一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法及应用与流程

1.本发明属于蛋白质标志物鉴定技术领域，具体地涉及一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法及应用。


背景技术：

2.有机磷神经性毒剂(organophosphorus nerve agents，opnas)是一类具有速效致死性的有机磷酸酯类化合物，是毒性高、杀伤力强的化学战剂。按化学结构，典型的opnas主要有g类和v类两类。2019年禁止化学武器组织拟增列附表1的一类新型神经毒剂novichok，也属于opnas的一种。《禁止化学武器公约》生效后，opnas在内的化学武器核查技术得到了迅速发展，化学毒剂中毒生物标志物的发现与快速灵敏的分析检测方法的建立，得到了世界各国的高度重视。
3.opnas中毒后，在生物体内一般会代谢opnas原体和小分子降解产物等在生物体内的存续时间比较短且特征性不明显；而opnas与体内活性蛋白质共价结合形成的加合物，其半衰期较长，可以在血液中存在数周之久，因此将其作为opnas中毒溯源研究的生物标志物，具有重要的理论和应用价值。
4.opnas对人体内乙酰胆碱酯酶ache和丁酰胆碱酯酶bche都会产生不可逆的抑制。血液中两种酶的活性水平是检测opnas中毒的主要指标，特别是比红细胞中ache更为灵敏且易恢复的血清bche。虽然检测血液胆碱酯酶的活性可以判断有机磷中毒，但也存在着酶活性水平的个体差异较大，准确性不高，受药物影响等不足等缺点，难以适用于低剂量opnas中毒的定性定量鉴定。
5.早期常用固相萃取法对对尿液或血液的小分子代谢物提取和富集，应用气质联用分析，实现opnas中毒检测。但是小分子代谢物不能提供opnas种类的相关信息，易受环境中无毒降解物的影响，造成对opnas中毒剂量的过高估计。最关键的是小分子代谢物在体内的存续时间短，一般在中毒后24-48h后就被排出体外，通常染毒两周后的尿液中仅能检测到痕量的游离代谢产物存在。
6.近年来，opnas与蛋白质加合物作为生物标志物得到发展，为研究opnas中毒机理和开发opnas中毒的药物治疗提供有用的信息。尤其是和胆碱酯酶上丝氨酸位点的结合，但是受限于胆碱酯酶加合物的纯化问题，鉴定难度增大。


技术实现要素：

7.为了解决现有将opnas与蛋白质加合物作为生物标志物时鉴定过程中由于胆碱酯酶加合物的纯化问题带来的鉴定难度问题，本发明提供一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法及应用，其基于高灵敏度的免疫磁珠法，并联合液相色谱-串联质谱lc-ms/ms，解决了胆碱酯酶加合物的纯化问题，且整个鉴定方法具有高效、快速、灵敏且高通量的效果。
8.本发明通过以下技术方案实现：
9.本发明第一方面提供一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法，包括以下步骤：
10.制备纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品中的至少一种样品并制备动物体内染毒样品，以得到至少两种染毒样品，所述纯蛋白体外染毒样品为在纯蛋白溶液中加入摩尔比过量的有机磷神经性毒剂溶液制得，所述血清体外染毒样品为在哺乳动物全血样本中加入摩尔比过量的有机磷神经性毒剂溶液制得，所述动物体内染毒样品为在动物体内注射有机磷神经性毒剂生理盐水溶液完成动物体内染毒后抽取的全血制得，所述纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品、动物体内染毒样品中的有机磷神经性毒剂种类相同；
11.对所述至少两种染毒样品分别进行以下步骤a至d的操作，得到至少两个质谱数据：
12.a、对染毒样品进行分离纯化，得到白蛋白，
13.b、将白蛋白进行膦酰化肽段提取，得到膦酰化活性肽段的冻干粉，
14.c、将解冻后冻干粉溶解于甲酸水溶液中，脱盐处理，得到待分析溶液，
