一种伴矿景天细胞壁纤维素对Cd胁迫的响应

一种伴矿景天细胞壁纤维素对cd胁迫的响应
技术领域
1.本发明涉及重金属技术领域，具体涉及一种伴矿景天细胞壁纤维素对cd胁迫的响应。


背景技术：

2.随着工矿企业、农业的蓬勃发展，大量重金属废水进入土壤环境，被污染的土壤面积逐年增大，人类生命健康安全也随之受到严重威胁。根据生态环境部发布的《全国土壤污染状况调查公报》
1.表明，我国土壤cd污染严重超标，点位超标率高达7.0％。cd具有较强生物毒性，并且在土壤中迁移能力较强、容易累积、降解困难，使其容易累积于作物而随之进入人类身体中，十分危害人类身体健康。而由于人口增长与耕地减少的压力，被cd污染的土地仍然被用于农业生产。因此保障粮食安全生产、降低cd累积毒害的风险，是目前重金属污染修复研究的重点。在cd污染治理过程中，传统物化方法花费高昂且可能存二次污染风险，仅仅只适用于小规模修复。
3.植物修复技术是目前应用广泛，并对环境友好的重金属修复治理的重要手段，植物修复具有绿色生态、价格低廉且对环境无干扰的优势，在矿区生态修复中应用较广泛。超富集植物是目前植物修复技术中的一个重要研究热点，伴矿景天作为镉超富集植物，除了可以超量吸收镉外，还具有栽种技术成熟、对环境美化、不进入人类食物链网等优势，受到广大重金属污染修复研究者的关注。
4.细胞壁是细胞外围的一圈亚细胞组织，响应镉胁迫的功能信号分子和代谢所在的位点大部分存在于细胞壁上
2.，研究表明植物细胞可通过细胞壁吸收大部分的重金属离子从而达到其进入细胞内毒害其他细胞器的作用，如海州香薷根细胞壁可累积大量的铜离子
2.。细胞壁的各种组分尤其是多糖在固定重金属方面起着重要作用。细胞壁约90％为多糖类组分，其主要类型为果胶、纤维素和半纤维素。纤维素是植物细胞壁的基本组成成分之一，纤维素构成了主要的细胞壁骨架；半纤维素是存在于大多数植物细胞壁的一类由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，在纤维素微纤丝之间起到一个锁链的链接作用
7.。多糖可提供重金属离子结合位点，对重金属离子的吸附络合起着关键作用。郭军康
3.等研究表明多糖组分吸附的重金属cd占细胞壁cd总含量的70.36％～82.25％(以番茄为对象)。王梦等研究表明茶树根细胞壁果胶可吸附高达25％的cd
4.；徐劼等用果胶酶处理芹菜细胞壁降低其细胞壁果胶含量，cd累积量相对降低了约40％
5.。多糖在植物细胞壁对cd的吸收和积累，缓解cd的毒害作用中发挥着重要作用。
5.近年来，果蔬植物细胞壁纤维素组分对重金属累积的研究较多，伴矿景天细胞壁纤维素组分与重金属cd富集相关研究报道却较少，本发明以不同cd浓度土壤种植条件下的伴矿景天为供试植物，通过盆栽试验研究其对重金属cd的富集特征，分析不同cd处理浓度下伴矿景天细胞壁纤维素组分含量、cd累积量等，研究伴矿景天细胞壁纤维素组分对cd胁迫的响应，以期进一步揭示伴矿景天细胞壁纤维素组分在cd累积过程中的作用及机制。
6.目前，缺乏一种超富集植物伴矿景天细胞壁纤维素组分含量对镉胁迫响应的检测
方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供了一种伴矿景天细胞壁多糖对镉胁迫的响应的检测方法。
8.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种伴矿景天细胞壁多糖对镉胁迫的响应的检测方法，包括如下步骤：(1)以伴矿景天为材料，通过盆栽实验；
9.(2)研究不同cd浓度处理下，伴矿景天地上部与地下部细胞壁半纤维素ⅰ、半纤维素ⅱ、半纤维素和纤维素含量对cd胁迫的响应；
10.(3)对细胞壁纤维素含量与植株cd累积量进行相关分析。
