一种青钱柳的hplc指纹图谱检测方法
技术领域
1.本发明涉及中药材质量控制方法，具体涉及一种青钱柳的hplc指纹图谱检测方法。
背景技术：2.青钱柳(cyclocarya paliurus(batal.)iljinsk.)为胡桃科(juglandaceae)青钱柳属(cyclocaryailjinsk.)植物，又名青钱李、山化树、摇钱树，属落叶乔木，为国家二级保护树种，该属现仅存一种，且仅存于中国，被誉为植物界的大熊猫。青钱柳具有广泛的药用价值，被称为医学界的第三棵树，是我国特有的珍稀药用植物资源。
3.青钱柳天然分布范围比较广，主要分布于安徽、江苏等华东地区和福建、广东、广西等华南地区以及湖南、湖北、四川、贵州等地，主要分布于海拔500m～2 500m的山区、溪谷、林缘、林内或石灰岩山地。四川省青钱柳天然资源主要分布于四川省沐川县、南江县等。
4.2013年国家卫生计划委员会颁布“关于批准裸藻等8种新食品原料的公告(公告2013年第4号)”，根据《中华人民共和国食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》有关规定，批准青钱柳叶为新食品原料，进一步证明了青钱柳的安全性。
5.据《中华本草》、《中国中药资源志要》及《全国中草药汇编》等记载，其树皮、叶片具有清热解毒、止痛等功用，还可用于治疗顽癣。《保元汇集》载有：“摇钱树叶，甘凉，清热生津而除烦”。巴中市南江县《泰安堂》载有“摇钱散”秘方治疗痛风。青钱柳药用历史悠久，且现代研究也证明，其叶提取物中含有大量的生理活性成分，包括黄酮类、三萜类、水溶性多糖和生物碱等，这些物质对人体健康具有重要的促进作用，如防治“三高”、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等功效。其中在防治糖尿病方面功效尤为突出。
6.截止2018年，我国糖尿病患病人数超过9000万，占据全球患病率第1位。青钱柳因其在治疗糖尿病方面的突出功效而受到广泛关注。近10多年国内利用青钱柳开发保健品和药物剂型呈突飞猛进之势。通过调研发现，青钱柳的发展分为萌芽期(1988～2013年)和增长期(2013年至今)。可能与2013年国家卫计委批准青钱柳为新食品原料相关。在萌芽期，有关青钱柳开发利用的文献为每年20篇左右，专利申请40余件，且50％左右为个人申请专利；增长期的青钱柳相关文献与专利数量急速增加，每年发表相关文献近100篇，说明近年来青钱柳产业被加速开发。
7.虽然青钱柳的用途正在逐步被人发掘，但是目前青钱柳相关质量标准并未收载于《中国药典》，相关领域也缺少对其质量控制标准的研究。为了充分利用药材资源，带动产业升级，有必要进行青钱柳有效成分相关的研究，以建立青钱柳质量标准。
8.目前对于青钱柳的hplc分析已有部分研究，例如：专利“cn105675755a一种基于hplc的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法”提供了通过hplc检测青钱柳中黄酮类含量的方法。
9.但是，上述对青钱柳的hplc指纹图谱的检测方法中，对青钱柳的前处理的方法与色谱条件等仍然不够完善，使得得到的指纹图谱中存在较多杂质峰且各目标成分的峰之间
相互分离较差，从而影响了对青钱柳的质量的鉴别。
技术实现要素：10.针对现有技术中青钱柳的hplc指纹图谱存在较多杂质峰且各目标成分的峰之间相互分离较差的问题，本发明提供一种青钱柳的hplc指纹图谱检测方法，其目的在于：提供一种优化的青钱柳的前处理的方法，获得杂质峰含量少、目标成分峰分离度好的指纹图谱。
11.一种青钱柳提取物，采用乙醇与强酸的混合溶液作为提取溶剂，加热提取青钱柳样品中的主要成分得到；通过hplc测试其指纹图谱，包括如下特征峰：
12.槲皮素11.616
±
5％min；
13.山奈酚21.898
±
5％min。
14.本发明还提供一种青钱柳的hplc指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
15.(1)采用乙醇与强酸的混合溶液作为提取溶剂，加热提取青钱柳样品中的主要成分，得到供试品溶液；
16.(2)测试供试品溶液得到供试品溶液的hplc指纹图谱。
17.优选的，主要成分包括槲皮素和山奈酚。
18.优选的，步骤(1)中，所述乙醇为体积分数90-99％的乙醇，优选为体积分数95％的乙醇；所述强酸为质量分数30-37％的盐酸，所述乙醇与强酸的体积比为5：1-3：1，优选为5：1。
19.优选的，步骤(1)中，加热提取的条件为：80-100℃水浴回流提取0.8-1.2h；优选的，加热提取的条件为：90℃水浴回流提取1h。
