尿蛋白标志物在制备检测糖尿病肾病的试剂盒中的应用

1.本发明涉及糖尿病肾病领域，具体而言，涉及一种尿蛋白标志物在制备检测糖尿病肾病的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.2019年全世界超过4.63亿人患糖尿病，占全球成年人(20-79岁)的9.3％。在这些人群中，20％-40％将发展为糖尿病肾病(dkd)，dkd是2型糖尿病(t2d)患者发病和死亡的主要原因。dkd患者发展为终末期肾病(esrd)和心血管疾病的风险很高。因此，及早发现、预防和治疗非常重要。临床上dkd诊断的金标准是肾活检技术，然而其具有强烈的侵入性和危险性，同时评估过程非常依赖主观判断，因此结果的不稳定性强。此外，早期的dkd可能仅仅发生在肾脏的局部位置，若穿刺没有命中病变部位，则无法提早检测出疾病。
3.尿液也是临床检验中除血液外最常用的体液样本，尿液是一种真正的非侵入性样本，质谱技术可以检测到尿液中成百上千的微量蛋白质，人类尿蛋白质组包含大量个体内及个体间差异、人体生理和病理状态的信息，世界各国科学家一直在利用蛋白质组学技术试图从尿液中找到新的用于疾病诊断、预后分析、疗效检测的蛋白标志物。尿蛋白质组不仅可以反映性别、年龄、民族等生理信息，可以反映人体的病理状态，目前已经有研究人员通过尿液蛋白质组寻找到一些疾病标志物，包括慢性肾病、肺癌、神经系统疾病等。
4.肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液。肾脏和尿液有密不可分的关系，目前的研究表明，尿液中有大量的蛋白质与肾脏的生理、病理状态有着直接关联。因此，如何从尿液中的大量蛋白质中找到能够用来特异性评估肾脏的状态的蛋白标志物，以替代目前肾穿的检测方法，是一项临床上非常有价值的研究。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种尿蛋白标志物在制备检测糖尿病肾病的试剂盒中的应用，以提供一种新的无创的检测方案。
6.为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种尿蛋白标志物在制备检测糖尿病肾病的试剂盒中的应用，尿蛋白标志物为尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白。
7.为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种检测糖尿病肾病的试剂盒，试剂盒包括尿蛋白标志物抗体，尿蛋白标志物抗体为alb蛋白的抗体和/或afm蛋白的抗体。
8.进一步地，尿蛋白标志物抗体设置在固相载体上；优选地，固相载体选自酶标板、膜载体或微球，进一步优选地，膜载体选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；优选地，尿蛋白标志物抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，试剂盒为elisa试剂盒、免疫荧光试剂盒或免疫胶体金试剂盒。
9.为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种糖尿病肾病的检测模型，检测模型包括糖尿病肾病标志物蛋白，糖尿病肾病标志物蛋白为尿蛋白标志物，尿蛋白
标志物为尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白。
10.进一步地，检测模型为逻辑回归模型。
11.为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种糖尿病肾病的检测装置，该装置内置有上述糖尿病肾病的检测模型。
12.为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种糖尿病肾病的检测模型的构建方法，该构建方法包括：质谱检测来源于糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿液蛋白质中的差异蛋白；将部分健康人群和部分糖尿病肾病人群作为发现集，并利用发现集中的潜在标志物蛋白进行逻辑回归模型训练，确定模型训练所用蛋白的最佳数量；根据最佳数量的潜在标志物蛋白的不同组合再次进行逻辑回归模型训练，确定最佳标志物蛋白组合；将最佳标志物蛋白组合训练得到的逻辑回归模型作为糖尿病肾病的检测模型，将剩余部分健康人群和剩余部分的糖尿病肾病人群作为验证集，利用验证集验证糖尿病肾病的检测模型；其中，最佳标志物蛋白组合为alb蛋白和afm蛋白。