11.进一步地，在步骤(1)中，盆栽中土壤质量为3kg，土壤初步研磨过筛；共6个处理浓度，设3次重复；供试土壤：云南农业大学后山土壤，土壤类型为山地红壤。
12.进一步地，在步骤(2)中，所述的cd的浓度为0mg/kg，25mg/kg，50mg/kg，75mg/kg，100mg/kg，200mg/kg。
13.更进一步地，在步骤(2)中，细胞壁纤维素与半纤维素的分离及提取：
14.step1称取0.1g细胞壁样品，加入20ml0.5％草酸铵缓冲液于沸水中水浴加热60min，经5min高速离心后，提取上清液。重复两次相同操作，合并上清液即为总果胶；
15.step2纤维素的提取参考zhong等方法进行，完成果胶提取后剩余的沉淀用去离子水冲洗干净，冷冻干燥后加入10毫升4％koh溶液于室温下浸提8h后高速离心，重复3次合并上清液合并即为半纤维素ⅰ类；同样的操作方法用10毫升24％koh溶液提取半纤维素ⅱ类。
16.step3经步骤(1)和步骤(2)后，所剩余沉淀用去离子水离心反复冲洗干净后，进行冷冻干燥，干燥后的固体残余即为细胞壁中纤维素。将纤维素配制为0.8mg/ml的溶液，待测。
17.进一步地，在步骤(2)中，细胞壁半纤维素与纤维素的测定，以葡萄糖为标准物质，采用苯酚硫酸比色法进行测定。
18.进一步地，在步骤(3)中，本实验数据常规分析采用excel软件进行，在spss数据分析软件上进行差异显著性检测方法与相关性分析。
19.进一步地，在步骤(3)中，所述的检测方法为duncan氏新复极差法。
20.有益效果：本发明的伴矿景天细胞壁中纤维素组分与半纤维素组分参与了植物富集重金属cd过程的吸收，滞留与转运过程，纤维素主要参与其固定于转运过程，半纤维素ⅰ类主要参与其固定，半纤维素ⅱ类主要参与其转运过程。随cd处理浓度的增加，伴矿景天细胞壁半纤维素ⅰ、半纤维素ⅱ类、半纤维素和纤维素含量均呈现先增后减趋势。
附图说明
21.图1为本发明的不同cd浓度处理下伴矿景天细胞壁半纤维素ⅰ类、ⅱ类总糖含量变化图。
22.图2为本发明的伴矿景天细胞壁半纤维素总糖含量图。
23.图3为本发明的伴矿景天细胞壁纤维素总糖含量图。
24.图4为本发明的不同处理的植株体内cd含量图。
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
26.实施例1
27.本发明的一种伴矿景天细胞壁多糖对镉胁迫的响应的检测方法，包括如下步骤：(1)以伴矿景天为材料，通过盆栽实验；盆栽中土壤质量为3kg，土壤初步研磨过筛；共6个处理浓度，设3次重复；供试土壤：云南农业大学后山土壤，土壤类型为山地红壤。
28.(2)研究不同cd浓度处理下，伴矿景天地上部与地下部细胞壁半纤维素ⅰ、半纤维素ⅱ、半纤维素和纤维素含量对cd胁迫的响应；所述的cd的浓度为0mg/kg，25mg/kg，50mg/kg，75mg/kg，100mg/kg，200mg/kg。
29.细胞壁纤维素与半纤维素的分离及提取：
30.step1称取0.1g细胞壁样品，加入20ml0.5％草酸铵缓冲液于沸水中水浴加热60min，经5min高速离心后，提取上清液。重复两次相同操作，合并上清液即为总果胶；
31.step2纤维素的提取参考zhong等方法进行，完成果胶提取后剩余的沉淀用去离子水冲洗干净，冷冻干燥后加入10毫升4％koh溶液于室温下浸提8h后高速离心，重复3次合并上清液合并即为半纤维素ⅰ类；同样的操作方法用10毫升24％koh溶液提取半纤维素ⅱ类。
32.step3经步骤(1)和步骤(2)后，所剩余沉淀用去离子水离心反复冲洗干净后，进行冷冻干燥，干燥后的固体残余即为细胞壁中纤维素。将纤维素配制为0.8mg/ml的溶液，待测。
33.细胞壁半纤维素与纤维素的测定，以葡萄糖为标准物质，采用苯酚硫酸比色法进行测定。
