同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的荧光传感方法和试剂盒

1.本发明涉及生物标志物检测领域，特别是涉及一种同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的荧光传感方法和试剂盒。


背景技术：

2.过度的体力劳动与精神压力往往诱发多种疾病，严重时甚至危害人体健康，受到人们广泛的重视。正常情况下，人体的皮质醇/血清睾酮比值大约为3，而当人体发生如疲劳等生理变化时，皮质醇含量升高，血清睾酮含量降低，其相应的比值随之升高；此外，正常状态下，人体血液中肌酸激酶同工酶(ck
‑
mb)含量为1
‑
20ng/ml，但在心肌梗死发生后会立即升高，并在4
‑
6小时内出现异常，含量提高至正常状况的十倍。对人体血清样本中的皮质醇、血清睾酮以及肌酸激酶同工酶含量进行联合检测，有助于提高人体异常状态诊断的准确性，及时检测并预防因人体疲劳而导致的生理损伤，保护人体健康。因此，及时、快速、灵敏地检测皮质醇、血清睾酮以及肌酸激酶同工酶含量具有重要意义。
3.多种检测方法被用于定量检测反应人体疲劳状态的生物标志物。传统的检测方法，如酶联免疫检测法(elisa)、放射免疫检测法、酶活力法等在临床诊断和治疗过程中被广泛应用，但其往往需要复杂的样品前处理过程、专业的技术操作人员以及较长的检测时间(5
‑
6小时)。此外，这些检测方法往往只能用于检测单一的目标物，而无法全面地反应人体的身体状态。因此，寻找一种能够多目标物、灵敏快速的检测方法，用于检测人体血清中生物标志物，是十分重要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的荧光传感方法和试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，通过提供一种简便灵敏、快速准确的多目标物检测方法，以实现对反应人体疲劳与压力状态的生物标志物的快速检测。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的荧光传感方法，包括以下步骤：
7.(1)制备磁珠
‑
适配体
‑
互补链复合物：将链霉亲和素化的磁珠与生物素化的皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶适配体相结合，振荡孵育，得到磁珠
‑
适配体复合物；向磁珠
‑
适配体复合物中加入互补链，振荡孵育，得到磁珠
‑
适配体
‑
互补链复合物；
8.(2)制备dna四面体镊子：将四条dna四面体镊子链相互混合，振荡混匀，孵育混合溶液，得到dna四面体镊子探针；
9.(3)目标物与互补链的竞争：将待测样品加入步骤(1)所得的磁珠
‑
适配体
‑
互补链复合物中，振荡孵育，通过磁分离步骤得到游离的互补链；
10.(4)expar扩增反应：将步骤(3)所得的游离的互补链与expar扩增模板相混合，加
入缓冲液后90℃混合孵育，并缓慢降至室温，之后加入内切酶与聚合酶，进行扩增；
11.(5)互补链
‑
dna镊子反应：将步骤(4)所得的扩增产物与步骤(2)所得的dna四面体镊子探针相混合，孵育；
12.(6)读数：测量反应体系的荧光值。参数设置分别为：激发波长：480nm，发射波长：510
‑
580nm；激发波长：575nm，发射波长：600
‑
680nm；激发波长：640nm，发射波长：660
‑
730nm。
13.优选的是，还包括制定标准曲线的步骤，所述标准曲线按照步骤(1)
‑
(6)的所述，检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的标准溶液，测得反应体系的荧光值，以制定皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶标准曲线。
14.优选的是，步骤(1)中，皮质醇适配体的核苷酸序列如seq id no：1所示；血清睾酮适配体的核苷酸序列如seq id no：2所示；肌酸激酶同工酶适配体的核苷酸序列如seq id no：3所示；皮质醇互补链的核苷酸序列如seq id no：4所示；血清睾酮互补链的核苷酸序列如seq id no：5所示；肌酸激酶同工酶互补链的核苷酸序列如seq id no：6所示。