13.进一步地，质谱检测来源于糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿液蛋白质中的差异蛋白包括：质谱分离来源于糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿液蛋白质，获得尿蛋白质组数据；对尿蛋白质组数据中各个蛋白质的丰度进行测量，得到测量结果；从测量结果中查找蛋白质丰度在糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群中存在显著差异的蛋白质作为差异蛋白；其中，采用基于强度的相对定量方法对同一批次内的蛋白质的丰度进行测量，并采用基于强度的总分数的方法对不同批次间的蛋白质丰度进行归一化处理。
14.为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种存储介质，存储介质包括存储的程序，其中，在程序运行时控制存储介质所在设备执行上述糖尿病肾病的检测模型的构建方法。
15.为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种处理器，处理器用于运行程序，其中，程序运行时执行上述糖尿病肾病的检测模型的构建方法。
16.应用本发明的技术方案，通过采用大数据分析的手段对质谱检测的差异蛋白质组学数据进行分析，发现了尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白与糖尿病肾病有显著的相关性，因而将尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白作为检测糖尿病肾病的标志物具有重要临床应用价值。
附图说明
17.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
18.图1示出了根据本发明的优选的实施例中模型检测的roc曲线图。
具体实施方式
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
20.术语解释：
21.尿蛋白标志物：本技术是指从尿液中分离到的标志物蛋白，其能够特异性标志某
种疾病、某种疾病的发展进程或阶段。
22.蛋白质：在本技术中蛋白与蛋白质的涵义相同，可以互换使用。
23.基于背景技术部分所提到的目前存在无创检测糖尿病肾病的需求，本技术通过利用质谱技术检测了人尿液中的大量蛋白质，并发现了alb、afm两个蛋白质与糖尿病肾病相关。通过对尿液中alb、afm蛋白的定量检测，并根据两者的丰度建立了糖尿病肾病人群检测模型，经过临床数据验证，该检测模型的准确性比较高，因而适合用于快速、高效、客观地检测糖尿病肾病人群。
24.在该研究结果的基础上，申请人提出了本技术的技术方案。在一种典型的实施例中，提供了一种尿蛋白标志物在制备检测糖尿病肾病的试剂盒中的应用，尿蛋白标志物为尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白。本技术新发现的尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白与糖尿病肾病有显著的相关性，因而可以作为检测糖尿病肾病的标志物。
25.通过将alb蛋白质和/或afm蛋白质作为检测糖尿病肾病的标志物，根据现有试剂盒的制备原则，可以制备出针对alb蛋白质和/或afm蛋白质的检测试剂盒。
26.在第二种典型的实施例中，提供了一种检测糖尿病肾病的试剂盒，试剂盒包括尿蛋白标志物抗体，尿蛋白标志物抗体为alb蛋白的抗体和/或afm蛋白的抗体。采用试剂盒进行检测的方法方便简单快速。
27.在一种优选的实施例中，尿蛋白标志物抗体设置在固相载体上；优选地，固相载体选自酶标板、膜载体或微球，进一步优选地，膜载体选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；优选地，尿蛋白标志物抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，试剂盒为elisa试剂盒、免疫荧光试剂盒或免疫胶体金试剂盒。
