一种新冠中和抗体ELISA检测方法及其试剂盒与流程

一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物体外诊断试剂技术领域，特别涉及一种新冠中 和抗体elisa检测方法及其试剂盒。


背景技术：

2.目前，聚合酶链反应(pcr)和下一代测序等分子检测技术在病毒的诊断 和监测中发挥了重要作用，但仍迫切需要可靠且通用的血清学或抗体检测方 法，通过此类技术可以快速的追溯病毒的宿主，对确诊病例、疑似病例和无 症状感染者进行诊断，以及评价康复患者和候选疫苗接种者的细胞和体液免 疫保护效果，各大高校和制药公司正在争相开发抗体检测方法，以足够的特 异性和敏感性来检测covid-19感染，目前，有两种方法针对covid-19感染 的抗体检测，第一种是基于活细胞的传统病毒中和测试法(cvnt)，可以检测 患者血液中的中和抗体(nab)，cvnt需要在专门的3级生物安全实验室(bsl3) 中进行sars-cov-2的操作，审批流程繁琐、需要高度熟练的操作人员、2-4 天才能完成，另一方面，基于假病毒的vnt(pvnt)可以在bsl2实验室中执 行，但仍需要使用细胞、高度熟练的操作人员和几天的时间才能得到结果， 因此，即使在最发达的国家，它们也不适合大规模生产和进行商业规模的测 试，第二种是酶联免疫吸附测定(elisa)和侧向流动测定(lfa)快速测定 方法，可检测总结合抗体(bab)，但无法区分bab和nab。
[0003][0004]
现有的新冠中和抗体elisa试剂盒在使用时存在一定的弊端， 新冠中和抗体elisa一般都在-20℃下进行储存，使用之前需要解冻， 但是病毒的危害，往往都是非常大的，抢救也是分秒必争的，现有 的试剂不利于快速解冻，容易造成危害，其次使用过程中，试剂一 般都存放在试剂盒内部，不利于医用人员拿取，从而耽误抢救时间， 由于试剂盒一般都为纸盒或塑料盒，解冻和使用过程中容易发生损 害，从而造成试剂损毁，给人们的使用过程带来了一定的不利影响， 为此，我们提出一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒。


技术实现要素：

[0005]
(一)解决的技术问题
[0006]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新冠中和抗体elisa 检测方法及其试剂盒，能够增加试剂盒的防水防潮能力，还增加内 部试剂的稳定性，减少损害，由于具有升降机构可以方便对试剂拿 取，从而减少抢救时间，可以有效解决背景技术中的问题。
[0007]
(二)技术方案
[0008]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种新冠中和抗 体elisa检测方法及其试剂盒，包括试剂盒主体，所述试剂盒主体 的外壁设置有防潮散热机构，所述试剂盒主体的内部设置有稳定机 构，所述试剂盒主体的左右两侧内表面设置有升降机构，所述试剂 盒主体的上端外表面设置有试剂盒盒盖。
件的外壁固定连接，且散热组件的另一端外表面通过卡扣与疏水组 件的内壁固定连接，所述密封垫的外壁通过密封凹槽与试剂盒体的 外壁固定连接，所述防水防滑组件与试剂盒体之间设置有一号黏胶， 且防水防滑组件的内壁通过一号黏胶与试剂盒体的外壁固定连接， 所述疏水组件与试剂盒体之间设置有二号黏胶，且疏水组件的外壁 通过二号黏胶与试剂盒体的内壁固定连接。
[0015]
优选的，包括以下操作步骤：
[0016]
s1、配制试剂：所述选取0.128gnaio4、10ml双蒸水配制成 0.06mnaio4(过碘酸钠)，所述配制造含有0.05mmcbbuffe、 4.77gna2co3、8.82gnahco3，ph值均为9.6的3l透析液，所述选取 0.05gnabh4，10ml双蒸水配制成5mg/mlnabh4、，所述将425g的 (nh4)2so4(ar)，用500ml量的80℃蒸馏水溶解，充分搅拌溶解后趁 热过滤，冷却后调节ph至7.4，用浓氨水，配制好的饱和硫酸铵， 瓶底应有结晶析出，所述量取1g乙二醇原液溶于100ml双蒸水中配 制成160mm乙二醇；
[0017]
s2、抗原抱被制备试剂：所述将na2co31.69g，nahco32.86g， 用氢氧化钠调ph至9.6，1l，0.45μm滤膜过滤，室温保存，从而 制成碳酸盐包被缓冲液(0.05mol/l，ph9.6)，所述将kh2po42.0g， na2hpo4
·
12h2o29g，nacl80g，kcl2.0g，ph7.4(盐酸)，1l双蒸水， 从而制备成10
×
pbs，所述将0.5