15.上述皮质醇适配体的核苷酸序列为5
’‑
gggggggaatggatccacatccatggatgggcaatgcggggtggagaatggttgccgcacttcggcttcactgc agacttgacgaagctt
‑
3(seq id no：1)；
16.上述血清睾酮适配体的核苷酸序列为5
’‑
ggggggtagggaagagaaggacatatgattgcgtgggtaggaaggggcggtgtgatctgaatcgttcgattgac tagtacatgaccacttga
‑
3(seq id no：2)；
17.上述肌酸激酶同工酶适配体的核苷酸序列为5
’‑
ggggggtgggtgggggatctcggaggatgcttttagggggttggg
‑
3(seq id no：3)；
18.上述皮质醇互补链的核苷酸序列为5
’‑
tgcagtgaagccgaagtgcgg
‑3’
(seq id no：4)；
19.上述血清睾酮互补链的核苷酸序列为5
’‑
atcacaccgccccttcctacc
‑3’
(seq id no：5)；
20.上述肌酸激酶同工酶互补链的核苷酸序列为5
’‑
tccgagatcccccaccca
‑3’
(seq id no：6)；
21.优选的是，步骤(2)中，四条dna四面体镊子链分别为dna1、dna2、dna3和dna4，其对应的核苷酸序列分别如seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10所示。
22.dna1:5
’‑
fam
‑
cgccatagtagacgtatcaccaggcagttgagacgaacattcctaagtctgaaatttatcacc
‑
bhq1
‑3’
(seq id no：7)；
23.dna2:
[0024]5’‑
rox
‑
cttgctacacgattcagacttaggaatgttcgacatgcgagggtccaataccgacgattacag
‑
bh q2
‑3’
(seq id no：8)；
[0025]
dna3:
[0026]5’‑
cy5
‑
tagagacggtattggaccctcgcatgactcaactgcctggtgatacgagagcc
‑
cy3
‑3’
(seq id no：9)；
[0027]
dna4:
[0028]5’‑
cgtgtagcaagccgcacttcggcttcactgcatgcggctgtaatcgactctatgggtgggggatctcggaacc caggctcactactatggcgggtaggaaggggcggtgtgatctaccggtgataaatc
‑3’
(seq id no：10)；
[0029]
优选的是，步骤(2)中，dna1、dna2、dna3和dna4等摩尔比混合后，将混合溶液加热至95℃孵育5min，然后在1min内将其冷却至4℃，孵育2h。
[0030]
优选的是，步骤(3)中，所述待测样品和所述磁珠
‑
适配体
‑
互补链复合物等体积混合后，于30℃、800
‑
1000rpm的条件下孵育0.8
‑
1.2h，磁分离得到上清液，即得所述游离的互补链。
[0031]
优选的是，步骤(4)中，扩增条件为37℃孵育80min，并在80℃孵育20min，使expar反应停止，扩增产物放置于4℃保存。
[0032]
优选的是，步骤(5)中，孵育条件为：25℃混合孵育10min。
[0033]
优选的是，步骤(5)中，所述expar扩增模板包括：
[0034]
皮质醇扩增模板，其核苷酸序列如seq id no：11所示；
[0035]
血清睾酮扩增模板，其核苷酸序列如seq id no：12所示；
[0036]
肌酸激酶同工酶扩增模板，其核苷酸序列如seq id no：13所示。
[0037]
皮质醇扩增模板的核苷酸序列为：
[0038]5’‑
ccgcacttcggcttcactgcacctcagcccgcacttcggcttcactgca
‑3’
(seq id no：11)；
[0039]
血清睾酮扩增模板的核苷酸序列为：
[0040]5’‑
ggtaggaaggggcggtgtgatcctcagcggtaggaaggggcggtgtgat
‑3’
(seq id no：12)；
[0041]
