磷酸化蛋白质在膜性肾病中的应用的制作方法

1.本技术涉及肾病技术领域，尤其是涉及磷酸化蛋白质在膜性肾病中的应用。


背景技术：

2.膜性肾病(membranous nephropathy，mn)是成人肾病综合征最常见的原因。根据病因不同，mn可以分为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，imn)和继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy，smn)，其中imn约占75％，病因不明；smn病因比较明确，肿瘤、感染、药物、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮等可导致smn。mn患者通常表现为严重蛋白尿、水肿、低蛋白血症、高脂血症，诊断依赖肾脏活检病理，其病理诊断特征包括有：肾小球毛细血管壁增厚，免疫荧光可见igg、c3沿着毛细血管壁沉积，电镜显示肾小球脏层上皮细胞下电子致密物形成；但是imn需排除继发性因素后才能诊断。
3.目前imn的病因及发病机制并不十分明确，可能和遗传基因、免疫、环境因素有关。虽然在imn疾病标志物及发病机制方面有了一定的研究成果，但是对该疾病关键的触发源头、补体激活机制及导致足细胞损伤的具体分子机制尚未完全明确，这也给imn的诊断和临床治疗带来一定的困难，患者一旦进入esrd阶段将会面临更为严重的生理心理以及社会负担。因此寻找新的视角来进一步研究膜性肾病的诊断标志物或者潜在的治疗干预靶点。