‰
tween20，pbs制备成pbst，所 述运用5％脱脂牛奶，pbst制备成封闭液，所述运用bsa1g，pbst100ml 制备成1％bsa样品稀释液，所述量取h2so4原液(21.7ml)溶于 178.3ml双蒸水中制备成终止液(2mol/lh2so4)；
[0018]
s3、hrp活化：所述称取5mghrp用500μl的双蒸水溶解，然后 加入0.06m过碘酸钠溶液0.5ml(现配现用)，避光放置4℃，反应 30min，加入160mm的乙二醇溶液0.5ml，在室温放置30min，活化 完后酶的终浓度为3.33mg/ml；
[0019]
s4、透析：所述取500μg抗体加100μl活化后hrp酶，混匀 后装入透析袋中，置于3l的0.05mmcbbuffer中，4℃过夜透析，所 述将透析后液体吸出，记录体积，加入20μl新配制的5mg/mlnabh4， 混匀，放于4℃2h，所述加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀后置于4℃ 1小时后，4℃、12000r离心20分钟，弃上清，所述将沉淀溶于500 μlpbs溶液中，装入透析袋，放入3l0.05mmcbbuffer透析液中，4℃ 搅拌过夜，中途更换透析液一次；
[0020]
s5、保存：所述透析完成后，取液体与ep管中，4℃离心12000 转20分钟，取上清和等量甘油混匀，-20℃保存；
[0021]
s6、包板：所述用na2co3和nahco3缓冲液稀释纯化的rbd抗 原，包被96孔酶标检测板(10μg/ml，100μl/孔)，4℃孵育过夜；
[0022]
s7、封闭：所述用含0.1％tween20的pbst洗液洗板两次，每次 洗液浸泡静置1～2min，弃洗液，加250μl/孔含5％脱脂牛奶的pbst 封闭液，37℃孵育封闭2h；
[0023]
s8、加样：所述运用pbst洗液洗板3次，每次洗液浸泡静置1～ 2min，再分别加100μl/孔用含5％脱脂牛奶的pbst封闭液倍比稀释 的血清，37℃孵育1h；
[0024]
s9、加二抗：所述运用pbst洗液洗板5次，每次洗液浸泡静置 2～3min，再加100μl/孔酶标二抗(1:1000的稀释比例)，室温孵 育50min～1h；
[0025]
s10、显色：所述运用pbst洗液洗板5次，每次洗液浸泡静置2～ 3min，加50μl/孔tmb显色液，避光反应15min；
[0026]
s11、od值：所述加50μl/孔终止液，终止反应，酶标仪450nm 读板测定吸光度值。
[0027]
(三)有益效果
[0028]
与现有技术相比，本发明提供了一种新冠中和抗体elisa检测 方法及其试剂盒，具备以下有益效果：
[0029]
1.该一种新冠中和抗体elisa检测方法，通过建立了替代性的 中和试验方法，可检测中和抗体，而无需任何活病毒或细胞，可在bsl2实验室中在1-2小时内完成，使用细胞受体ace2和受体结合结 构域rbd，旨在elisa板孔中模拟病毒-宿主相互作用，这种rbd-ace2 相互作用可以被患者或动物血清中的特定中和抗体中和(即被阻 断)，并解决现有2019新型冠状病毒(2019-ncov)中和抗体检测方 法要求高、耗时长和成本高等问题，提供一种不需要使用活病毒操 作即可实现对新冠病毒中和抗体的快速检测的方法。
[0030]
2.该一种新冠中和抗体elisa试剂盒，通过设置的升降机构， 当解冻完成后，医用人员拉动试剂盒盒盖，使绳索一起移动，从而 在稳定楔块、升降稳定柱、活动凹槽、稳定圆柱作用下，使试剂盘 框架上升，之后稳定圆柱落在阻挡软楔块的上端，从而使试剂盘框 架稳定，减少突然落下导致试剂损害。
[0031]
3.该一种新冠中和抗体elisa试剂盒，通过设置的稳定机构， 医用人员把试剂放入稳定机构内部，挤压板在挤压弹簧挤压下和稳 定板挤压试剂瓶，从而保持试剂瓶的稳定，减少试剂在运动过程中， 发生倾倒危害，其中挤压软垫可以有效保护试剂瓶，减少挤压板和 稳定板对瓶的危害。
[0032]
4.该一种新冠中和抗体elisa试剂盒，通过设置的防潮散热机 构，当需要使用试剂时候，工作人员通过夹具把试剂盒主体从储存 地取出，之后通过散热组件可以加快试剂盒主体内部的试剂解冻， 其中疏水组件方便内部水分从排水口排出，防水防滑组件可以阻止 水分进入试剂盒体内部，进一步增加试剂盒主体的稳定性，减少损 害。
附图说明
[0033]
图1为本发明一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒的 整体结构示意图。
[0034]