肌酸激酶同工酶扩增模板的核苷酸序列为：
[0042]5’‑
tgggtgggggatctcggacctcagctgggtgggggatctcgga
‑3’
(seq id no：13)。
[0043]
本发明还提供一种同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于，包括所述的磁珠
‑
适配体
‑
互补链复合物、dna四面体镊子以及expar扩增模板。
[0044]
本发明公开了以下技术效果：
[0045]
本发明在expar
‑
dna四面体镊子荧光恢复的过程中优化了expar扩增模板的加入量、kf dna聚合酶的加入量、dna四面体镊子的孵育时间、expar扩增产物
‑
dna四面体镊子的反应时间，在最优的实验条件下可以对皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶进行准确灵敏的检测。本发明利用expar等温扩增技术，不需要复杂的变温过程，稳定性较好，灵敏度较高。相比于其他的检测方法，本发明的荧光传感方法可以同时检测血清睾酮、皮质醇、肌酸激酶同工酶三种物质，并且反应时间短，灵敏性高，成本较低，检测限分别可达41pm、68pm与8pm，适用于现场的筛查与快速检测过程。
附图说明
[0046]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0047]
图1为本发明检测方法原理图；
[0048]
图2为本发明实施例1互补链响应型dna四面体镊子荧光传感检测方法的最佳实验条件探究；a：dna四面体镊子孵育时间优化；b：互补链
‑
dna四面体镊子响应时间优化；c：
expar扩增模板链浓度优化；d：kf dna聚合酶加入量优化；
[0049]
图3为本发明实施例2中目标物的检测标准曲线，其中a为应用该方法检测血清睾酮的标准曲线；b为应用该方法检测皮质醇的标准曲线；c为应用该方法检测肌酸激酶同工酶的标准曲线。
具体实施方式
[0050]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0051]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0052]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0053]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0054]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0055]
本发明的检测原理：基于expar扩增
‑
dna四面体镊子荧光恢复方法，实现对血清中血清睾酮、皮质醇、肌酸激酶同工酶的灵敏快速检测。如图1所示，首先，dna四面体镊子由四条不同的dna单链组成，基于碱基互补配对原则，dna链间发生识别与折叠，形成四面体镊子，拉近原本远离的荧光基团与猝灭基团，发生荧光猝灭的现象。将生物素化的适配体与链霉亲和素化的磁珠相连，加入互补链后形成磁珠
‑
适配体
‑
互补链复合物。当样品中存在目标物时，目标物与互补链相互竞争，导致互补链游离，通过磁分离步骤可以提取游离的互补链。当加入expar扩增模板后，游离的互补链能够与模板相结合，在nb.bbvci切刻内切酶与klenow fragment(kf)dna聚合酶的作用下，引发expar扩增过程，产生大量与扩增模板序列互补的单链dna扩增产物。这些扩增产物能够识别dna四面体镊子上的茎环结构，并与之结合，使得dna四面体镊子的结构发生改变，从而使荧光基团与猝灭基团相互远离，产生荧光恢复的现象。通过荧光分光光度计检测在不同的激发波长与发射波长条件下反应体系的荧光值，判断荧光恢复的程度，进而确定样品中目标物的含量。荧光恢复程度与样本中目标物含量成正比。
[0056]
以下实验例中，所用的dna链购自上海生工生物有限公司；链霉亲和素化的磁珠购自海狸生物医学工程有限公司；nb.bbvci切刻内切酶、kf dna聚合酶和dntps均购自北京百灵克生物科技有限责任公司。
[0057]
实施例1
[0058]
互补链响应型dna四面体镊子荧光传感检测方法的最佳实验条件探究，具体包括以下步骤：
[0059]