20.优选的，步骤(1)中，加热提取完成后，用提取溶剂将混合溶液的重量补足至加热提取前的重量，混匀后过滤得到供试品溶液。
21.优选的，步骤(1)中，青钱柳制成粉末后加入提取溶剂，所述青钱柳粉末与提取溶剂的用量比例为1g：40-80ml，优选为1g：60ml。
22.优选的，所述步骤(2)中，流动相采用甲醇-磷酸溶液，磷酸溶液的浓度为质量分数0.2-0.6％，流动相甲醇与磷酸溶液的体积比为40:60-60:40，优选为45:55。
23.优选的，步骤(2)中，色谱条件为：流速为0.8-1.2ml/min；和/或，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；和/或，柱温为28-32℃；和/或，进样量为5-10μl，优选为5μl；和/或，检测波长为360-370nm，优选为365nm。
24.优选的，所述色谱柱采用agilent zorbax sb-c18 4.6
×
150mm、agilent eclipse plus c18 4.6
×
250mm或phenomenex kinetex c18 4.6
×
250mm。
25.优选的，还包括如下步骤：配制槲皮素标准品和山奈酚标准品的标准溶液，通过hplc测试并绘制槲皮素标准品和山奈酚标准品的峰面积-浓度的标准曲线；在获得供试品溶液的hplc指纹图谱后，通过标准曲线计算青钱柳样品中槲皮素和山奈酚的含量。
26.优选的，槲皮素标准品和山奈酚标准品的标准溶液以甲醇作为溶剂。
27.通过本发明优选后的青钱柳前处理条件，能够有效提取青钱柳中的槲皮素和山奈酚等主要成分，且减少杂质的溶解。此外，通过这样的前处理条件，在后续的色谱分离过程中，待测主要成分之间以及主要成分与杂质之间的分离度较好，使得得到的hplc指纹图谱中槲皮素和山奈酚的谱峰的纯度提高，有利于提高成分鉴别及定量计算含量的准确性。在
优选的方案中，本发明还对色谱条件进行优化，能够进一步提高待测主要成分之间以及主要成分与杂质之间的分离度。
28.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
29.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
30.图1为实施例中混合对照品溶液的hplc色谱图；
31.图2为实施例中青钱柳样品的hplc色谱图。
具体实施方式
32.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
33.实施例1
34.1、本实施例所用实验材料如下
35.agilent 1260型高效液相色谱仪
36.agilentzorbax sb-c18色谱柱(4.6
×
150mm，5μm)；
37.agilenteclipse plus c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)；
38.phenomenexkinetex c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)；
39.槲皮素(四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20061112，纯度≥98％)；
40.山奈酚(四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20042613，纯度≥98％)。
41.2、本实施例所采用色谱条件为
42.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(45:55)为流动相；流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为365nm。
43.3、本实施例标准曲线的绘制过程为：
44.(1)配制标准品溶液
45.取槲皮素、山奈酚标准品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素0.79mg、山奈酚0.50mg的混合对照品溶液，即得。
46.(2)标准曲线的绘制
47.精密量取上述混合对照品溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml与1.4ml，分别置10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得到不同浓度的标准溶液。按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。标准曲线的线性回归结果如下表所示：