图2为本发明一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒中 升降机构的结构示意图。
[0035]
图3为本发明一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒中 图2中a处放大图。
[0036]
图4为本发明一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒中 稳定机构的结构示意图。
[0037]
图5为本发明一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒中 防潮散热机构的结构示意图。
[0038]
图6为本发明一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒中 图4中b处放大图。
[0039]
图中：1、试剂盒主体；2、升降机构；3、稳定机构；4、防潮 散热机构；5、试剂盒盒盖；201、升降框架；202、升降稳定柱；203、 活动凹槽；204、稳定楔块；205、绳索；206、旋转轴承；207、试 剂盘框架；208、稳定圆柱；209、阻挡软楔块；301、挤压弹簧；302、 试剂盘组件；303、挤压凹槽；304、挤压板；305、挤压软垫；306、 稳定板；401、试剂盒体；402、防水防滑组件；403、疏水组件；404、 排水口；405、密封凹槽；406、散热凹槽；407、密封垫；408、散 热组件。
具体实施方式
[0040]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于 明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0041]
如图1-6所示，一种新冠中和抗体elisa检测方法及其试剂盒， 包括试剂盒主体1，试剂盒主体1的外壁设置有防潮散热机构4，试 剂盒主体1的内部设置有稳定机构3，试剂盒主体1的左右两侧内表 面设置有升降机构2，试剂盒主体1的上端外表面设置有试剂盒盒盖 5，便于功能化。
[0042]
进一步的，试剂盒主体1与试剂盒盒盖5为一体成型，试剂盒 主体1与升降机构2之间设置有一号固定胶，且试剂盒主体1的左 右两侧内表面通过一号固定胶与升降机构2的一侧外表面固定连接， 试剂盒主体1与稳定机构3之间设置有一号凹槽，且试剂盒主体1 的内部通过一号凹槽与稳定机构3的外壁固定连接，试剂盒主体1 与防潮散热机构4之间设置有二号固定胶，且试剂盒主体1的外壁 通过二号固定胶与防潮散热机构4的内壁固定连接，便于连接稳固。
[0043]
进一步的，升降机构2包括升降框架201、升降稳定柱202、活 动凹槽203、稳定楔块204、绳索205、旋转轴承206、试剂盘框架 207、稳定圆柱208和阻挡软楔块209，升降稳定柱202位于升降框 架201的下端前端外表面，升降稳定柱202的内部开设有活动凹槽 203，试剂盘框架207位于升降框架201的后端外表面，稳定楔块204 位于试剂盘框架207的前端外表面，旋转轴承206位于升降框架201 的上端前端外表面，绳索205位于稳定楔块204和旋转轴承206的 外壁并延伸至试剂盒盒盖5的上端外表面，稳定圆柱208位于升降 框架201和试剂盘框架207的下端前端外表面，阻挡软楔块209位 于活动凹槽203的上端内壁，便于拿取试剂。
[0044]
进一步的，升降框架201的下端前端外表面通过稳定圆柱208 与升降稳定柱202的下端后端外表面固定连接，升降稳定柱202的 上端后端外表面通过稳定圆柱208和稳定圆柱208与试剂盘框架207 的下端前端外表面固定连接，稳定楔块204与试剂盘框架207之间 设置有三号固定胶，且试剂盘框架207的前端外表面通过三号固定 胶与稳定楔块204的后端外表面固定连接，旋转轴承206与升降框 架201之间设置有辊轴，且旋转轴承206的后端外表面通过辊轴与 升降框架201的上端前端外表面固定连接，阻挡软楔块209与活动 凹槽203之间设置有四号固定胶，且阻挡软楔块209的一侧外表面 通过四号固定胶与活动凹槽203的上端内壁固定连接，试剂盘框架 207的外壁通过升降稳定柱202、活动凹槽203、绳索205、旋转轴 承206、稳定圆柱208和阻挡软楔块209与升降框架201的内壁活动 连接，便于上升稳定。
[0045]
进一步的，稳定机构3包括挤压弹簧301、试剂盘组件302、挤 压凹槽303、挤压板304、挤压软垫305和稳定板306，试剂盘组件 302的内部开设有挤压凹槽303，挤压板304位于挤压凹槽303的内 部，挤压弹簧301位于挤压凹槽303内部并位于挤压板304的一侧 外表面，挤压软垫305位于挤压板304的另一侧外表面，稳定板306 位于试剂盘组件302的一侧内部，挤压软垫305位于稳定板306的 一侧外表面，增加试剂的稳定。