1)dna四面体镊子孵育时间优化：将四条dna四面体镊子链相互混合，振荡混匀，95℃下孵育5min，之后不同时间条件下dna四面体镊子的荧光强度变化情况，绘制时间
‑
荧光强度变化曲线。
[0060]
2)互补链
‑
dna四面体镊子响应时间优化：将四条dna四面体镊子链相互混合，振荡混匀。在优化的dna四面体镊子孵育时间下制备dna四面体镊子。之后加入浓度为1μm的互补链。检测其在不同浓度下荧光值的变化情况，绘制时间
‑
荧光值变化曲线。
[0061]
3)expar扩增模板链剂量优化：向互补链中加入不同剂量的expar扩增模板，并加入5μl cutsmart缓冲液(50mm醋酸钾、20mm tris
‑
醋酸盐、10mm醋酸镁和100μg/ml牛血清白蛋白)，升温至90℃孵育10min，并在1h内缓慢降温。向降温后的离心管中加入5μl kf dna缓冲液、1μl kf聚合酶、1μl nb.bbvci切刻内切酶、1μl dntp(30mm)，最终加入dd水，使总体积定容至50μl。将上述溶液在37℃孵育60min，并在80℃下孵育20min，灭活酶活性，终止反应。将上述扩增产物加入制备的dna四面体镊子中，检测其荧光强度的变化。绘制dna模板链加入量
‑
荧光值变化曲线。
[0062]
4)kf dna聚合酶加入量优化：向互补链中加入优化剂量的expar扩增模板，其他expar扩增实验如步骤3)中所示。向降温后的离心管中加入5μl kf dna缓冲液、1μl nb.bbvci切刻内切酶、1μl dntp(30mm)，并加入不同剂量的kf dna缓冲液。将上述反应体系在37℃孵育60min，并在80℃下孵育20min，灭活酶活性，终止反应。将上述扩增产物加入制备的dna四面体镊子中，检测其荧光强度的变化。绘制kf dna聚合酶加入量
‑
荧光值变化曲线。
[0063]
5)根据1)
‑
4)中的实验步骤，绘制实验条件优化曲线。结果如图2所示。优化后的实验条件为：dna四面体镊子孵育100min，互补链
‑
dna四面体镊子响应时间为9min，加入expar扩增模板链剂量0.3μl，并加入1.5μl的kf dna聚合酶。在优化后的实验条件下能够取得最佳检测性能。
[0064]
实施例2
[0065]
检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶检测的互补链响应型dna四面体镊子荧光传感检测方法，具体包括以下步骤：
[0066]
1)人血清样本前处理：取灭活了的人血清样本，使用tm缓冲液将其稀释30倍，作为样品检测基质。向稀释后的血清样本中加入皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶，使其终浓度为10nm、100nm、500nm，作为待检测的样本溶液。
[0067]
2)磁珠
‑
适配体
‑
互补链的制备：将链霉亲和素化的磁珠(50μl，10mg/μl)放在振荡器上，振荡混匀20s，重悬磁珠。取100μl链霉亲和素化的磁珠于1.5ml离心管中，在磁力架上静置2min，去除上清液。加入1ml pbs试剂到离心管中，振荡重悬磁珠，磁性分离，重复两次。向上述的离心管中加入500μl，1μm的生物素化地适配体链，使磁珠浓度为2mg/ml，充分振荡重悬。在立式混匀震荡仪中，37℃，800rpm振荡孵育60min，磁性分离，将混合物洗涤三次，并在所得产物中加入200μl的pbs缓冲液，混匀重悬，得到适配体功能化的磁珠(apt
‑
mbs)。
[0068]
3)制备dna四面体镊子：在tm缓冲液(20mm tris，50mm mgcl2，ph＝8.0)中稀释定
制的dna1、dna2、dna3、dna4，配得dna终浓度为2μm。之后各取50μl，2μm的dna溶液，加入到200μl离心管中，震荡混匀3min，离心1min。最后将金属浴升温至95℃，将终浓度为500nm的dna混合溶液孵育5min，并在1min内迅速将上述混合物冷却至4℃，避光孵育2h。上述过程全程避光。
[0069]
4)竞争互补链：取20μl适配体功能化的磁珠(apt
‑
mbs)与步骤1)20μl的待测样品(皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶)，37℃震荡孵育60min。加入10μl 1μm适配体互补链，在37℃震荡孵育15min。将上述反应混合溶液在磁性分离架上磁性分离5min，并提取上清液。即得游离的互补链。
