一种测定组织中扶正化瘀制剂商陆苷和商陆素浓度的方法与流程

1.本发明涉及生物样品色谱检测技术领域，尤其涉及一种采用uhplc-ms/ms法测定哺乳动物组织中扶正化瘀制剂商陆苷和商陆素的测定方法。


背景技术：

2.慢性肝病病程长，病情复杂，但从中医上来说主要是机体感染疫毒，引起正邪相搏，如正气虚则不能祛邪，至病情缠绵久致顽疾，其基本病机为正虚邪实、虚实共存。正虚主要是气阴两虚，而邪实则为蕴热化湿，血瘀络阻，气阴两虚、湿热疫毒内留。从西医角度来说肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，肝纤维化是慢性肝病最重要的病理特征，肝纤维化与肝硬化既有联系又有区别，从病理上看，仅有弥漫性肝纤维沉积增加称肝纤维化，而弥漫性肝纤维化同时伴有肝小叶结构被破坏则为肝硬化。从发病学看，肝纤维化是肝硬化的前期病变、是可逆的、而肝硬化是肝纤维化进一步发展的结果。从临床观察看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，肝纤维化一般不致肝功能障碍，但可有门静脉高压。肝纤维化是肝损伤后的修复过程，引起肝脏细胞外基质(ecm)和量的改变。
3.肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化所必经的病理过程，寻找阻止、延缓甚至逆转肝纤维化的药物，是肝病研究急待解决的问题。长期以来，中医药在抗肝纤维化方面发挥着重要的作用。中医认为，肝纤维化既有瘀滞的一面，也有正气虚损的一面，扶正化瘀是重要的治疗原则。扶正化瘀胶囊(片剂)正是针对慢性肝炎肝纤维化、肝硬化的“瘀血内结、正气虚弱”，在反复药理研究基础上而配伍组方研制的，由活血化瘀和益精补虚类药物组成。其中丹参活血化瘀，为君药；虫草菌丝补虚益精，桃仁去瘀破癓，为臣药；松花粉养肝散肝，绞股蓝清热解毒，为佐药；五味子酸温补肝，为使药。药理实验表明，该复方制剂具有抗肝纤维化，降低门脉压力，保护肝细胞，减轻脂质过氧化损伤，调整免疫功能，减轻肝脏炎症等功效。扶正化瘀制剂经临床验证可使肝纤维化分期运转率达52％～58.3％，因此，扶正化瘀制剂治疗肝硬化失代偿疗效明显。
4.扶正化瘀制剂是由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子六味药组成，具有治疗肝、肺、肾纤维化的作用。目前上市有两种剂型：(1)扶正化瘀胶囊：2002年获得中国国家新药证书(国药证字z20020053)，并批准国家药品标准ws3-459(z-79)-2005(z)；(2)扶正化瘀片剂：2005年获得国家新药证书(国药证字z20050564)，并批准国家药品标准ybz19332005-2009z。扶正化瘀制剂主要用于乙型肝炎肝纤维化属瘀血阻络，肝肾不足证者，症见胁下痞块，胁肋疼痛，面色晦暗，或见赤缕红斑，腰膝酸软，疲倦乏力，头晕目涩，舌质暗红或有瘀斑，苔薄或微黄，脉弦细。
5.目前，扶正化瘀制剂有效成分入哺乳动物组织的研究尚处于空白阶段，国内外无相关研究报导，也缺乏该扶正化瘀制剂在哺乳动物组织中商陆苷、商陆素的测定方法，扶正化瘀制剂在各大组织中的分布不清楚，难以为质量控制及指导临床合理用药提供依据。


技术实现要素：

6.基于此，本发明所要解决的技术问题是提供了一种测定组织中扶正化瘀制剂商陆苷和/或商陆素浓度的方法，该方法包括以下步骤：
7.(1)待测组织样本预处理，获取待测液；
8.(2)商陆苷和/或商陆素标准曲线制备；以及
9.(3)液相色谱-质谱联用检测该待测液中商陆苷和/或商陆素浓度，
10.其中，该液相色谱-质谱联用的色谱条件为：色谱柱：acquityhss t3柱(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，流动相：水相(a)为酸水溶液，有机相(b)为甲醇或乙腈；洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0-1min，70％a；1-15min，70％-5％a；15-19min，5％a；19.01min，95％a；19.01-22min，95％a；
11.其中，该液相色谱-质谱联用的质谱条件为：电喷雾离子源(esi)，采用正离子模式检测，质量扫描范围m/z 200-500。
12.进一步地，该待测组织样本为哺乳动物的心、肝、脾或肾。
13.进一步地，该哺乳动物为大鼠、小鼠或犬。
14.进一步地，该预处理包括以下步骤：
15.(1)给予该扶正化瘀制剂后，分别于不同时间点将哺乳动物处死，分离该组织样本，放入生理盐水中漂洗以除去血液，滤纸拭干；
16.(2)称取该组织样本，剪碎，置于离心管中，加入第一溶剂溶解，再加入研磨珠，研磨再离心，得到上清液；以及
17.(3)将该上清液冷冻干燥，加入第二溶剂复溶，涡旋再离心，得到该待测液。