28.根据具体需要，可以制备成多种不同类型的检测试剂盒，具体试剂盒的形式不限，比如可以是elisa试剂盒，也可以是免疫荧光试剂盒或免疫胶体金试剂盒等。从方便检测及便于判断检测结果的角度考虑，试剂盒中的alb蛋白的抗体和/或afm蛋白的抗体优选设置为预包被的形式。优选地，预包被抗体包被于固相载体上；具体的固相载体根据需要合理设计。更优选，固相载体包括酶标板(多为聚苯乙烯材料的)、膜载体或微球；进一步优选地，膜载体包括硝酸纤维素膜(使用最广泛)、玻璃纤维素膜或尼龙膜，更进一步优选地，膜载体上还包被有阳性对照物，蛋白标志物和阳性对照物按检测顺序在硝酸纤维素膜上依次设置。
29.根据试剂盒的具体检测方法的不同，试剂盒中具体的配套试剂也相应有所不同，但均可以根据已知试剂盒的配制方式进行组合配套试剂。优选地，上述试剂盒中还包括以下至少之一：(1)酶标二抗，更优选酶标二抗为hrp标记的二抗(对应于elisa检测试剂盒)；(2)胶体金结合垫，胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗体和阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫胶体金检测试剂盒)；(3)标记垫，标记垫上包被有荧光标记的微球，微球上负载有阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫荧光检测试剂盒)。
30.上述免疫胶体金检测试剂盒和免疫荧光检测试剂盒检测相对更方便，只需要建立阳性对照的c线和检测样本的t线即可。阳性对照的c线处预包被的阳性对照物，只要是能够随着待测样本的尿液层析过程携带过来的带有检测标记的特异性结合物结合即可，对具体的阳性对照物的抗体并无特殊限定。优选地，上述阳性对照物选自鼠免疫球蛋白、人免疫球蛋白、羊免疫球蛋白或兔免疫球蛋白，相应地，阳性对照物的特异性结合物选自抗鼠免疫球蛋白、抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白。
31.上述抗鼠免疫球蛋白根据免疫的对象的不同，可以是羊抗鼠的免疫球蛋白或兔抗鼠的免疫球蛋白，或者是其他可免疫的动物抗鼠的免疫球蛋白。同样地，抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白也可以根据免疫动物的不同，是不同物种来源的抗免疫球蛋白。上述免疫球蛋白可以是igm、igg、iga、igd或ige中的任意一种。这些抗免疫球蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
32.上述试剂盒中，根据所需要检测的样本数量的多少，所使用的酶标板的规格也有所不同，可以在12～384孔酶标板中合理选择。
33.上述不同形式的试剂盒，均能实现对蛋白质的定量，即也能实现对尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白的定量。以采用elasa试剂盒测定为例，尿液中的alb、afm蛋白与固相载体表面的alb抗体、afm抗体反应。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与尿液中alb、afm蛋白的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，有色产物的量与尿液中alb、afm蛋白的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
34.在第三种典型的实施例中，提供了一种糖尿病肾病的检测模型，该检测模型包括糖尿病肾病标志物蛋白，糖尿病肾病标志物蛋白为尿蛋白标志物，尿蛋白标志物为尿液中的alb蛋白和/或afm蛋白。
35.在一种优选的实施例中，该检测模型为逻辑回归模型。
36.在第四种典型的实施例中，提供了一种糖尿病肾病的检测装置，该检测装置内置有上述糖尿病肾病的检测模型。
37.在第五种典型的实施例中，提供了一种糖尿病肾病的检测模型的构建方法，该构建方法包括：质谱检测来源于糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿液蛋白质中的差异蛋白；将部分健康人群和部分糖尿病肾病人群作为发现集，利用发现集(用于发现标志物蛋白的样本集)中的差异蛋白进行逻辑回归模型训练，确定模型训练所用蛋白的最佳数量；根据最佳数量的差异蛋白的不同组合再次进行逻辑回归模型训练，确定最佳标志物蛋白组合；将最佳标志物蛋白组合训练得到的逻辑回归模型，作为糖尿病肾病的检测模型，将剩余部分健康人群和剩余部分的糖尿病肾病人群作为验证集，并利用验证集(用于验证模型的样本集)验证糖尿病肾病的检测模型；其中，最佳标志物蛋白组合为alb蛋白和afm蛋白。