[0070]
5)expar扩增反应：取150
‑
250μl的离心管，向4)中磁分离的上清液中加入5μl cutsmart缓冲液(50mm醋酸钾、20mm tris
‑
醋酸盐、10mm醋酸镁和100μg/ml牛血清白蛋白)，磁分离后的上清液，0.3μl 0.2μm expar扩增模板链。将金属浴升温至90℃，将上述混合溶液在金属浴中孵育10min，并在1h内缓慢降温。90℃的孵育可以变性dna单链，使得互补链与扩增模板充分舒展，而缓慢降温过程可以使二者充分结合。向降温后的离心管中5μl kf dna缓冲液、1μl kf聚合酶、1μl nb.bbvci切刻内切酶、1μl dntp(30mm)，最终加入dd水，使总体积定容至50μl。将上述溶液在37℃孵育60min，并在80℃下孵育20min，灭活酶活性，终止反应。扩增产物放置于4℃备用。在nb.bbvci切刻内切酶、dna聚合酶的作用下，在短时间内产生与模板链互补的dna单链。
[0071]
6)互补链
‑
dna镊子荧光恢复反应：取40
‑
50μl步骤5)中的expar扩增产物，50
‑
55μl步骤3)中的dna四面体镊子溶液，在tm缓冲液中震荡混匀，离心1min，并在25℃金属浴中避光孵育10
‑
15min。
[0072]
7)读数：使用荧光分光光度计实现对6)反应体系的读数。具体为：
[0073]
取80μl步骤6)中的反应混合溶液，将上述反应体系置于荧光分光光度计中，检测反应体系的荧光恢复情况。检测方法设置为：
[0074]
血清睾酮检测：激发波长：480nm，发射波长：510
‑
590nm，增益14挡，取522nm峰值处的荧光值为检测值。
[0075]
皮质醇检测：激发波长：575nm，发射波长：600
‑
680nm，增益15挡，取602nm峰值处的荧光值为检测值。
[0076]
肌酸激酶同工酶检测：激发波长：640nm，发射波长：650
‑
730nm，增益17档，取667nm峰值处的荧光值为检测值。
[0077]
8)根据步骤1)
‑
7)测定一系列已知浓度梯度的血清睾酮、皮质醇、肌酸激酶同工酶标准溶液，并以目标物的浓度梯度为横坐标，以荧光的响应值为纵坐标，形成剂量
‑
反应图谱，制作标准曲线，如图3所示。应用该方法检测血清睾酮的标准曲线为：y＝
‑
1316.6023*(
‑
x/1140.3661)+2574.8893，检测皮质醇的标准曲线为：y＝
‑
2992.4295*(
‑
x/1491.7281)+3555.7270,检测肌酸激酶同工酶的标准曲线为y＝26.6608x+554.2363。
[0078]
实施例3
[0079]
1)人血清样本前处理：取人血清样本，使用tm缓冲液将其稀释30倍，作为样品检测基质。向稀释后的血清样本中分别加入不同浓度的血清睾酮、皮质醇、肌酸激酶同工酶，使其终浓度为10nm、100nm、500nm，得到实际样品。检验所设计方法在实际血液样本检测中的可行性。
[0080]
2)根据实施例2的步骤1)
‑
7)测定实际样品，将步骤7)所得的数值代入测得的标准曲线中，完成dna四面体镊子荧光恢复反应。
[0081]
3)分别测定2)反应溶液的荧光光谱，分别取522、602、667nm处的荧光值作为检测标准。计算生物标志物皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的含量。结果如表1所示。
[0082]
表1实际样品检测的结果
[0083][0084]
实施例4
[0085]
互补链响应型dna四面体镊子荧光传感检测方法的检测限
[0086]
1)配置等体积的空白标准样品，作为待检测的样本溶液。
[0087]
2)如实施例2中2)
‑
7)中的实验步骤，进行磁分离、expar扩增、dna四面体镊子制备以及互补链响应实验，获得数据读数。
[0088]
3)根据3σ标准规则，判断互补链响应型dna四面体镊子检测睾酮、皮质醇、ck
‑
mb的检测限。
[0089]
4)实验后的检测结果显示，互补链响应型dna四面体镊子检测睾酮、皮质醇、ck
‑
mb的检测限分别为41pm、68pm与8pm。
[0090]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。