18.进一步地，该第一溶剂和该第二溶剂是相同的或不同的。
19.进一步地，该第一溶剂和该第二溶剂选自水、c1～c4的醇、二醇、乙腈中的一种或多种。
20.进一步地，该第一溶剂为甲醇。
21.进一步地，该第二溶剂为70％甲醇的水溶液。
22.进一步地，该不同时间点为15min、30min、120min和360min。
23.进一步地，该离心的条件为10,000～15,000rpm，4℃条件下离心10～15min。
24.进一步地，该组织样品的重量为600～1000mg。
25.进一步地，该第一溶剂的体积为300～1500μl。
26.进一步地，该上清液的体积为500～1000μl。
27.进一步地，该第二溶剂的体积为50～150μl。
28.进一步地，该研磨的时间为30s至2min。
29.进一步地，该涡旋的时间为20s至2min。
30.进一步地，该待测液的体积为50～100μl。
31.进一步地，该离心的条件为12,000rpm，4℃条件下离心10～12min。
32.进一步地，该组织样品的重量为600mg。
33.进一步地，该第一溶剂的体积为1000μl。
34.进一步地，该上清液的体积为800μl。
35.进一步地，该第二溶剂的体积为100μl。
36.进一步地，该研磨的时间为1min。
37.进一步地，该涡旋的时间为30s。
38.进一步地，该待测液的体积为50μl。
39.进一步地，该标准曲线制备包括以下步骤：
40.(1)分别称量适量的商陆苷、商陆素和柳胺酚，用甲醇溶解得到1mg/ml的商陆苷母液，1mg/ml的商陆素母液和1mg/ml的柳胺酚溶液；
41.(2)将该柳胺酚母液用甲醇稀释成浓度为50ng/ml的内标工作液，用甲醇将该商陆苷母液和该商陆素母液稀释成1～2000ng/ml的含有该商陆苷和该商陆素的不同浓度的混合标准曲线工作液；
42.(3)将该混合标准曲线工作液与该内标工作液混合后，进行该液相色谱-质谱联用分析，得到数据；以及
43.(4)使用内标法对该数据进行处理，分别以商陆苷、商陆素的浓度为横坐标，商陆苷和柳胺酚的峰面积比值以及商陆素和柳胺酚的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到商陆苷标准曲线和商陆素标准曲线。
44.进一步地，该商陆苷的保留时间为8～9min。
45.进一步地，该商陆素的保留时间为13～14min。
46.进一步地，该酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。
47.进一步地，该酸为甲酸、乙酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、冰乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、冰乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
48.进一步地，该酸水溶液为0.1％甲酸水溶液。
49.进一步地，该有机相(b)为乙腈。
50.进一步地，该液相色谱-质谱联用的色谱条件进一步包括：柱温：30-45℃，流速：0.2-0.4ml/min；进样体积2-5μl。
51.进一步地，柱温：40℃，流速：0.3ml/min；进样体积3μl。
52.进一步地，自动进样器的温度为10℃。
53.进一步地，该自动进样器的清洗液为水、甲醇、乙腈和异丙醇以1：1：1：1比例混合的溶液。
54.进一步地，该液相色谱-质谱联用的质谱条件进一步包括：分辨率70,000；鞘气流速30au；辅助气流速13au；毛细管温度320℃；s透镜射频水平50(s-lens rf level 50)；辅助气温度300℃；喷雾电压+3.2kv。
55.进一步地，质谱仪为四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统。
56.进一步地，雾化气体和干燥气体均为氮气。
57.进一步地，该质谱仪的检测条件为全扫描模式检测。
58.根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述方法在构建检测试剂盒或检测装置中的用途，该检测试剂盒或该检测装置用于检测组织中扶正化瘀制剂商陆苷和/或商陆素浓度。
59.应用本发明的技术方案，本发明首先利用uhplc，选择合适的有机溶剂及合适的比例，可使组织中的待测组分在不同比例的流动相中分离，再通过质谱检测仪进行检测，且分析方法灵敏和快捷，以利于进行哺乳动物组织中商陆苷、商陆素的测定。
附图说明
60.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
61.图1为商陆苷uhplc-ms色谱图。