15.d、将待分析溶液入质谱仪进行分析，采集得到与染毒样品对应的质谱数据，所述质谱数据包括膦酰化肽段集和与膦酰化肽段集中每个膦酰化肽段对应的加合位点；
16.对所述至少两个质谱数据进行相似性分析，得到相似性得分，根据相似性得分从膦酰化肽段集确定出该类有机磷神经性毒剂在白蛋白上的特征肽段，所述特征肽段包括膦酰化肽段集中的至少一个膦酰化肽段和与膦酰化肽段对应的加合位点。
17.几种典型毒剂结构相似，单从小分子代谢物难以对几种毒剂进行区别，但是利用毒剂与蛋白的加合过程中蛋白携带毒剂的指纹基团，可以进行准确的鉴定。随着生物质谱分析技术的完善和成熟，opnas与蛋白加合位点的确定得以实现。除了胆碱酯酶外，多种蛋白质都可以被opnas修饰，形成opnas与蛋白质加合物。使用高灵敏度的免疫富集法，并联合液相色谱-串联质谱lc-ms/ms，解决了胆碱酯酶加合物的纯化问题。纯化后的opnas-bche加合物被酶解成肽段，它们经过质谱分析和生物质谱数据库匹配发现活性位点，鉴定不同毒剂的蛋白标志物，其具有高效、快速、灵敏且高通量的检测效果。并将该鉴定方法应用与不同毒剂的判断中，同样具有高效、快速、灵敏且高通量的效果，且不依赖标准样品的染毒加合物溯源。
18.在一种可能的设计中，在制备动物体内染毒样品时，在动物体内注射有机磷神经性毒剂的剂量大于等于0.2
×
ld
50
。
19.所述对染毒样品进行分离纯化为：
20.采用电泳或亲和层析方法对染毒样品进行分离纯化。
21.采用四极杆轨道阱质谱仪对待分析溶液进行分析。
22.所述根据相似性得分鉴定出有机磷神经性毒剂在白蛋白上的特征肽段包括：
23.采用hisequest搜索技术根据相似性得分鉴定出有机磷神经性毒剂在白蛋白上的特征肽段。
24.本方案采用hisequest搜索技术，可提高对膦酰化肽段鉴定能力，提高鉴定的准确性。
25.本发明第二方面提供一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法的应用，包括以下步骤：
26.获取有机磷神经性毒剂中毒后的待检测染毒样品，所述待检测染毒样品为待检测对象染毒后抽取的全血；
27.采用第一方面及其任一种可能中所述基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法中的步骤a至d，获取与待检测染毒样品对应的质谱数据，所述质谱数据包括膦酰化位点和加合位点；
28.对比待检测染毒样品的质谱数据与标准表，确定待检测对象的染毒类型，所述标准表包括染毒类型和与染毒类型对应的膦酰化肽段和加合位点。
29.本发明与现有技术相比，至少具有以下优点和有益效果：
30.本发明使用高灵敏度的免疫磁珠法，并联合液相色谱-串联质谱lc-ms/ms，解决了胆碱酯酶加合物的纯化问题。纯化后的opnas-bche加合物被酶解成肽段，它们经过质谱分析和生物质谱数据库匹配发现活性位点，鉴定不同毒剂的蛋白标志物并应用于实现中毒毒剂的鉴定判断，其具有高效、快速、灵敏且高通量的检测效果。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为本发明基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法的流程图。
33.图2为人血清中染毒白蛋白的电泳结果图；
34.图3为蛋白a亲和层析柱纯化人血清中的igg；
35.图4是gd-k162加合位点的ms/ms谱图；
36.图5是gd-k188加合位点的ms/ms谱图；
37.图6是gd-k233加合位点的ms/ms谱图；
38.图7是gd-k329加合位点的ms/ms谱图；
39.图8是gd-k525加合位点的ms/ms谱图。
具体实施方式
40.下面结合附图及具体实施例来对本发明作进一步阐述。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明虽然是用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。本文公开的特定结构和功能细节仅用于描述本发明的示例实施例。然而，可用很多备选的形式来体现本发明，并且不应当理解为本发明限制在本文阐述的实施例中。
