一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用方法与流程

1.本发明属于循环肿瘤细胞检测领域，尤其涉及一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用方法。


背景技术：

2.肿瘤是一类严重威胁人类健康，具有高发病率和高死亡率的疾病。胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，由于早期无明显症状、疾病进展快及化疗有效率低，患者预后极差。
3.循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，ctc)可对多种肿瘤细胞展开分析，可先于影像学诊断发现微小病灶，目前已成为多种肿瘤疾病进展浸润及不良预后判断的重要依据。循环肿瘤细胞在肿瘤早期诊断、个体化治疗/疗效评估及肿瘤转移机制研究等方面具有重要价值。然而由于其在人体循环系统中所占比例极低，循环肿瘤细胞的分离和鉴定成为临床应用的难点。循环肿瘤细胞的异质性使得传统的依赖上皮特异性抗原表达来鉴定ctc的方法应用受到限制，只能检测到epcam阳性的细胞，无法检测epcam阴性的细胞。流式细胞法(flow cytometry，fcm)是基于荧光标记的单克隆抗体与细胞表面的特定抗原结合的原理，通过流式细胞仪对细胞进行分析的方法。流式细胞分析法的检测速度快，可实现肿瘤细胞的定量检测，还可对同一个细胞做多参数分析。
4.微流控芯片是一种技术先进的ctcs分离方法，能够单独操作和处理细胞，并精确捕获混合物中的稀有细胞，能够高效地从血液中分离活的癌细胞。微流控芯片管道可依据细胞大小来设计，也可利用免疫磁珠连同抗体的特异性结合来分离ctcs，通过抗原抗体结合捕获的ctcs可使用胰蛋白酶将其释放。微流控芯片具有灵敏度高，成本低，设备微型等优势，且不破坏细胞形态，分离出的ctcs可用于后续的体外培养和细胞分析。
5.现有技术中，缺少能够检测胰腺癌循环肿瘤细胞的试剂盒，不利于胰腺癌早期诊断、病理分型、病程分期及疗效评估。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于：提供一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用方法，可用于检测胰腺癌循环肿瘤细胞，具有较高的敏感性和特异性，捕获分离出的细胞保持完整性，可用于后续的细胞分析，便于胰腺癌早期诊断、病理分型、病程分期及疗效评估。
7.为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括：微流控芯片、生物素标记的抗体、抗体稀释液、样本稀释液、细胞固定液、细胞通透液和细胞荧光染色液，微流控芯片的结构片上有设置有纳米微阵列通道，微阵列通道上包被有链酶亲和素磁微粒。
8.作为上述技术方案的进一步描述：
9.生物素标记的抗体的组分包括含有生物素标记的鼠抗hla-g抗体、生物素标记的鼠抗ca19-9抗体和生物素标记的鼠抗ca125抗体。
10.作为上述技术方案的进一步描述：
11.抗体稀释液的组分包括tris-hcl缓冲液、牛血清白蛋白和叠氮钠。
12.作为上述技术方案的进一步描述：
13.样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
14.作为上述技术方案的进一步描述：
15.细胞固定液为4％多聚甲醛液。
16.作为上述技术方案的进一步描述：
17.细胞通透液0.2％triton-x100。
18.作为上述技术方案的进一步描述：
19.细胞荧光染色液的组分包括含有荧光标记抗体alexa fluor 488荧光素标记的细胞角蛋白抗体、pe标记的抗人cd45抗体和核酸染料dapi。
20.另一方面，本发明还提供了一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒的应用方法，包括以下步骤：
21.s1、外周血单核细胞的分离
22.a)取样品10ml，放入50ml试管中，轻轻混匀；
23.b)将试管直立静置于室温或37℃温箱中，待红细胞自然沉降；
24.c)用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；
25.d)加入无ca2+、mg2+hank’s液至离试管口3cm处，混匀，离心，弃上清，同法重复洗涤两次；
26.e)沉淀细胞用适量10％～20％灭活小牛血清的hank’s液重悬，细胞悬液作为处理后样本用于后续检测；
27.s2、捕获抗体的包被
28.a)采用样本稀释液清洗微流控芯片；