62.图2为商陆素uhplc-ms色谱图。
具体实施方式
63.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
64.术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或隐含地包括一个或者更多个该特征。
65.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
66.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本发明所要求保护的范围。
67.本发明公开了一种测定组织中扶正化瘀制剂商陆苷和/或商陆素浓度的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。
68.除特别指出，本发明提供的技术方案中所用药品、试剂、仪器均可由常规渠道或市场购得。
69.本发明提供了一种测定组织中扶正化瘀制剂商陆苷和/或商陆素浓度的方法，该方法包括以下步骤：
70.(1)待测组织样本预处理，获取待测液；
71.(2)商陆苷和/或商陆素标准曲线制备；以及
72.(3)液相色谱-质谱联用检测该待测液中商陆苷和/或商陆素浓度，
73.其中，该液相色谱-质谱联用的色谱条件为：色谱柱：acquityhss t3柱(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，流动相：水相(a)为酸水溶液，有机相(b)为甲醇或乙腈；洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0-1min，70％a；1-15min，70％-5％a；15-19min，5％a；19.01min，95％a；19.01-22min，95％a；
74.其中，该液相色谱-质谱联用的质谱条件为：电喷雾离子源(esi)，采用正离子模式
检测，质量扫描范围m/z 200-500。
75.其中扶正化瘀制剂(原料粉末)参照国家药品标准ybz19332005-2009z进行制备，其制备方法如下所示：
76.取丹参666g、桃仁166g、绞股蓝500g分别加水10倍量、8倍量，煎煮2次，第一次2小时，第二次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至相对密度为1.20(50℃～55℃)，放冷，在搅拌下加乙醇使含醇量至70％，静置沉淀，取上清液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2(50℃～55℃)，备用；另取发酵虫草菌粉334g、五味子(制)166g，分别加70％乙醇10倍量、8倍量，加热回流2次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并回流液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2(50℃～55℃)，备用；再取松花粉166g，分别加50％乙醇10倍量、8倍量，50℃温浸2次，第一次4小时，第二次2小时，合并浸出液，浓缩至相对密度为1.1-1.2(50℃～55℃)，与上述二种备用的浓缩液合并，干燥，获得原料粉末。
77.在一种优选的实施方式中，该待测组织样本为哺乳动物的心、肝、脾或肾。
78.在一种优选的实施方式中，该哺乳动物为大鼠、小鼠或犬。
79.在一种优选的实施方式中，该预处理包括以下步骤：
80.(1)给予该扶正化瘀制剂后，分别于不同时间点将哺乳动物处死，分离该组织样本，放入生理盐水中漂洗以除去血液，滤纸拭干；
81.(2)称取该组织样本，剪碎，置于离心管中，加入第一溶剂溶解，再加入研磨珠，研磨再离心，得到上清液；以及
82.(3)将该上清液冷冻干燥，加入第二溶剂复溶，涡旋再离心，得到该待测液。
83.在一种优选的实施方式中，该第一溶剂和该第二溶剂是相同的或不同的。
84.在一种优选的实施方式中，该第一溶剂和该第二溶剂选自水、c1～c4的醇、二醇、乙腈中的一种或多种。
85.在一种优选的实施方式中，该第一溶剂为甲醇。
86.在一种优选的实施方式中，该第二溶剂为70％甲醇的水溶液。
87.在一种优选的实施方式中，该不同时间点为15min、30min、120min和360min。
88.在一种优选的实施方式中，该离心的条件为10,000～15,000rpm，4℃条件下离心10～15min。
89.在一种优选的实施方式中，该组织样品的重量为600～1000mg。
90.在一种优选的实施方式中，该第一溶剂的体积为300～1500μl。
91.在一种优选的实施方式中，该上清液的体积为500～1000μl。
92.在一种优选的实施方式中，该第二溶剂的体积为50～150μl。
