]
色谱条件：选用强阳离子交换键合硅胶为填充剂(agilent zorbax 300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.03mol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至2.0)(15:85)，流速为0.8ml/min，柱温为35℃；用蒸发光散射检测器检测。
[0126]
分别取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，考察使用不同配制方法的供试品溶液对色谱行为的影响。
[0127]
分别考察供试品溶液超声不同时间以及加热回流提取对盐酸水苏碱含量测定的影响。具体结果见表5。
[0128]
表5提取方式和超声时间的考察
[0129]
处理方式与超声时间含量(mg/袋)超声20min65.2超声30min66.1超声40min64.2超声60min66.0回流2h62.6
[0130]
结论：供试品溶液经过回流2h与超声20min、30min、40min、60min时，含量测定结果无明显差异。
[0131]
超声和回流方法结果并没有差异，超声方法更为简便，且不需要经过复杂的过柱前处理。综上所述，研究发现超声方法提高操作简便性、减少检测所需样品量，大大减少处理样品的所需时间，提高了检测效率和便捷性。
[0132]
实施例5溶剂种类的考察
[0133]
除超声溶剂不同外，其他具体供试品溶液制备和色谱条件同实施例4。
[0134]
分别考察供试品溶液配置溶剂分别为50％乙醇、70％乙醇以及80％乙醇对盐酸水苏碱含量测定的影响。具体结果见表6。
[0135]
表6溶剂种类的考察
[0136]
溶剂含量(mg/袋)50％乙醇62.170％乙醇63.580％乙醇64.2纯化水62.4
[0137]
结论：当溶剂为50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇以及纯化水时，供试品溶液的含量测定结果无明显差异。
[0138]
测试例4流动相条件的优化
[0139]
实施例6流速对检测结果的影响
[0140]
供试品溶液制备：取脑脉利颗粒2g，置于250ml锥形瓶中，加入40ml的0.1mol/l盐酸溶液，超声1小时，滤过，洗液并入滤液中，减压蒸干，精密加入溶剂20ml溶解，过滤，精密量取5ml，置于20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度。
[0141]
色谱条件：选用强阳离子交换键合硅胶为填充剂(agilent zorbax 300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm)，流动相为0.04mol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至2.0)-乙腈(85：15)，柱温为35℃；用蒸发光散射检测器检测。
[0142]
取供试品溶液20～30μl注入液相色谱仪，分别考察流速为1.2ml/min、1.0ml/min和0.8ml/min对色谱行为的影响。
[0143]
结果发现，在流速为0.8ml/min和1.0ml/min时，基线良好；而流速为1.2ml/min时，基线上移，且影响盐酸水苏碱的分离，基质干扰严重。
[0144]
可见减小流动相流速，保留时间延长，基底干扰小。
[0145]
实施例7缓冲盐的浓度考察
[0146]
除流动相外，其余供试品溶液制备方法和色谱条件同实施例6。流动相流速为0.8ml/min。
[0147]
取供试品溶液注入液相色谱仪，分别考察流动相中甲酸铵浓度为0.04mol/l、0.03mol/l和0.02mol/l对色谱行为的影响。
[0148]
表7缓冲盐的浓度考察结果
[0149][0150]
结论：流动相a为0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)时，样品中盐酸水苏碱峰与前一峰的分离度最好，理论塔板数最高，优选0.03mol/l甲酸铵作为缓冲盐的浓度。
[0151]
实施例8乙腈-甲酸铵不同比例的优化
[0152]
除流动相外，其余供试品制备和色谱条件同上述实施例7。
[0153]
调整乙腈-甲酸铵的比例，比较其对分离效果的影响。
[0154]
选择流动相为0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)-乙腈(83：17)，结果见附图12。
[0155]
流动相为0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)-乙腈(87：13)，结果见附图13。
[0156]
同时分别针对0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)-乙腈80:20和90:10比例，进行考察，其主要影响盐酸水苏碱的保留时间，与其他杂质峰有较好的分离度。
[0157]
结果可见，乙腈-甲酸铵比例中，乙腈比例越低，盐酸水苏碱保留时间越长。
[0158]
实施例9ph范围的优化
[0159]
除流动相条件外，其余样品制备和色谱条件等方法同实施例7。
[0160]
表8 ph范围的影响
[0161][0162]
结果图14显示在ph值为2.1时，在保留时间12分钟左右盐酸水苏碱和其他杂质峰完全重合。ph为2.05时，保留时间为11.698min峰的盐酸水苏碱与之前相邻较大杂质峰有很好的分离。
[0163]
实施例10ph范围的确定
[0164]
除流动相条件外，其余样品制备和色谱条件等方法同实施例7。
[0165]
其中流动相均为流速为0.8ml/min。
[0166]
表9 ph值范围的确定
[0167][0168][0169]
结果显示，ph值为1.95～2.05范围内，盐酸水苏碱和其他杂质峰分离度及峰形均较好。
[0170]
可见ph值影响盐酸水苏碱和其他干扰杂质峰能否分离。
[0171]
上述试验是在不同仪器下操作的，保留时间较之前实施例有所偏差，属于正常的仪器误差。
[0172]
实施例11含量测定方法学验证
[0173]
对照品溶液的制备：取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml约含0.2mg的溶液，即得。
[0174]
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物，混匀，取适量，研细，取约1g，精密称定，置250ml具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0175]