技术实现要素：

4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种磷酸化蛋白质作为膜性肾病的诊断标志物，利用能够定量检测该蛋白的特定位点的磷酸化水平的试剂可以有效地诊断膜性肾病或作为潜在的治疗干预靶点。
5.本技术的第一方面，提供定量检测蛋白质ezr的t567位点的磷酸化水平的试剂在制备膜性肾病诊断试剂中的应用。
6.根据本技术实施例的应用，至少具有如下有益效果：
7.肾小球足细胞是高度分化的细胞，胞体具有许多突起，称为足突。足细胞对肾小球滤过屏障的选择通透性十分重要并且足细胞发挥功能主要基于细胞结构的动态调节，特别是足突结构的调节。ezr(ezrin，gene id：7430)是肌动蛋白-质膜连接蛋白，主要存在于足细胞足突，ezr的磷酸化位点t567的磷酸化在维持细胞形态结构，动态调节b细胞受体迁移，8-细胞胚胎紧密化，凋亡信号转导等方面发挥重要作用。而申请人在研究过程中发现，ezr磷酸化位点t567的磷酸化水平在imn组中相比于对照组存在显著的下调，可能是随着疾病进展而逐渐下降的。t567的磷酸化水平下调可能参与了imn疾病进展过程中足细胞的损伤。而切片的免疫组织化学染色强度及细胞阳性率统计结果进一步证明，ezr的t567位点的磷酸化水平在imn患者的肾活检组织中确实是下降的，因此，可以通过能够定量检测蛋白质ezr的t567位点的磷酸化水平的试剂来诊断膜性肾病。
8.其中，ezr的氨基酸序列如下所示：
9.mpkpinvrvttmdaelefaiqpnttgkqlfdqvvktiglrevwyfglhyvdnkgfptwlkldkkvsaq
evrkenplqfkfrakfypedvaeeliqditqklfflqvkegilsdeiycppetavllgsyavqakfgdynkevhksgylsserlipqrvmdqhkltrdqwedriqvwhaehrgmlkdnamleylkiaqdlemyginyfeiknkkgtdlwlgvdalglniyekddkltpkigfpwseirnisfndkkfvikpidkkapdfvfyaprlrinkrilqlcmgnhelymrrrkpdtievqqmkaqareekhqkqlerqqletekkrretverekeqmmrekeelmlrlqdyeektkkaerelseqiqralqleeerkraqeeaerleadrmaalrakeelerqavdqiksqeqlaaelaeytakialleearrrkedeveewqhrakeaqddlvktkeelhlvmtapppppppvyepvsyhvqeslqdegaeptgysaelssegirddrneekriteaeknervqrqlltlsselsqardenkrthndiihnenmrqgrdkyktlrqirqgntkqridefeal(seq id no.1)。
10.在本技术的一些实施方式中，膜性肾病为特发性膜性肾病。
11.在本技术的一些实施方式中，试剂包括蛋白质ezr的t567位点的磷酸化抗体。其中，磷酸化抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。可以理解的是，试剂也可以是本领域所知的其它可以定量检测蛋白质特定位点磷酸化水平的试剂。
12.在本技术的一些实施方式中，蛋白质ezr来源于活体肾组织。利用穿刺或外科手术的方法从患者的肾脏中获得少许的肾脏活体组织进行蛋白质ezr的t567的磷酸化水平的定量检测。
13.本技术的第二方面，提供蛋白质ezr的t567位点作为靶点在筛选或制备用于治疗膜性肾病的药物中的应用。通过备选药物是否能够对ezr的t567位点的磷酸化水平进行改变，具体而言是是否能够上调ezr的t567位点的磷酸化水平，判断其是否参与足细胞的损伤修复，从而确定能否用作治疗膜性肾病的药物。如果可以上调ezr的t567位点的磷酸化水平，则有可能参与足细胞的损伤修复，可能能够用于治疗膜性肾病，特别是特发性膜性肾病。
14.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
15.图1是kegg通路注释及富集分析结果，其中，a、b、c分别是ⅱ期imn组/对照组、ⅱ期imn组/ⅲ期imn组、ⅲ期imn组/对照组的差异蛋白质富集的通路。
16.图2是利用三个免疫相关通路对差异磷酸化蛋白质的筛选结果，其中，a是对6个分析方法分别筛选出的10种关键蛋白质取交集的结果，b是三个通路上的差异磷酸化蛋白质形成的互作网路图。
17.图3中ezr(t567)免疫组化实验结果，其中，a是对照组的免疫组化实验结果，b是ⅱ期imn患者的免疫组化实验结果，c是阳性细胞率的统计比较结果。
具体实施方式
18.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
19.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
20.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
21.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
22.实施例1：差异磷酸化蛋白质的筛选
23.一、imn患者及对照组的选取
24.imn组为确诊为imn的16例患者(其中ⅱ期imn 11例，ⅲ期imn 5例，因此分为ⅱ期imn组和ⅲ期imn组)，由于正常健康肾组织的来源非常困难，所以对照组选择病理确诊为轻微肾小球异常的10例患者，在该实验中可以视为健康人的对照组，性别年龄等基本条件与选取的imn患者相匹配。imn患者的诊断都是通过肾活检病理诊断(光学显微镜及电子显微镜病理)明确的，临床上排除肿瘤、感染、药物、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮等继发性mn。收集imn组和对照组入院时的肾活检组织样本及临床资料、实验室相关检验结果以及病理检测报告图片。
25.二、imn患者组及对照组的差异磷酸化修饰的蛋白质分析
26.(1)通过质谱分析技术检测修饰肽段在每组肾活检样本(混样)中对应的信号丰度，通过非标定量计算方法得到修饰位点在每组样本中的intensity，根据不同样本之间修饰位点intensity得到每组样本的相对定量值。当差异修饰肽段在两组样本中相对定量变化超过2倍时作为显著上调的变化阈值，小于1/2倍作为显著下调的变化阈值。鉴定出ⅱ期imn组/对照组、ⅱ期imn组/ⅲ期imn组、ⅲ期imn组/对照组这三个比较组各自的差异磷酸化修饰的蛋白质。
