一种柔性葡萄糖生物传感器及其制备方法

1.本发明涉及一种传感器及其制备方法，尤其涉及一种柔性葡萄糖生物传感器及其制备方法。


背景技术：

2.随着我国人民生活水平的提高，糖尿病在人群中的病发率正逐渐上升，据资料显示我国每天新增糖尿病患者在3000人左右，每年新增患者约为120万人，糖尿病已经成为既继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。在如此庞大的患病群体下，实时监控糖尿病患者的血糖含量当下热门。以往测量血糖浓度的方法大多是通过抽取患者血液进行的，这种做法即无法起到追踪作用，又会对患者造成身体伤害。据研究表明，人体汗液中葡萄糖含量可以间接反馈相应的血糖浓度，同时汗液的产生和获取比较简单。因此追踪检测汗液中葡萄糖的含量已经成为监控人体内血糖水平的一种有效手段。
3.柔性传感器结构灵活，形式多样，可以根据测量条件的要求任意布置，同时能够对复杂的环境及信号进行准确快速的实时检测，现今柔性传感器再电子皮肤，生物制药，可穿戴电子产品以及航天航空中都有重要的作用。以pi或pdms 为基底，将柔性可穿戴传感器与人体皮肤表面汗液检测有效结合既满足贴合在人体皮肤复杂环境的要求，又能高效实时的检测出人体汗液中葡萄糖含量，反馈人体健康水平。
4.在葡萄糖检测过程中使用葡萄糖氧化酶能高效专一的催化葡萄糖分解并产生过氧化氢，同时过氧化氢分解生成的氢离子能与还原型氧化石墨烯形成液栅半导体结构并产生响应，增大灵敏度。而以往的柔性生物传感器所使用的物理方法修饰的酶膜极易脱落，稳定性差，同时容易受到环境的影响不宜长时间使用。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种酶膜不易脱落、不易受环境影响、稳定性好的柔性葡萄糖生物传感器；本发明的另一目的是提供一种柔性葡萄糖生物传感器的制备方法。
6.技术方案：本发明的柔性葡萄糖生物传感器，所述传感器包括柔性基底，在柔性基底上通过激光雕刻法制备的石墨烯叉指电极，设叉指电极两侧的固态电极导线，覆盖在叉指电极表面的半导体碳纳米材料层，化学交联固定在半导体碳纳米材料层上的传感酶膜层，以及覆盖在传感酶膜层的阻断封装层；所述化学交联固定是将半导体碳纳米材料层表面羧基化处理，然后表面羧基活化后，浸入含有葡萄糖氧化酶溶液中，进行化学交联固定。
7.进一步地，半导体碳纳米材料层外围设有疏水绝缘层。
8.进一步地，柔性材料为pi或pdms。
9.上述的柔性葡萄糖生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将柔性材料作为基底，激光诱导柔性前驱体形成多孔石墨烯，将生成的多孔石墨烯直接作为叉指电极，或，将其转移至pdms基底上制备叉指电极。
11.(2)将导电银浆刷涂在叉指电极两侧，加热干燥形成固态电极导线；
12.(3)滴涂半导体碳纳米材料分散液至电极叉指区域，并在室温下干燥成膜，即为半导体碳纳米材料层；
13.(4)对半导体碳纳米材料层的外围刷涂聚酰亚胺溶液并加热烘干，形成固态疏水绝缘层。
14.(5)将叉指电极浸入含有pca的二甲基甲酰胺溶液中，对半导体碳纳米材料薄膜表面进行羧基化处理；再对半导体碳纳米材料表面羧基进行活化；活化后，再将电极浸入含有葡萄糖氧化酶的pbs缓冲液中进行孵育，即得传感酶膜层；
15.(6)将叉指电极分别浸入含有ea的pbs缓冲液、pbst溶液中，即得阻断封装层。
16.进一步地，步骤(1)中，激光诱导中激光的功率为为4～5.5w，扫描速率为1～4cm/s；柔性前驱体可为pi、pet、pc或pvc；叉指电极单指指宽范围 200～450μm，指间距范围50～150μm。
17.进一步地，步骤(1)中，转移至pdms基底上制备叉指电极的方法：在多孔石墨烯表面滴涂pdms液体，并高温固化；将固化后形成的pdms薄膜取下，并与柔性基底分离，即得pdms转印后的叉指电极。
18.进一步地，步骤(3)中，半导体碳纳米材料为石墨烯、还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管中的一种，或，上述碳材料的n型掺杂材料或p型掺杂材料中的一种。
19.进一步地，步骤(5)中，电极浸入含有n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液中进行活化。