38.为了防止模型过拟合，对差异蛋白中潜在的生物标志物进行降维。具体操作为：
39.首先在差异蛋白中只选取一个蛋白作为特征训练模型，计算其准确性、特异性、auc，选取最优结果保留；然后在差异蛋白中任选两个蛋白组合作为特征训练模型，同样计算其准确性、特异性、auc，保留最优结果；依次类推，在差异蛋白中任选三个、四个、五个或更多个蛋白组合作为特征训练模型，同样计算其准确性、特异性、auc，保留最优结果，最终比较得到模型选用两个蛋白组合作为特征时，准确性、特异性、auc趋于稳定，因此选用两个蛋白最终作为特征训练模型。随后进行逻辑回归模型构建，用发现集的数据(即发现集中的样本中的alb和afm两个蛋白的表达量数据)训练逻辑回归分类模型，然后用验证集的数据((即验证集中的样本中的alb和afm两个蛋白的表达量数据))对模型进行验证，计算准确性、特异性、auc作为评估模型的指标。
40.需要说明的是，本技术在选择逻辑回归进行训练建模之前，也曾尝试其他的建模方法，包括但不限于线性回归、随机森林等，但拟合效果相对较差，经比较之后确定了逻辑回归建模的方法。
41.在一种优选的实施例中，该质谱检测来源于糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿液蛋白质中的差异蛋白包括：质谱分离来源于糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿液蛋白质，获得尿蛋白质组数据；对尿蛋白质组数据中对各个蛋白质的丰度进行测量，得到测量结果；从测量结果中查找蛋白质丰度在糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群中存在显著差异的蛋白质作为差异蛋白；其中，采用基于强度的相对定量方法对同一批次内的蛋白质的丰度进行测量，并采用基于强度的总分数的方法对不同批次间的蛋白质丰度进行归一化处理。
42.如前述，本技术的尿蛋白标志物是通过以下方法发现的：通过之前开发的一套提取尿液中蛋白质的方法(参见公开号为cn 108333263 a的专利申请)，针对性的改进了质谱条件及参数设置，筛选了临床上已知的糖尿病尿蛋白健康人群和糖尿病肾病人群的尿蛋白表达量存在显著差异的差异蛋白，进而发现了alb、afm蛋白与糖尿病肾病之间的强相关性。同时，通过质谱优化条件能够快速完成对尿液中alb、afm蛋白的定量检测，并根据alb、afm的丰度建立了糖尿病肾病人群检测模型，通过该检测模型，只需将待测的尿蛋白样本中alb、afm的丰度输入该检测模型即可直接输出是否为糖尿病肾病阳性样本。
43.上述质谱分析过程，可以采用现有的相关仪器和分析软件来进行。在本技术一种具体的实施例中，消化后样品在装有c18颗粒的自制毛细管柱上分离胰蛋白酶肽，并通过与在线easy-nlc 1000纳米-hplc系统(thermo fisher scientific)联用的thermo fisher orbitrap质谱仪进行分析。在firmiana分析平台中处理lc-ms/ms数据，并在mascot搜索引擎上进行蛋白搜索。
44.在对蛋白质的丰度进行定量时，本技术的优选实施例中，根据数据来源与同一批次内还是不同批次间，采用了不同的定量方法。对于同一批次内的蛋白质的丰度进行测量时，采用ibaq(基于强度的相对定量)，即无标记定量算法。而对于批次间的蛋白质丰度进行比较时，通过将ibaq转换成ifot(基于强度的总分数)，表示在lc-ms/ms分析中鉴定的蛋白质的归一化强度，通过该指标考虑了批次间差异对检测结果的影响，进而使得定量结果更准确和客观。
45.此外，在本技术一些优选的实施例中，为了可视化目的，将ifot的数量乘以105。
46.为进一步提高质谱分析结果的准确性，在本技术优选的实施例中，采用293t细胞的胰蛋白酶消化物作为qc(质量控制)样品，通过lc-ms/ms常规评估以保证仪器的重现性。
47.上述优选实施例中，检测模型的构建方法采用了大数据人工智能算法，针对大量的表达量存在差异的蛋白，利用逻辑回归的建模方法来构建模型，能够使得该模型的预测准确性比较高。