34.(3)对细胞壁纤维素含量与植株cd累积量进行相关分析。
35.本实验数据常规分析采用excel软件进行，在spss数据分析软件上进行差异显著性检测方法与相关性分析。所述的检测方法为duncan氏新复极差法。
36.1.材料与方法
37.1.1供试材料
38.于野外采集云南兰坪铅锌矿区伴矿景天植株，扦插育苗。植株成活生根后，将植株移栽至cd处理土壤，土壤cd处理浓度设为0，25，50，75，100，200(单位：mg/kg)。盆栽中土壤质量为3kg，土壤初步研磨过筛；共6个处理浓度，设3次重复。供试土壤：云南农业大学后山土壤，土壤类型为山地红壤，土壤的理化性质如表1所示：
39.表1
[0040][0041]
1.2试验设计
[0042]
本实验于云南农业大学东校区自搭建大棚中进行盆栽实验，并进行遮荫处理。盆栽试验盆规格为直径30cm，高度23cm，每盆移栽3棵伴矿景天植株，并控制植株生长密度。盆栽每2天补水一次，补水量依照土壤湿度确定。伴矿景天植株生长90天后进行试验样品采集，生长120天后收获植株。先用自来水冲洗植株表面泥土后，分拣植株为地上与地下两部
分，再用去离子水反复冲洗3次。擦干植株表面水分，于烘箱105℃杀青半小时，在70℃烘至恒重，测定所采样品的干重。用研钵研碎所制干样，过0.25mm筛并装袋备用。同时采用抖土法采集植物根际土样自然风干，过筛后装袋备用。
[0043]
1.3测定指标与方法
[0044]
1.3.1cd含量的测定
[0045]
植物体内cd含量测定先后采用hno3‑
hc1o4(v:v＝1:4)消解植物干样，土壤全cd含量的测定，先后用王水
‑
hc1o4(v:v＝1:4)消解土样，采用dtpa法连续浸提测定土壤有效态cd含量，以上吸光度的测定均采用原子吸收分光光度法。
[0046]
1.3.2植株细胞壁样品提取与制备
[0047]
细胞壁的提取参考zhong等的方法，采用粉碎细胞结构，液氮冷冻植物鲜样，提取细胞内物质的方法。
[0048]
1.3.3细胞壁纤维素与半纤维素的分离及提取
[0049]
(1)称取0.1g细胞壁样品，加入20ml0.5％草酸铵缓冲液于沸水中水浴加热60min，经5min高速离心后，提取上清液。重复两次相同操作，合并上清液即为总果胶；
[0050]
(2)纤维素的提取参考zhong等
5.方法进行，完成果胶提取后剩余的沉淀用去离子水冲洗干净，冷冻干燥后加入10毫升4％koh溶液于室温下浸提8h后高速离心，重复3次合并上清液合并即为半纤维素ⅰ类；同样的操作方法用10毫升24％koh溶液提取半纤维素ⅱ类。
[0051]
(3)经(1)和(2)步骤后，所剩余沉淀用去离子水离心反复冲洗干净后，进行冷冻干燥，干燥后的固体残余即为细胞壁中纤维素。将纤维素配制为0.8mg/ml的溶液，待测。
[0052]
1.3.4细胞壁纤维素与半纤维素的测定方法
[0053]
细胞壁半纤维素与纤维素的测定，参考彭程等人的方法进行，以葡萄糖为标准物质，采用苯酚硫酸比色法进行测定。
[0054]
1.4数据处理
[0055]
本实验数据常规分析采用excel软件进行，在spss数据分析软件上进行差异显著性检测(duncan氏新复极差法)与相关性分析。
[0056]
2结果与分析
[0057]
2.1植株细胞壁半纤维素ⅰ类、ⅱ类含量
[0058]
不同cd浓度处理显著增加了伴矿景天地上部和地下部细胞壁半纤维素ⅰ类含量，且伴矿景天植株地上部分细胞壁半纤维素ⅰ类含量均高于地下部分细胞壁半纤维素ⅰ类含量(图1)。随着重金属cd处理浓度上升，伴矿景天细胞壁半纤维素ⅰ类含量在一定范围内先增后减。在50mg/kg浓度条件下，植株地上部和地下部细胞壁中半纤维素ⅰ类含量最大，分别为0.25和0.23g/g，与对照相比显著增加了2.4倍和4.1倍(p＜0.05)；在25mg/kg浓度条件下，植株细胞壁中半纤维素ⅰ类含量最小。