41.应当理解，在下面的描述中提供了特定的细节,以便于对示例实施例的完全理解。然而,本领域普通技术人员应当理解可以在没有这些特定细节的情况下实现示例实施例。例如可以在框图中示出系统，以避免用不必要的细节来使得示例不清楚。在其他实例中，可以不以非必要的细节来示出众所周知的过程、结构和技术，以避免使得示例不清楚。
42.本发明第一方面公开了一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法，包括以下步骤s101至步骤s103。本方法中涉及的所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得，且未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
43.步骤s101、制备纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品中的至少一种样品并制备动物体内染毒样品，以得到至少两种染毒样品，所述纯蛋白体外染毒样品为在纯蛋白溶液中加入摩尔比过量的有机磷神经性毒剂溶液制得，所述血清体外染毒样品为在哺乳动物全血样本中加入摩尔比过量的有机磷神经性毒剂溶液制得，所述动物体内染毒样品为在动物体内注射有机磷神经性毒剂生理盐水溶液完成动物体内染毒后抽取的全血制得，所述纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品、动物体内染毒样品中的有机磷神经性毒剂种类相同。
44.本方案中的opnas可以是塔崩、沙林和梭曼中的任意一种，此实施例以梭曼为例进行说明，即采用梭曼分别制备纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品、动物体内染毒样品。具体的，制备纯蛋白体外染毒样品的方法为：
45.以血清中目标蛋白的浓度为依据，将纯蛋白超声溶解在溶剂中，溶剂可选的为磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，pbs)，得到纯蛋白溶液。将有机磷神经性毒剂opnas溶解在超干异丙醇中，配成opnas溶液。量取纯蛋白溶液于离心管中，加入摩尔比过量的opnas溶液，旋涡振荡混匀后，置于37℃水浴温育，得到纯蛋白体外染毒样品。
46.制备血清体外染毒样品的方法为：
47.静脉抽取哺乳动物全血样本，量取稀释后的血清，加入上述摩尔比过量的opnas溶液，置于37℃水浴温育，得到全血体外染毒样品。
48.制备动物体内染毒样品的方法为：
49.选取健康且体重相近的1只雄性和2只雌性动物，染毒前在动物房饲养3天。用生理盐水将opnas溶液稀释，得到opnas生理盐水溶液。依据动物体重，通过静脉注射opnas生理盐水溶液完成动物体内染毒。将染毒动物放在动物房内正常饲养。注射毒剂的1小时至20天内按时间间隔静脉抽取动物全血，-80℃冷冻保存。
50.制备动物体内染毒样品时，可制备3组或更多组，每组包括健康且体重相近的1只雄性和2只雌性动物。
51.在上述染毒样品的制备过程中，以动物体内染毒样品为例，其注射opnas的剂量应遵从最低染毒剂量的原则。动物体内染毒样品制备时的最低染毒剂量的确定方法如下：
52.以大耳白兔为动物模型，从体内染毒方式入手确定使用的最低染毒剂量，并根据毒剂的ld
50
值进行剂量转化，计算纯蛋白体外染毒、血清体外染毒两种染毒方式的染毒剂量。如表1所示，其为体内染毒方式时不同毒剂量下修饰肽段的鉴定数量，其中，以沙林(sarin,gb)为代表，经过兔体内染毒在兔白蛋白上鉴定的被gb修饰的肽段。由表可知，随着染毒剂量的降低，被gb膦酰化的肽段数量逐渐减少，且当染毒剂量由0.2
×
ld
50
降至0.1
×
ld
50