48.表1标准曲线线性回归结果表
[0049][0050]
4、青钱柳样品测定
[0051]
(1)供试品溶液制备：取青钱柳样品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，精密加入95％乙醇-盐酸(体积比5：1)混合溶液30ml，称定重量，90℃水浴回流提取1小时，放冷，再称定重量，用95％乙醇-盐酸(体积比5：1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0052]
(2)分别精密吸取混合对照品溶液10μl和供试品溶液5μl，按上述色谱条件进行测定。分别得到混合对照品溶液的色谱图(图1)和青钱柳样品的色谱图(图2)。从图2中可以看出，本实施例得到的青钱柳样品的色谱图中，主要考察的成分槲皮素和山奈酚的谱峰与其他谱峰之间的分离度良好，峰形对称。
[0053]
5、方法学考察
[0054]
(1)专属性
[0055]
本实施例得到的青钱柳样品的色谱图中，槲皮素色谱峰峰纯度为99.60％，山奈酚色谱峰峰纯度为99.88％，表明方法专属性良好。
[0056]
(2)精密度
[0057]
取同一槲皮素、山奈酚混合对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，计算槲皮素峰面积的rsd为0.10％，山奈酚峰面积的rsd为0.23％，表明精密度满足测定需求。
[0058]
表2精密度测定结果
[0059][0060]
(3)重复性
[0061]
以同样方法制备6份供试品溶液。按上述色谱条件进行测定，根据标准曲线计算槲皮素含量(％)的rsd为1.23％，山奈酚含量(％)的rsd为0.87％，证明方法重复性良好。
[0062]
表3重复性测定结果
[0063][0064]
(4)稳定性
[0065]
制得供试品溶液后，分别于0、2、4、6、8、12、24h，按上述色谱条件进行测定，计算槲皮素峰面积的rsd为0.47％，山奈酚峰面积的rsd为0.64％，说明供试品溶液在24小时内稳定。
[0066]
表4稳定性测定结果
[0067][0068]
(5)加样回收
[0069]
取青钱柳粉末6份，每份0.25g，精密称定，按照质量比例1:1，加入槲皮素、山奈酚混合对照品溶液1.0ml，再精密加入95％乙醇-盐酸(5：1)混合溶液30ml，称定重量，90℃水浴回流提取1h，放冷，再称定重量，用95％乙醇-盐酸(5：1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，按上述色谱条件进行测定，计算加样回收率。依据《中国药典》2015年版四部指导原则9101，加样回收率应在92％～105％范围内，符合规定，表明方法准确度良好。
[0070]
表5加样回收测定结果
[0071][0072]
(6)耐用性
[0073]
分别考察不同柱温(28℃、30℃、32℃)、不同流速(0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min)、不同流动相ph(0.2％磷酸、0.4％磷酸、0.6％磷酸)、不同色谱柱agilent zorbax sb-c18 4.6
×
150mm、agilent eclipse plus c18 4.6
×
250mm、phenomenex kinetex c18 4.6
×
250mm)对测定的影响，结果表明以上因素对青钱柳含量测定无影响。证明本发明方法耐用性良好。
[0074]
为了进一步说明本发明的有益效果，进行如下条件筛选实验：
[0075]
实验例1
[0076]
本实验例的供试品制备方法、高效液相色谱检测方法与实施例1相同，区别在于改变了流动相的比例，其中：
[0077]
实验组
①
的流动相为体积比60:40的甲醇-0.4％磷酸溶液，实验组
②
的流动相为体积比45:55的甲醇-0.4％磷酸溶液(与实施例1相同)。
[0078]
对两个实验组得到的色谱图进行对比，实验组
①
的色谱峰出现时间早，无法进行峰指认，分离度不符合要求；实验组
②
的色谱图色谱峰分布良好，能够进行峰指认，槲皮素和山奈酚的分离度均大于1.5。
[0079]
通过上述对比实验结果可见，体积比45:55的甲醇-0.4％磷酸溶液为优选的流动相选择。
[0080]
通过以上实施例和实验例可知，本发明提供的方法得到的青钱柳样品的色谱图中，主要考察的成分槲皮素和山奈酚的谱峰与其他谱峰之间的分离度良好，峰形对称。且方法的专属性、精密度、重复性、稳定性、加样回收率和耐性性均很好。因而本发明提供的方法能够满足准确鉴别青钱柳及测试其有效成分含量的需求。