[0059]
伴矿景天植株地上部分细胞壁半纤维素ⅱ类含量均低于地下部分细胞壁半纤维素ⅱ类含量，且随着重金属cd处理浓度上升，伴矿景天细胞壁半纤维素ⅱ类含量均先增后减(图1)。在75mg/kg cd浓度处理下，植株细胞壁中半纤维素ⅱ类含量均达到最大，分别为0.23和0.26g/g与对照相比显著增加了2.4和1.3倍(p＜0.05)；在200mg/kg cd浓度处理下，植株细胞壁中半纤维素ⅱ类含量均为最小，分别为0.14和0.20g/g。图1为本发明的不同cd浓度处理下伴矿景天细胞壁半纤维素ⅰ类、ⅱ类总糖含量变化图。
[0060]
2.2伴矿景天细胞壁半纤维素、纤维素含量
[0061]
不同cd浓度处理显著增加了伴矿景天地上部和地下部细胞壁半纤维素含量，且伴矿景天植株地上部细胞壁半纤维素含量均低于地下部含量(图2)。随着cd处理浓度上升，伴矿景天细胞壁半纤维素组分含量均为先增后减。在50mg/kg浓度条件下，植株细胞壁中半纤维素含量均达到最大，分别为0.43与0.46g/g，与对照相比显著增加了1.21倍和0.73倍(p＜0.05)。图2为本发明的伴矿景天细胞壁半纤维素总糖含量图3.伴矿景天细胞壁纤维素总糖含量图。
[0062]
不同镉处理浓度下，伴矿景天地上部细胞壁纤维素含量均低于地下部，且随着cd处理浓度增加，细胞壁纤维素组分含量均先增后减，如图3所示。伴矿景天地下部分细胞壁纤维素，在50mg/kg浓度条件下，其含量达到最大，约为地上部分细胞壁纤维素含量的3.5倍。在25mg/kg浓度条件下，其含量达到最小，约为地上部分细胞壁纤维素含量的3倍。与对照相比，均存在显著差异；伴矿景天地上部分细胞壁纤维素，在75mg/kg浓度条件下，其含量达到最大，约为地下部分细胞壁纤维素含量的0.5倍。在200mg/kg浓度条件下，其含量达到最小，约为地下部分细胞壁纤维素含量的0.1倍。此时，地上部与地下部细胞壁纤维素含量差距最大。
[0063]
2.3伴矿景天cd积累特征
[0064]
不同处理的植株体内cd含量图得，不同镉浓度处理下，伴矿景天地上部和地下部镉含量相比于对照均显著增大。地上部中的cd含量与植株地下部的cd含量差距明显，地上部分累积量均高于地下部分。植株地上部分cd含量随土壤cd处理浓度的升高而先增后减；在0
‑
100mg/kg处理浓度范围内，植株地下部分cd含量出现先增后减，在75mg/kg浓度条件下，植株地上部分与地下部分cd含量均达到最大。与对照相比，75mg/kg浓度条件下，植株体内cd含量极显著增加。
[0065]
随土壤cd浓度的升高，伴矿景天植株生物量在一定范围先增后减(表2)。生物量。
[0066]
75mg/kgcd处理浓度下伴矿景天地上部分生物量最大，与对照相比显著增加20％(p<0.05)。随着cd浓度的增加，伴矿景天地上部与地下部cd累积量亦先增后减(表2)，且在75mg/kg处理浓度下，伴矿景天植株地上部分与地下部分cd累积量均最大。不同浓度处理下伴矿景天生物量及累积特征如表2所示：
[0067]
表2
[0068][0069]
同时，伴矿景天植株的富集系数，转运系数与生物富集系数，除在200mg/kg处理浓
度下，伴矿景天的生物富集系数小于1，仅为0.93，其余数值均大于1(表2)。对照组(即未经cd处理时)伴矿景天植株的富集系数与生物富集系数最大，富集系数为6.25，生物富集系数为4.3。当cd处理浓度为200mg/kg时富集系数最小，为1.28；当cd处理浓度为100mg/kg时转运系数最大，为5.02，为25mg/kg时最小，仅1.04。
[0070]
2.4伴矿景天cd含量与细胞壁纤维素组分的相关性分析
[0071]