后，肽段修饰比例由10.37％骤降至0.06％。为了尽可能获得低剂量下opnas与蛋白质的加合作用及产物规律，选取0.2
×
ld
50
为gb体内染毒剂量的最低染毒剂量标准。以白蛋白为例，其在血清中的含量为35μg/μl，按照兔体内0.2
×
ld
50
的染毒标准，gb在血清中浓度为0.6μg/μl，等浓度转化后，opnas的摩尔量是白蛋白的20倍，因此，纯蛋白体外染毒剂量均据此选取。0.2
×
ld
50
为沙林的最低染毒剂量，本方案将染毒剂量控制在最低染毒剂量，在保证膦酰化的肽段数量的前提下，有效控制了肽段修饰比例，以提高后续鉴定的可靠性。在塔崩和梭曼的蛋白标志物鉴定过程中，采用与其对应的最低染毒剂量即可。
53.表1不同染毒剂量下修饰肽段的鉴定数量
[0054][0055][0056]
步骤s102、对所述至少两种染毒样品分别进行以下步骤a至d的操作，得到至少两个质谱数据，即若制备纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品中的一个并同时制备动物体内染毒样品时，此时可得到两个质谱数据；若同时制备纯蛋白体外染毒样品、血清体外染毒样品和动物体内染毒样品，则可得到三个质谱数据。
[0057]
a、对染毒样品进行分离纯化，得到白蛋白。
[0058]
具体的，可采用电泳或亲和层析方法对染毒样品中的染毒蛋白进行分离纯化，以使膦酰化白蛋白和膦酰化igg分离，鉴定过程中互不干扰。
[0059]
以电泳方法为例：取高丰度蛋白去除试剂盒初步萃取，此处高丰度蛋白去除试剂盒可选用白蛋白/igg去除试剂盒，萃取液按比例加入蛋白电泳上样缓冲液，混匀，煮沸，得到白蛋白和igg的混合溶液，上样，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离白蛋白和免疫球蛋白(immunoglobulin，igg)。采用akta蛋白纯化系统，用蛋白a/g琼脂糖凝胶亲和层析柱对血清中的白蛋白进行纯化。图2以人血清中染毒白蛋白的电泳结果为例，可观察到65kda的白蛋白条带和少量的变性igg的条带。图3为蛋白a亲和层析柱纯化人血清中的igg。
[0060]
b、将白蛋白进行膦酰化肽段提取，得到膦酰化活性肽段的冻干粉。
[0061]
具体的，将白蛋白加入8m尿素，再加入二硫苏糖醇二硫苏糖醇溶液，加入等体积的碘乙酰胺溶液，反应10min后，转移至透析袋中进行透析。将透析后样品转移到新的离心管中，按照比例加入消化酶溶液，置于37℃水浴酶解16h。将酶解液超滤后经真空冷冻干燥，得到白色膦酰化活性肽段的冻干粉。
[0062]
c、将解冻后冻干粉溶解于甲酸水溶液中，脱盐处理，得到待分析溶液。
[0063]
具体的，将提取的冻干粉解冻，溶解于10μl 0.1％的甲酸水溶液，而后用c18反相层析脱盐柱脱盐处理，去除高盐组分，得到待分析溶液。
[0064]
d、将待分析溶液入质谱仪进行分析，采集得到质谱数据，所述质谱数据包括膦酰化肽段集和与膦酰化肽段集中每个膦酰化肽段对应的加合位点。该步骤中送入质谱仪分析的待分析溶液入优选为250ng。
[0065]
质谱仪是一种产生离子并根据气相中离子的质荷比(m/z)将其分离的仪器。过去
十年，质谱法已经成为蛋白质化学的一种关键的分析技术，是鉴定通过色谱或电泳分离的蛋白质的首选技术。质谱和基质辅助激光解吸/电离与飞行时间联用是目前广泛用于蛋白质/多肽技术研究的两种电离手段。基质辅助激光解吸电离质谱法是鉴定蛋白质修饰的强有力工具。电离时，加合物的共价键优先产生特征离子，能准确鉴定蛋白的小分子修饰。高分辨串联质谱法是一种多功能的肽段混合物鉴定工具，尤其是纳米液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry，q-orbitrap ms/ms)，具有高选择性和可靠性。
[0066]
质谱仪优选采用四极杆轨道阱质谱仪q-orbitrap ms/ms，其基于傅立叶变换的混合仪器之一，其包括两台质量分析仪，其中第一台质量分析仪是四极杆，第二台是高分辨率轨道阱。采用四极杆轨道阱质谱q-orbitrap ms/ms，其高分辨可减小膦酰化位点的鉴定中的假阳性，提高鉴定的准确性。