93.在一种优选的实施方式中，该研磨的时间为30s至2min。
94.在一种优选的实施方式中，该涡旋的时间为20s至2min。
95.在一种优选的实施方式中，该待测液的体积为50～100μl。
96.在一种优选的实施方式中，该离心的条件为12,000rpm，4℃条件下离心10～12min。
97.在一种优选的实施方式中，该组织样品的重量为600mg。
98.在一种优选的实施方式中，该第一溶剂的体积为1000μl。
99.在一种优选的实施方式中，该上清液的体积为800μl。
100.在一种优选的实施方式中，该第二溶剂的体积为100μl。
101.在一种优选的实施方式中，该研磨的时间为1min。
102.在一种优选的实施方式中，该涡旋的时间为30s。
103.在一种优选的实施方式中，该待测液的体积为50μl。
104.在一种优选的实施方式中，该标准曲线制备包括以下步骤：
105.(1)分别称量适量的商陆苷、商陆素和柳胺酚，用甲醇溶解得到1mg/ml的商陆苷母液，1mg/ml的商陆素母液和1mg/ml的柳胺酚溶液；
106.(2)将该柳胺酚母液用甲醇稀释成浓度为50ng/ml的内标工作液，用甲醇将该商陆苷母液和该商陆素母液稀释成1～2000ng/ml的含有该商陆苷和该商陆素的不同浓度的混合标准曲线工作液；
107.(3)将该混合标准曲线工作液与该内标工作液混合后，进行该液相色谱-质谱联用分析，得到数据；以及
108.(4)使用内标法对该数据进行处理，分别以商陆苷、商陆素的浓度为横坐标，商陆苷和柳胺酚的峰面积比值以及商陆素和柳胺酚的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到商陆苷标准曲线和商陆素标准曲线。
109.在定量过程中，以商陆苷、商陆素为对照品，并以柳胺酚为内标，采用内标法准确、灵敏地监测，实现对商陆苷、商陆素的定量检测。
110.在一种优选的实施方式中，该商陆苷的保留时间为8～9min。
111.在一种优选的实施方式中，该商陆苷的保留时间为约8.66min。
112.关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的
±
1％，但明确地包括确切的数值。
113.在一种优选的实施方式中，该商陆素的保留时间为13～14min。
114.在一种优选的实施方式中，该商陆素的保留时间为约13.42min。
115.关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的
±
1％，但明确地包括确切的数值。
116.在一种优选的实施方式中，该酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。
117.在一种优选的实施方式中，该酸为甲酸、乙酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、冰乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、冰乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
118.为了使色谱峰得到更好的分离，保留时间适宜，且重现性和稳定性更优，在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.1％甲酸水溶液。
119.在一种优选的实施方式中，该有机相(b)为乙腈。
120.在一种优选的实施方式中，该液相色谱-质谱联用的色谱条件进一步包括：柱温：30-45℃，流速：0.2-0.4ml/min；进样体积2-5μl。
121.为了获得更好的色谱峰分离效果且具有较低的柱压，在一种优选的实施方式中，柱温：40℃，流速：0.3ml/min；进样体积3μl。
122.在一种优选的实施方式中，自动进样器的温度为10℃。
123.在一种优选的实施方式中，该自动进样器的清洗液为水、甲醇、乙腈和异丙醇以1：1：1：1比例混合的溶液。
124.在一种优选的实施方式中，该液相色谱-质谱联用的质谱条件进一步包括：分辨率70,000；鞘气流速30au；辅助气流速13au；毛细管温度320℃；s透镜射频水平50；辅助气温度300℃；喷雾电压+3.2kv。
125.在一种优选的实施方式中，质谱仪为四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统。
126.在一种优选的实施方式中，雾化气体和干燥气体均为氮气。
127.在一种优选的实施方式中，该质谱仪的检测条件为全扫描模式检测。
128.本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱方式、检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价哺乳动物组织中扶正化瘀制剂商陆苷、商陆素的含量。