48.具体地，通过从21例糖尿病患者和9例糖尿病肾病患者的尿蛋白中筛选到135个差异蛋白，进一步通过降维处理找到alb和afm两个蛋白，利用alb、afm建立了逻辑回归模型；利用这两个蛋白建立的逻辑回归模型，可以将独立验证集中糖尿病(113人)和糖尿病肾病(56人)分开，且auc高达0.935。由此表明利用alb、afm建立的逻辑回归模型能够对糖尿病病人进行有效的糖尿病肾病的筛查。
49.需要说明的是，对于前述的各方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作并不一定是本发明所必须的。
50.通过以上的实施方式的描述可知，本领域的技术人员可以清楚地了解到本技术可借助软件加必需的检测仪器等硬件设备的方式来实现。基于这样的理解，本技术的技术方案中数据处理的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在存储介质中，如rom/ram、磁碟、光盘等，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本技术各个实施例或者实施例的某些部分的方法。
51.本技术可用于众多通用或专用的计算系统环境或配置中。例如：个人计算机、服务器计算机、手持设备或便携式设备、平板型设备、多处理器系统、基于微处理器的系统、置顶盒、可编程的消费电子设备、网络pc、小型计算机、大型计算机、包括以上任何系统或设备的分布式计算环境等等。
52.显然，本领域的技术人员应该明白，上述的本技术的部分模块或步骤可以在通用的计算装置来实现，它们可以集中在单个的计算装置上，或者分布在多个计算装置所组成的网络上，可选地，它们可以用计算装置可执行的程序代码来实现，从而，可以将它们存储在存储装置中由计算装置来执行，或者将它们分别制作成各个集成电路模块，或者将它们中的多个模块或步骤制作成单个集成电路模块来实现。这样，本技术不限制于任何特定的硬件和软件结合。
53.在一种优选的实施例中，提供了一种存储介质，该存储介质包括存储的程序，其中，在程序运行时控制存储介质所在设备执行上述糖尿病肾病的检测模型的构建方法。
54.在一种优选的实施例中，提供了一种处理器，处理器用于运行程序，其中，程序运行时执行上述糖尿病肾病的检测模型的构建方法。
55.下面将结合具体的实施例来进一步说明本技术的有益效果。
56.实施例1
57.第一部分：尿液蛋白质样本制备
58.尿液蛋白在样本的制备引用公开日期为2018年07月27日公开的名为“一种尿蛋白制备方法及尿蛋白质组的检测方法”公开号为cn 108333263 a的发明专利申请中实施例1的制备方法进行制备。
59.第二部分：质谱检测
60.消化后样品在装有c18颗粒的自制毛细管柱上分离胰蛋白酶肽，并通过与在线easy-nlc 1000纳米-hplc系统(thermo fisher scientific)联用的thermo fisher orbitrap质谱仪进行分析。在firmiana分析平台[nat biotechnol.2017 may 9；35(5)：409-412.]中处理lc-ms/ms数据，并在mascot搜索引擎上进行蛋白搜索。
[0061]
将蛋白质丰度测量为ibaq(基于强度的相对定量)-无标记定量算法。对于批次间比较，将ibaq转换成ifot(基于强度的总分数)，表示在lc-ms/ms分析中鉴定的蛋白质的归一化强度(liu等人，2013)。为了可视化目的，ifot的数量乘以105。作为qc(质量控制)样品的293t细胞的胰蛋白酶消化物，通过lc-ms/ms常规评估以保证仪器的重现性。
[0062]
第三部分：定量算法+逻辑回归模型
[0063]
寻找糖尿病(21人)和糖尿病肾病(9人)的差异蛋白共135个，进行降维和逻辑回归模型建立，寻找到alb和afm两个蛋白，利用这两个蛋白可以将独立验证集中糖尿病(113人)和糖尿病肾病(56人)分开，且auc高达0.935(如图1所示)。可见，利用alb、afm建立的逻辑回归模型可对糖尿病病人进行有效的糖尿病肾病的筛查。
[0064]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过利用质谱技术检测了人尿液中的大量蛋白质，并发现了alb、afm两个蛋白质与糖尿病肾病相关。通过对尿液中alb、afm蛋白的定量检测，并根据两者的丰度建立了糖尿病肾病人群检测模型，经过临床数据验证，该检测模型的准确性比较高，因而适合用于快速、高效、客观地检测糖尿病肾病人群。
[0065]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。