[0046]
进一步的，挤压弹簧301与试剂盘组件302之间设置有一号强 力胶，且挤压弹簧301的一侧外表面通过一号强力胶试剂盘组件302 的一侧内部固定连接，挤压板304与挤压弹簧301之间设置有二号 强力胶，且挤压板304的一侧外表面通过二号强力胶与挤压弹簧
301 的另一侧外表面固定连接，挤压软垫305与挤压板304之间设置有 三号强力胶，且挤压软垫305的一侧外表面通过三号强力胶与挤压 板304的另一侧外表面固定连接，稳定板306与试剂盘组件302为 一体成型，稳定板306与挤压软垫305之间设置有四号强力胶，且 稳定板306的一侧外表面通过四号强力胶与挤压软垫305的一侧外 表面固定连接，有效保护试剂屏的安全。
[0047]
进一步的，防潮散热机构4包括试剂盒体401、防水防滑组件 402、疏水组件403、排水口404、密封凹槽405、散热凹槽406、密 封垫407和散热组件408，防水防滑组件402位于试剂盒体401的外 壁，疏水组件403位于试剂盒体401的内壁，试剂盒体401的下端 外表面中部开设有排水口404，防水防滑组件402和疏水组件403 的内部均开设有密封凹槽405，试剂盒体401的内部开设有散热凹槽 406，散热凹槽406的内部设置有散热组件408，密封垫407位于密 封凹槽405的内部，散热组件408与防水防滑组件402和疏水组件 403之间均设置有卡扣，且散热组件408的一端外表面通过卡扣防水 防滑组件402的外壁固定连接，且散热组件408的另一端外表面通 过卡扣与疏水组件403的内壁固定连接，密封垫407的外壁通过密 封凹槽405与试剂盒体401的外壁固定连接，防水防滑组件402与 试剂盒体401之间设置有一号黏胶，且防水防滑组件402的内壁通 过一号黏胶与试剂盒体401的外壁固定连接，疏水组件403与试剂 盒体401之间设置有二号黏胶，且疏水组件403的外壁通过二号黏 胶与试剂盒体401的内壁固定连接，便于快速散热。
[0048]
进一步的，包括以下操作步骤：
[0049]
s1、配制试剂：选取0.128gnaio4、10ml双蒸水配制成 0.06mnaio4过碘酸钠，配制造含有0.05mmcbbuffe、4.77gna2co3、 8.82gnahco3，ph值均为9.6的3l透析液，选取0.05gnabh4，10ml 双蒸水配制成5mg/mlnabh4、，将425g的(nh4)2so4(ar)，用500ml 量的80℃蒸馏水溶解，充分搅拌溶解后趁热过滤，冷却后调节ph 至7.4，用浓氨水，配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出，量取 1g乙二醇原液溶于100ml双蒸水中配制成160mm乙二醇；
[0050]
s2、抗原抱被制备试剂：将na2co31.69g，nahco32.86g，用氢 氧化钠调ph至9.6，1l，0.45μm滤膜过滤，室温保存，从而制成 碳酸盐包被缓冲液0.05mol/l，ph9.6，将kh2po42.0g， na2hpo4
·
12h2o29g，nacl80g，kcl2.0g，ph7.4盐酸，1l双蒸水， 从而制备成10
×
pbs，将0.5
‰
tween20，pbs制备成pbst，运用5％ 脱脂牛奶，pbst制备成封闭液，运用bsa1g，pbst100ml制备成1％bsa 样品稀释液，量取h2so4原液21.7ml溶于178.3ml双蒸水中制备成 终止液2mol/lh2so4；
[0051]
s3、hrp活化：称取5mghrp用500μl的双蒸水溶解，然后加入 0.06m过碘酸钠溶液0.5ml现配现用，避光放置4℃，反应30min， 加入160mm的乙二醇溶液0.5ml，在室温放置30min，活化完后酶的 终浓度为3.33mg/ml；
[0052]
s4、透析：取500μg抗体加100μl活化后hrp酶，混匀后装 入透析袋中，置于3l的0.05mmcbbuffer中，4℃过夜透析，将透析 后液体吸出，记录体积，加入20μl新配制的5mg/mlnabh4，混匀， 放于4℃2h，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀后置于4℃1小时后， 4℃、12000r离心20分钟，弃上清，将沉淀溶于500μlpbs溶液中， 装入透析袋，放入3l0.05mmcbbuffer透析液中，4℃搅拌过夜，中 途更换透析液一次；
[0053]