20.进一步地，步骤(5)中，pca溶液的浓度为100mm，葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1mg/ml，pbs缓冲液ph为6.5。
21.进一步地，步骤(6)中，ea溶液的浓度为100mm，pbs缓冲液ph为7.2。
22.本发明以聚酰亚胺pi或pdms为柔性基底，使用激光雕刻技术照射pi前驱体形成多孔石墨烯叉指电极；在电极两侧刷涂导电银浆以增强导电性；使用液态 pi对叉指电极非响应区域进行封装提升传感器使用寿命和抗干扰性；在插指电极的非封装区域上修饰半导体碳纳米材料；使用芘甲酸(pca)对半导体碳纳米材料进行表面羧基化；使用edc-nhs活化半导体碳纳米材料表面羧基；将葡萄糖氧化酶gox修饰到活化后的半导体碳纳米材料表面，通过交联固定gox；滴加阻断剂乙醇胺ea及tween-20对未修饰gox的区域进行响应屏蔽。
23.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)柔性基底具有易弯曲，稳定性强，便于储存等特点，同时以基底为电极前驱体，工艺简单；
24.(2)灵敏度高，采用半导体碳纳米材料做传感沟道，增强了传感器对葡萄糖催化分解产生氢离子的敏感性，同时利用碳材料的结构特性为与芘甲酸π-π堆积并使自身羧基化提供了条件。
25.(3)稳定性好，利用nhs-edc交联葡萄糖氧化酶，避免酶脱落现象，有效解决传统物理固定法的传感器稳定性差的缺点，同时也继承了生物传感器灵敏度强，低检测限，高效专一的特性；
26.(4)传感器的抗干扰性能强，不易受外界影响，传感器中包含阻断封装层，可阻断外界干扰；
27.(5)制作工艺简单，制作过程明确，低检测限，高灵敏度，高稳定性，高抗干扰性，可
实现传感器的大批量生产制作。
附图说明
28.图1为本发明中以pi基底为例制备葡萄糖氧化酶传感器的流程图；
29.图2为本发明制备生物传感器的流程图；
30.图3为本发明中的利用用激光直写技术直接制备叉指电极示意图；
31.图4为本发明中利用pdms转印技术制备叉指电极示意图；
32.图5为本发明的生物传感器检测葡萄糖的响应曲线；
33.图6为本发明的生物传感器检测葡萄糖的校准曲线。
具体实施方式
34.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
35.图中，1、基底；2、激光；3、激光探头；4、叉指电极；5、固态电极导线； 6、半导体碳纳米材料薄膜；7、固态疏水绝缘层；8、pca溶液；9、nhs-edc 缓冲液；10、葡萄糖氧化酶缓冲液；11、ea溶液/pbst溶液；12、pdms薄膜；13、封装下层；14、封装上层。
36.实施例1
37.本发明的柔性葡萄糖生物传感器，包括柔性基底，在柔性基底上制备的石墨烯叉指电极，依次覆盖在石墨烯叉指电极上的半导体碳纳米材料层、传感酶膜层、阻断封装层，以及设在设叉指电极两侧的固态电极导线；其中传感酶膜层通过化学交联固定在半导体碳纳米材料层上。
38.进一步地，石墨烯叉指电极的敏感界面周围设有的绝缘疏水层。可选的，柔性基底为聚酰亚胺(pi)或pdms。可选的叉指电极的单指指宽范围200～450μ m，指间距范围50～150μm。
39.实施例2
40.如图1-3所示，本发明制备的柔性葡萄糖生物传感器，其具体过程如下：
41.(1)叉指电极
42.本发明利用激光直写技术制备叉指电极，其中柔性基底1为pi，厚度为80μ m，本实施例中使用的激光2波长为450nm，激光探头3功率为5.5w，激光扫描扫描速度为4cm/s。在该激光参数下，激光诱导前驱体生成多孔石墨烯电极。生成的叉指电极4参数为，叉指指间距为150μm，单叉指指宽为450μm。
43.上述步骤中柔性前驱体为pet、pc或pvc制备叉指电极，也可应用与柔性葡萄糖生物传感器。
44.(2)固态电极导线
45.如右图1(a)所示，将导电银浆刷涂在电极两侧，加热干燥形成固态电极导线5，并将电极叉指两侧刷涂导电银浆后放入恒温干燥箱，恒温干燥箱设置环境温度80℃，干燥时间为15min。
46.(3)半导体碳纳米材料层
47.如右图1(b)所示，半导体碳纳米材料石墨烯，将半导体碳纳米材料分散液超声30min后滴涂至电极叉指区域，所用半导体碳纳米材料分散液浓度为4mg/ml，滴涂量为7μl。