129.根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述方法在构建检测试剂盒或检测装置中的用途，该检测试剂盒或该检测装置用于检测组织中扶正化瘀制剂商陆苷和/或商陆素浓度。
130.实施例
131.一种组织中扶正化瘀制剂(扶正化瘀方)哺乳动物组织中商陆苷、商陆素的测定方法包括：
132.1、组织样品预处理方法
133.大鼠20只，随机分为4组，每组5只，分别于给药前禁食不禁水12h，按15mg/g体重灌胃给予中药复方扶正化瘀制剂(原料粉末)后，分别于15，30，120，360min将给与扶正化瘀制剂(原料粉末)的大鼠处死，分离其心、肝、脾、肾，放入生理盐水中漂洗以除去血液，滤纸拭干后，各称取600mg左右，剪碎放于1.5ml ep管中，分别加入1ml甲醇，再加入一颗研磨珠，盖好盖子，置于组织研磨机中研磨1min，然后在12,000rpm，4℃条件下离心12min，取上清800μl，氮吹，然后加入100μl 70％的甲醇复溶，涡旋30秒后，在12,000rpm，4℃条件下离心12min，取上清50μl，进液质联用仪进行分析。
134.2、uhplc/ms测定方法
135.液质联用仪：dionex ultimate 3000高压液相色谱(带自动进样器)、q exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪(配有第二代加热电喷雾离子化设计的离子源，h-esi ii)。
136.色谱柱：acquityhss t3柱(2.1mm
×
100mm，1.8μm)。
137.流动相：水相(a)为0.1％甲酸水溶液，有机相(b)为乙腈；
138.洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0-1min，70％a；1-15min，70％-5％a；15-19min，5％a；19.01min，95％a；19.01-22min，95％a；
139.柱温：40℃，
140.流速：0.3ml/min，
141.样品体积3μl。
142.质谱条件：电喷雾离子源(esi)，采用正离子full-ms模式检测，质量扫描范围m/z 200-500，分辨率70,000；鞘气流速30au；辅助气流速13au；毛细管温度320℃；s-lens rf level 50；辅助气温度300℃；喷雾电压+3.2kv。
143.3、商陆苷与商陆素来源、化合物类型与纯度
144.商陆苷与商陆素来源、化合物类型与纯度如表1所示。
145.表1商陆苷与商陆素来源、化合物类型与纯度
[0146][0147]
4、标准曲线制备方法
[0148]
分别称量1.00mg商陆苷，1.00mg商陆素，1.00mg柳胺酚(内标，来源于sigma-aldrich，纯度大于98％)，用甲醇溶解得到1mg/ml的商陆苷母液，1mg/ml的商陆素母液，1mg/ml的柳胺酚母液，将所述的柳胺酚母液用甲醇稀释成浓度为50ng/ml的所述内标工作液，用甲醇将所述商陆苷母液和商陆素母液稀释成1～2000ng/ml的含有两种对照品的不同浓度混合标准曲线工作液，将所得标准曲线工作液与柳胺酚混合后进行液质联用检测，使用内标法对所得数据进行处理，以商陆苷的浓度为横坐标，商陆苷和柳胺酚的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述商陆苷标准曲线；以商陆素的浓度为横坐标，商陆素和柳胺酚的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述商陆素标准曲线。求得商陆苷及商陆素在各组织中的线性方程，相关系数及定量限。结果见表2。
[0149]
表2商陆苷及商陆素在各组织中的线性方程
[0150][0151]
5、含量测定结果
[0152]
表3商陆苷及商陆素在各组织中的含量测定结果
[0153][0154][0155]
大鼠灌服扶正化瘀制剂后组织中可测出商陆苷(见图1)，商陆素(见图2)，含量测定结果如表3所示。
[0156]
本发明的优点：样品前处理非常简单，检测周期短，可实现对组织中商陆苷、商陆素含量的快速、高效分析；相较于传统检测手段，本发明的方法快速、灵敏、准确、高效，适用于实际运用过程中组织中扶正化瘀制剂有效成分的分析检测。
[0157]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本发明要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
[0158]
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。