27.(2)针对鉴定到的每个比较组的差异磷酸化修饰蛋白质进行详细的生物信息学分析
28.1)kegg通路注释及富集分析
29.kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)能够将当前已知的蛋白质的相互作用网络信息等进行综合，通过使用kaas对提交的差异磷酸化修饰蛋白质分别进行注释，之后通过kegg mapper将注释过的蛋白质匹配到数据库中对应的信号转导通路中。同时通路富集检验p值小于0.05被认为是显著富集。
30.2)构建差异磷酸化修饰蛋白质相互作用网络
31.将不同比较组中鉴定到的差异磷酸化修饰蛋白质数据库编号或蛋白序列，通过与string蛋白互作网络数据库比对后，得到差异磷酸化修饰蛋白质相互作用关系。
32.图1中a、b、c分别是ⅱ期imn组/对照组、ⅱ期imn组/ⅲ期imn组、ⅲ期imn组/对照组的差异磷酸化蛋白质富集的通路。从图中结果结合相关文献报道，将紧密连接(tight junction)，粘着连接(adherens junction)以及白细胞跨内皮迁移(leukocyte transendothelial migration)作为上述三个比较组中较为关键的三条与免疫反应有关的
通路。
33.对每个比较组内的上述三个通路中的所有的差异磷酸化蛋白质采用string database(v.11.0)建立网络互作图，然后在cytoscape(v.3.7.2)软件中可视化展示，通过该软件cytohubba插件内的6种(degree，maximum neighborhood component(mnc)，edge percolated component(epc)，closeness centrality，radiality centrality，stress centrality)分析方法鉴定到的排名前十位的关键蛋白质，结果如表1所示。
34.表1.关键蛋白质
[0035][0036]
对上述排名前十位的关键蛋白质取交集后得出7个重叠的可能是更关键的蛋白质，结果如图2的a所示。而三个比较组中紧密连接(tight junction)，粘着连接(adherens junction)以及白细胞跨内皮迁移(leukocyte transendothelial migration)通路上的差异磷酸化蛋白质形成的互作网路图如图2的b所示。筛选出的7个关键蛋白质分别是vcl(vinculin)、tjp1(tight junction protein zo-1)、egfr(epidermal growth factor receptor)、ezr(ezrin)、ctnnd1(catenin delta-1)、actg1(actin,cytoplasmic 2)、cttn(src substrate cortactin)。
[0037]
进一步在三个比较组的差异磷酸化蛋白质数据鉴定结果中对上述7个蛋白质的磷酸化的表达进行查询，发现ezr磷酸化位点t567的磷酸化水平在ⅱ期imn/对照组(比值0.215)和ⅲ期imn/对照组(比值0.195)中都下调，而且，由于在ⅲ期imn/对照组中磷酸化水平下降的更多，推测该位点磷酸化可能是随着疾病进展而逐渐下降的，因此对蛋白质ezr的磷酸化位点t567进行了进一步讨论与研究。
[0038]
肾小球足细胞是高度分化的细胞，胞体具有许多突起，称为足突。足细胞对肾小球滤过屏障的选择通透性十分重要并且足细胞发挥功能主要基于细胞结构的动态调节，特别是足突结构的调节。ezr是肌动蛋白-质膜连接蛋白，主要存在于足细胞足突，ezr的磷酸化位点t567的磷酸化在维持细胞形态结构、动态调节b细胞受体迁移、8-细胞胚胎紧密化、凋亡信号转导等方面发挥重要作用。以上研究提示ezr蛋白的t567位点磷酸化水平降低可能参与了膜性肾病中足细胞的损伤过程。而结合实施例1中的结果进一步可以证明，ezr磷酸化位点t567的磷酸化水平下调可能参与了imn疾病进展过程中足细胞的损伤，ezr磷酸化位点t567可能是该疾病的潜在治疗干预靶点或生物学标志物。免疫组化实验验证
[0039]
使用ezr(t567)免疫组化抗体(phospho-ezrin(thr567)/radixin(thr564)/moesin(thr558)(48g2)rabbit monoclonal antibody，购于cell signaling technology
公司，货号3726)对磷酸化ezr(t567)进行了实验组ⅱ期imn患者(10例)的肾活检组织石蜡切片上的免疫组织化学验证，并和对照组(5例，病理确诊为轻微肾小球异常的患者)的结果进行比较(实验方法参考抗体的使用说明书)，结果如图3所示，其中，a是对照组的免疫组化实验结果，b是ⅱ期imn患者的免疫组化实验结果，c是阳性细胞率的统计比较结果(cg：对照组，mnⅱ：实验组)。从图中可以看出，切片的免疫组织化学染色强度在实验组和对照组之间存在比较明显的差异，而细胞阳性率统计结果则进一步表明两个组中ezr(t567)存在显著的统计学差异(p《0.001)，综合图3的结果可以看出，ezr在t567位点的磷酸化水平在ⅱ期imn患者的肾活检组织中存在显著的下降，与磷酸化组学的检测结果所反映的现象一致。
[0040]
此外，ste20样激酶(ste20-like kinase，slk)的底物之一是ezr，它可以磷酸化蛋白质ezr的t567位点，实验中发现，足细胞slk特异性敲除的小鼠表现为蛋白质ezr的t567位点磷酸化水平下降，同时伴随着肾小球足细胞足突增宽或消失、蛋白尿增加等。与肾病小鼠相比，足细胞slk特异性敲除后会出现更严重的蛋白尿，肾小球足细胞数量减少，蛋白质ezr的t567位点磷酸化水平也下降，因而足细胞完整的细胞骨架的维持依赖于磷酸化的ezr。根据上述实验结果可以判断，在膜性肾病中提升蛋白质ezr的t567位点的磷酸化水平同样可能有助于缓解足细胞结构破坏，从而对肾小球滤过屏障起到一定的维护作用，进而帮助改善或者减轻肾脏病的临床症状如蛋白尿，达到治疗膜性肾病的目的。因此，可以通过验证待测药物是否能够上调ezr的t567位点的磷酸化水平来判断其是否可以作为膜性肾病的治疗药物，从而完成药物筛选；或以此来制备具有相应治疗作用的膜性肾病的药物。
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上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。