48.上述步骤中半导体碳纳米材料为还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管或上述碳材料的n型掺杂材料或p型掺杂材料，都能达到够制备半导体碳纳米材料层，其中石墨烯和单壁碳纳米管通过机械剥离和cvd方法合成，还原氧化石墨烯通过高温还原氧化石墨烯合成，还原温度为200℃，还原时长1h；
49.(4)固态疏水绝缘层
50.如右图1(c)所示，刷涂由液态聚酰亚胺原液与n-甲基吡咯烷酮溶液4：1混合配置而成的聚酰亚胺溶液至半导体碳纳米材料薄膜6外围，并放入烘干器，烘干温度为80℃，时间为30min，形成固态疏水绝缘层7。
51.(5)传感酶膜层
52.半导体碳纳米材料薄膜表面进行羧基化处理：如右图1(d)所示，首先配置浓度为100mmpca的dmf溶液，并将所述电极浸入pca溶液8，条件为室温下1h。取出电极后使用dmf溶液清洗电极表面并使用氮气(n2)吹干；
53.半导体碳纳米材料表面羧基进行活化：如图1(e)所示，首先配置浓度为10mmnhs和10mmedc的mes缓冲液，上述使用的mes缓冲液的ph为5.5，并将所述电极浸入nhs-edc缓冲液9中，条件为室温下20min；
54.交联固定葡萄糖氧化酶：如图1(f)所示，首先配置浓度为1mg/ml葡萄糖氧化酶的pbs缓冲液，上述使用的pbs缓冲液ph为6.5；并将所述电极浸入葡萄糖氧化酶缓冲液10中，环境温度为4℃，孵育时间为3h。
55.(6)阻断封装层
56.钝化残余酯基并阻断未被羧基化的rgo：如图1(g)所示，首先配置100mmea的pbs缓冲液，上述使用的pbs缓冲液ph为7.2，而后将所述电极浸入配置好的ea缓冲液11中，环境温度为4℃，时间为30min，取出电极后使用ph为7.2的pbs缓冲液对表面进行清洗；
57.将电极浸入到pbst溶液11中，设置环境温度为4℃，浸入时间为30min，使用pbst溶液为pbst缓冲液1
×
，ph为7.5。
58.(7)封装
59.如图1(h)所示，选用商用pdms薄膜，剪切出2个长2cm，宽1.5cm的pdms长方形薄膜；制作封装下层13，剪切pdms长方形薄膜形状如图1(f)所示；而后制作封装上层14，剪切pdms长方形薄膜形状如图1(f)所示。将制备好的传感器与封装下层13，封装上层14依次对齐贴合。
60.实施例3
61.与实施例2不同之处在于步骤(1)中，柔性基底1为pdms，并通过pdms转印制备制备叉指电极。
62.本实施例中pdms薄膜12厚度为450μm，如图4所示，制备过程包括如下步骤：
63.(1)使用pi基底1为激光诱导技术前驱体，厚度为80μm，并使用激光2波长为450nm，激光探头3功率为4w，激光扫描扫描速度为1cm/s的激光参数下诱导生成多孔石墨烯电极。生成的叉指电极4参数为，叉指指间距为50μm，单叉指指宽为200μm。将制备好的叉指电极4朝上放置在培养皿中。
64.(2)在叉指电极4上涂pdms液体，而后进行高温固化形成pdms薄膜12厚度为450μm，固化温度为75℃，固化时间为120min。
65.(3)将固化后的pdms薄膜12缓慢撕下来并将pi基底从pdms薄膜上分离，最终得到pdms转印后叉指电极4。
66.实施例4
67.与实施例1不同之处在于步骤(5)中，pca溶液的浓度80mm，gox溶液的浓度为2mg/ml，pbs缓冲液ph为7。步骤(6)中，ea溶液的浓度为 150mm，pbs缓冲液ph为8。
68.实施例5传感器测试
69.将不同浓度的葡萄糖溶液滴涂到电极检测区域，使用数字源表对不同浓度葡萄糖溶液作用下的传感器进行r-t测试：
70.(1)测定不同浓度葡萄糖溶液并建立标准曲线：取36μl 50mg/ml的葡萄糖标准液定溶于1ml ph为7.2的pbs缓冲液中配置成10mm的葡萄糖标准液；使用实施列2的传感器样品，取20ml ph为7.2pbs缓冲液为底液逐次滴加2μl 10mm的葡萄糖标准液，滴加间隔为200s。
71.(2)使用数字源表检测传感器电阻随时间变化曲线，调节阈值电压为1v，采样时间间隔为0.01s，实时监控并记录多次滴加葡萄糖标准液前后电阻变化并得出葡萄糖的响应曲线如附图5所示，葡萄糖的校准曲线如附图6所示。
72.实施例3-4的传感器样品测试步骤同上，结果反映，本发明的柔性葡萄糖生物传感器能够对葡萄糖浓度产生高效的检测结果。