由表3可知，伴矿景天植株地上部细胞壁中半纤维素含量，纤维素含量与植株地上部cd累积量呈显著正相关，相关系数分别为0.815与0.840(p＜0.05)；植株地下部细胞壁中半纤维素ⅱ类含量与地下部cd累积量呈极显著正相关相关系数分别为0.922(p＜0.01)。伴矿景天cd含量与细胞壁纤维素各组分的相关性如表3所示：
[0072]
表3
[0073][0074]
4讨论
[0075]
本发明中，植株体内cd累积量与cd处理浓度呈现明显的正相关趋势。植株根系将土壤中固定态cd活化为交换态，再主动或被动地将其吸收进入植株地下部，向上运输至植株地上部分储存。在各类超富集植物中，植株地上部分对重金属的累积能力要强于地下部分。本发明中，伴矿景天植株地上部分cd累积量显著大于地下部分cd累积量。
[0076]
发明表明，植物细胞壁参与了其对重金属cd的富集过程，是响应重金属胁迫的信号点与代谢点，参与了植物对重金属胁迫的响应过程。重金属胁迫环境中，植物细胞壁富集大量重金属离子，以阻止重金属进入细胞原生质中影响细胞器的正常生理活性，如海州香薷根细胞壁对铜离子的大量富集。在水－土壤－植物系统中的cd迁移性很强，而纤维素、半纤维素这些细胞壁组成物质具有大量的羟基、羧基、醛基等活泼官能团，在cd进入细胞的过程中，大部分cd被这些官能团吸附，固定在细胞壁上，使大量的cd滞留于细胞壁而无法进入细胞质中，从而减轻镉对植株的毒害作用。故，纤维素与半纤维素参与了植物对cd的吸收与固定。发现伴矿景天吸收的cd易于向地上部分转运和累积。细胞壁是伴矿景天地上部储存镉的主要部位。而本发明中，植株地上部分cd累积量同样高于地下部分cd累积量；细胞壁纤维素含量，半纤维素含量与植株cd富集量关系密切，在土壤cd处理浓度上升的过程中，三者均呈现先增后减趋势。植株地上部分细胞壁中纤维素含量和半纤维素含量均低于植株地下部分细胞壁中的纤维素含量和半纤维素含量，伴矿景天植株细胞壁纤维素和半纤维素含量与植株的cd累积量呈正相关。纤维素作为化学惰性细胞壁多糖物质与介于化学惰性的纤维素与和电离官能团众多的果胶之间的半纤维素，其含量变化随植物cd的累积量变化而变化。同时，细胞壁中半纤维素ⅰ类含量升高，根系细胞壁对cd滞留量也随之增加，减少其向地上部转运的cd，亦符合本实验中，伴矿景天地上部分细胞壁中半纤维素ⅰ类含量高于其地下部分的结果。
[0077]
综上所述，伴矿景天细胞壁中纤维素、半纤维素组分参与了植物吸收、滞留与转运
cd的过程，其中纤维素主要参与植物固定、转运cd的过程，半纤维素ⅰ类主要参与植物固定cd的过程，半纤维素ⅱ类主要参与植物转运cd的过程。
[0078]
4结论
[0079]
随cd处理浓度的增加，伴矿景天细胞壁半纤维素ⅰ、半纤维素ⅱ类、半纤维素和纤维素含量均呈现先增后减趋势。与对照相比，5个cd浓度处理下地上部与地下部细胞壁中半纤维素ⅰ类含量分别增加了1.6～2.5倍和2.0～4.1倍(p<0.05)；半纤维素ⅱ类含量在75mg/kg cd处理时最高，与对照相比显著增加2.4和1.3倍。
[0080]
地上部细胞壁半纤维素ⅰ含量高于地下部，而半纤维素ⅱ类、半纤维素都低于地下部；地上部和地下部细胞壁半纤维素ⅰ、半纤维素ⅱ类含量、地下部细胞壁半纤维素和纤维素含量都在50mg/kg cd浓度处理时最高。
[0081]
随cd处理浓度的增加，伴矿景天地上部和地下部cd含量、cd累积量随cd处理浓度的增加先增后减，都在75mg/kg cd浓度处理时最高。且地上部分cd含量、累积量均大于地下部分。
[0082]
伴矿景天细胞壁半纤维素ⅰ类含量影响其对重金属cd的固定与转运，半纤维素ⅱ类含量、半纤维素组分和纤维素组分都影响伴矿景天对重金属cd的吸收与转运。
[0083]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。