色谱条件与系统适用性试验：以强阳离子交换键合硅胶为填充剂(agilent zorbax300-scx，4.6mm
×
250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，以乙腈-0.03mol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至2.0)(15：85)为流动相，流速为每分钟0.8ml，柱温为35℃，用蒸发光散
射检测器检测。理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于2000。
[0176]
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl，供试品溶液20～30μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
[0177]
1)专属性
[0178]
空白溶剂和缺益母草阴性样品在盐酸水苏碱的出峰位置未出现干扰峰，不干扰本品的含量检测。表明建立的方法专属性好。
[0179]
2)精密度
[0180]
进样体积为5μl时对照品溶液保留时间rsd值为0.07％，小于1.0％，峰面积对数rsd值为0.3％，小于5.0％；进样体积为20μl时对照品溶液保留时间rsd值为0.3％，小于1.0％，峰面积对数rsd值为0.2％，小于5.0％。故进样精密度良好。
[0181]
12份供试品含量均不少于25mg/袋，且含量的rsd值为3.3％，小于5.0％，故中间精密度良好。
[0182]
进样体积为5μl时对照品溶液图谱见附图18。
[0183]
进样体积为20μl时对照品溶液图谱见附图19。
[0184]
3)稳定性试验
[0185]
供试品溶液在室温条件下放置48小时，主峰峰面积对数rsd值为0.9％，小于5.0％；对照品溶液在室温条件下放置48小时，主峰峰面积对数rsd值为0.5％，小于5.0％；故供试品溶液和对照品溶液在室温条件下放置48h稳定性良好。
[0186]
4)线性范围
[0187]
对照品溶液分别进样3μl、5μl、10μl、15μl、20μl、30μl，测定峰面积，以进样量对数为横坐标(x)，以峰面积对数为纵坐标(y)，求得标准曲线，进行线性回归分析，相关系数(r)应符合标准，考察线性。
[0188]
对照品溶液在618.41ng～6184.13ng范围内，以进样量对数为横坐标(x)，以峰面积对数为纵坐标(y)，进行线性回归分析，相关系数(r)为0.9999，故线性关系良好。
[0189]
5)准确度
[0190]
80％、100％和120％三个浓度各三份样的回收率在95％～105％的范围内，9份回收率的rsd值为3.0％，小于5.0％，故准确度良好。
[0191]
6)重复性
[0192]
6份供试品含量均不少于25mg/袋，且含量的rsd值为1.5％，小于5.0％，故重复性良好。
[0193]
7)耐用性
[0194]
具体条件为：不同流速(
±
0.1ml/min)，即0.7ml/min、0.8ml/min和0.9ml/min比较。
[0195]
不同柱温(
±
5℃)，即30℃、35℃和40℃条件比较。
[0196]
其他如流动相比例(
±
2％)、ph值(
±
0.05)、不同色谱柱、不同进样体积(30μl)条件下，空白溶剂和缺益母草阴性样品对含量测定均无干扰，对照品溶液的理论塔板数均符合规定，供试品的含量均不少于25mg/袋，且含量的rsd值为2.9％，小于5.0％，故本方法耐用性良好。
[0197]
8)多批样品检测
[0198]
检测10批样品含量均不少于25mg/袋，符合规定。
[0199]
实施例12不同检测方法检测脑脉利颗粒中盐酸水苏碱含量
[0200]
方法一：原脑脉利颗粒检测方法标准如下
[0201]
供试品溶液(tlc薄层法)的制备：取装量差异项下本品约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1mol/l的盐酸溶液40ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250w，频率33khz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用1mol/l的盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液20ml，置已处理好的732型氢型阳离子交换树脂柱(内径约0.9cm，柱高18cm)上，收集流出液，重新通过树脂柱，如上再重复二次，加水200ml分次洗涤至中性，弃去水洗液，再用浓氨试液-甲醇(20∶80)混合液100ml分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加盐酸-乙醇(1∶99)混合溶液使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。
[0202]
对照品溶液制备：将盐酸水苏碱对照品用盐酸-乙醇(1:99)混合溶液制成每1ml含有5mg的溶液。
[0203]
按照药典，采用薄层色谱法，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷稀碘化铋钾溶液，对其进行扫描，测量供试品吸收度与对照品吸收度，计算盐酸水苏碱含量。
[0204]
方法二：对照品溶液与供试品溶液(hplc-elsd方法)的制备以及色谱条件同实施例7，流动相为乙腈-0.03mol/l甲酸铵(用甲酸调节ph值至2.0)(15:85)。
[0205]
取对照品溶液与供试品溶液(hplc-elsd方法)注入液相色谱仪；对样品检测结果进行对比。
[0206]
表10样品检测结果
[0207][0208]
本试验中方法一rsd在10％左右，样品量需要4g，样品处理需要超声-过滤-上柱洗脱-溶解，操作总时间需要1.5天。方法二中rsd在5％左右，样品量为1g，操作总时间仅为1h。方法二检测盐酸水苏碱含量较方法一，脑脉利颗粒(每袋装10g)，限度由17mg/袋提高至每袋含益母草以盐酸水苏碱(c7h
13
no2·
hcl)计，不得少于25mg。
[0209]
结论：经过对脑脉利颗粒多批次检测，hplc-elsd方法较tlc薄层法检测灵敏度和限度均提高。方法二相比方法一，准确度好，精密度高，减少样品检测量，节省检测时间，无需过柱等繁琐操作，节省检测成本，操作简单可行。
[0210]
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。