[0067]
步骤s103、对所述至少两个质谱数据进行相似性分析，得到相似性得分，根据相似性得分从膦酰化肽段集确定出该类有机磷神经性毒剂在白蛋白上的特征肽段，所述特征肽段包括膦酰化肽段集中的至少一个膦酰化肽段和与膦酰化肽段对应的加合位点。
[0068]
具体的，对至少两个质谱数据中的膦酰化位点进行相似性分析，提取出相似性超过一定阈值的膦酰化位点并计算相似性超过一定阈值的膦酰化位点的相似性得分。再通过对消化酶、固定修饰、膦酰化修饰等可变修饰设定搜索引擎技术定性检索具体参数，获得膦酰化肽段的特征肽段。优选的，本方案采用hisequest搜索技术进行具体参数的检索。表2对比了hisequest和mascot搜索技术在ga染毒的igg蛋白样品中对膦酰化肽段的鉴定能力。
[0069]
表2hisequest和mascot搜索技术对膦酰化肽段鉴定能力对比
[0070]
[0071][0072]
a no enzyme-0是搜库时没有加酶解位点，漏切数为0；
[0073]
b full enzyme-2是搜库时酶解位点为trypsin/glu-c，但设置为full，漏切数为2；
[0074]
c semi enzyme-0是搜库时酶解位点为trypsin/glu-c，但设置为semi，漏切数为0
[0075]
基于质谱相似性得分的可以鉴定出梭曼在白蛋白上的特征肽段和加合位点，此处的特征肽段即在膦酰化肽段中质谱响应性好的肽段，其中，表2即为梭曼在兔白蛋白上的体内体外加合位点；如图4至图8所示，即为被梭曼修饰的膦酰化肽段的ms/ms谱图。
[0076]
为了准确鉴定梭曼在白蛋白上的特征肽段，我们经过纯蛋白体外染毒、血清体外染毒和动物中毒后的质谱图进行对比。通过软件比对二者的质谱相似性得分可知，数据结构显示三种方式实际上有较大的差别。结果表明活体动物中毒后在白蛋白上可以发现5个被梭曼膦酰化的特征肽段和氨基酸残基，可通过这5个特征肽段实现对梭曼中毒后的鉴别。
[0077]
表2梭曼在兔白蛋白上的体内体外加合位点
[0078]
[0079][0080]a氨基酸序列包括兔白蛋白的信号肽
[0081]
基于上述方法可分别确定塔崩和沙林在活体动物中毒后在白蛋白上的特征肽段及数量，基于此方法也可实现对塔崩和沙林中毒后的鉴别。对此，本发明第二方面公开一种基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法的应用，包括以下步骤s201至步骤s203。
[0082]
步骤s201、获取有机磷神经性毒剂中毒后的待检测染毒样品，所述待检测染毒样品为待检测对象染毒后抽取的全血。
[0083]
步骤s202、采用第一方面中基于质谱分析技术的蛋白标志物快速鉴定方法中的步骤a至d，获取与待检测染毒样品对应的质谱数据，所述质谱数据包括膦酰化位点和加合位点。
[0084]
即采用第一方面中的方法对抽取的全血进行进行分离纯化，得到白蛋白；再将白蛋白进行膦酰化肽段提取，得到膦酰化活性肽段的冻干粉；其次再将解冻后冻干粉溶解于甲酸水溶液中，脱盐处理，得到待分析溶液；最后将待分析溶液入质谱仪进行分析，采集得到与染毒样品对应的质谱数据，所述质谱数据包括膦酰化位点和加合位点。其具体过程的操作详见第一方面的详细描述，在此不再赘述。
[0085]
步骤s203、对比待检测染毒样品的质谱数据与标准表，确定待检测对象的染毒类型，所述标准表包括染毒类型和与染毒类型对应的膦酰化肽段和加合位点。
[0086]
在该步骤中，通过将获得待检测染毒样品的膦酰化肽段和加合位点与标准表中的特征肽段即标准表中的膦酰化肽段和加合位点进行对比，找到与之相匹配项，即可找到染毒类型。
[0087]
标准表以按照第一方面中的方法确定，即采用不同的毒剂制备染毒样品，按照第一方面的中的方法步骤确定出与该毒剂对应的特征肽段。通过特征肽段的匹配，从而实现毒剂确认。
[0088]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。