s5、保存：透析完成后，取液体与ep管中，4℃离心12000转 20分钟，取上清和等量甘油混匀，-20℃保存；
[0054]
s6、包板：用na2co3和nahco3缓冲液稀释纯化的rbd抗原， 包被96孔酶标检测板10μg/ml，100μl/孔，4℃孵育过夜；
[0055]
s7、封闭：用含0.1％tween20的pbst洗液洗板两次，每次洗液 浸泡静置1～2min，弃洗液，加250μl/孔含5％脱脂牛奶的pbst封 闭液，37℃孵育封闭2h；
[0056]
s8、加样：运用pbst洗液洗板3次，每次洗液浸泡静置1～2min， 再分别加100μl/孔用含5％脱脂牛奶的pbst封闭液倍比稀释的血 清，37℃孵育1h；
[0057]
s9、加二抗：运用pbst洗液洗板5次，每次洗液浸泡静置2～ 3min，再加100μl/孔酶标二抗1:1000的稀释比例，室温孵育 50min～1h；
[0058]
s10、显色：运用pbst洗液洗板5次，每次洗液浸泡静置2～3min， 加50μl/孔tmb显色液，避光反应15min；
[0059]
s11、od值：加50μl/孔终止液，终止反应，酶标仪450nm读 板测定吸光度值。
[0060]
工作原理
[0061]
本发明由试剂盒主体1、升降机构2、稳定机构3、防潮散热机 构4、试剂盒盒盖5、升降框架201、升降稳定柱202、活动凹槽203、 稳定楔块204、绳索205、旋转轴承206、试剂盘框架207、稳定圆 柱208、阻挡软楔块209、挤压弹簧301、试剂盘组件302、挤压凹 槽303、挤压板304、挤压软垫305、稳定板306、试剂盒体401、防 水防滑组件402、疏水组件403、排水口404、密封凹槽405、散热 凹槽406、密封垫407与散热组件408等部件组成，首先医用人员把 试剂放入稳定机构3内部，挤压板304在挤压弹簧301挤压下和稳 定板306挤压试剂瓶，从而保持试剂瓶的稳定，减少试剂在运动过 程中，发生倾倒危害，其中挤压软垫305可以有效保护试剂瓶，减 少挤压板304和稳定板306对瓶的危害，之后工作人员按压试剂盘 框架207，使得稳定圆柱208离开阻挡软楔块209的上端，从而方便 试剂盘框架207下降，从而方便封闭，之后把试剂盒盒盖5闭合在 试剂盒主体1的上端，之后工作人员把试剂盒主体1放入-20℃下进 行保存，当需要使用试剂时候，工作人员通过夹具把试剂盒主体1 从储存地取出，之后通过散热组件408可以加快试剂盒主体1内部 的试剂解冻，其中疏水组件403方便内部水分从排水口404排出， 防水防滑组件402可以阻止水分进入试剂盒体401内部，进一步增 加试剂盒主体1的稳定性，减少损害，当解冻完成后，医用人员拉 动试剂盒盒盖5，使绳索205一起移动，从而在稳定楔块204、升降 稳定柱202、活动凹槽203、稳定圆柱208作用下，使试剂盘框架207 上升，之后稳定圆柱208落在阻挡软楔块209的上端，从而使试剂 盘框架207稳定，减少突然落下导致试剂损害，上升的试剂盘框架 207方便医用人员从试剂盘组件302内部拿取试剂，减少拿取试剂时 间，增加抢救效率。
[0062]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二(一号、二号)等 之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作 区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这 种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何 其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过 程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备 所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”ꢀ
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设 备中还存在另外的相同要素。
[0063]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优 点。本行业的技
术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本 发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由 所附的权利要求书及其等效物界定。