29.b)将生物素标记的抗体添加到pbs无菌缓冲液溶液中，混匀成抗体捕获工作液，用注射器将抗体捕获工作液注入到微流控芯片中，然后将微流控芯片置于湿盒中孵育；
30.c)用磷酸盐无菌缓冲液溶液清洗包被了捕获抗体的微流控芯片，除去残留在微流控芯片中的捕获抗体工作液；
31.d)封闭芯片；
32.s3、循环肿瘤细胞的捕获
33.a)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片3次；
34.b)将上述步骤s1制备的细胞悬液用注射器注入包被完成的微流控芯片中，室温静置；
35.c)将细胞固定液用注射器注入微流控芯片，静置；
36.d)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片；
37.s4、循环肿瘤细胞的免疫荧光染色
38.a)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片；
39.b)将含有抗体标记的细胞荧光染色液用注射器注入微流控芯片，孵育；
40.c)用无菌样本稀释液清洗微流控芯片；
41.d)将核酸荧光染色剂注入微流控芯片，静置；
42.e)置于荧光倒置显微镜下观察。
43.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
44.1、本发明中，试剂盒中微流控芯片的微阵列通道上包被有链酶亲和素磁微粒，链霉亲和素是一种四聚体蛋白，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体，从而使反应信号放大，大大提高循环肿瘤细胞检测的灵敏度。
45.2、本发明中，试剂盒中，抗体稀释液由tris-hcl缓冲液、牛血清白蛋白和叠氮钠组成。牛血清白蛋白可以保持抗体的活性和稳定性，减少非特异性结合，降低非特异性的背景着色，提高循环肿瘤细胞检测实验时的特异性和灵敏度。
46.3、本发明中，微流控芯片配合生物素标记的鼠抗hla-g抗体、生物素标记的鼠抗ca19-9抗体和生物素标记的鼠抗ca125抗体以及1
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pbs无菌缓冲液溶液配制成的抗体捕获工作液，使得捕获分离出的细胞保持完整性，可用于后续的细胞分析，便于胰腺癌早期诊断、病理分型、病程分期及疗效评估。
附图说明
47.图1为显微镜下放大400倍的ctc细胞的荧光染色图。
48.a：dapi标记细胞核显蓝色影；b：ck18标记肿瘤细胞显绿色影；c：cd45标记白细胞，显红色影；d：显现dlpa(+)/ck18(+)/cd45(-)时，为肿瘤细胞。
具体实施方式
49.下面将更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
50.一方面，本发明提供了一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括：微流控芯片、生物素标记的抗体、抗体稀释液、样本稀释液、细胞固定液、细胞通透液和细胞荧光染色液，微流控芯片的结构片上有设置有纳米微阵列通道，微阵列通道上包被有链酶亲和素磁微粒。
51.生物素-亲和素系统是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术。由于微流控芯片的微阵列通道上包被有链酶亲和素磁微粒，链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，是一种四聚体蛋白，可以和4个生物素分子亲密结合，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体，从而使反应信号放大，大大提高检测的灵敏度。
52.生物素标记的抗体是含有生物素标记的鼠抗hla-g抗体、生物素标记的鼠抗ca19-9抗体和生物素标记的鼠抗ca125抗体。人类白细胞抗原g(hla-g)是一种非典型的mhc-i类分子，具有七种蛋白异构体。hla-g作为一种免疫耐受分子，在体内能够和很多种的免疫活性细胞产生作用，从而达到减弱免疫应答的作用。生理条件下，hla-g仅表达在胎盘滋养层细胞、胸腺、角膜、指甲基质、胰腺、红细胞和内皮细胞的前体。病理条件下，hla-g可异常表达于肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病和单核细胞上。hla-g在大多数胰腺癌癌患者中表达，shla-g可以作为一个独立的预后因素，是一种有价值的预后指标。ca19-9是一类组成型表
达糖蛋白，在正常人和胰腺癌、胃癌等癌症患者血清中均能表达。但在正常人血清中的表达量普遍较低。ca19-9与胰腺癌相关性较高，可达到约70％，是胰腺癌中应用最广泛的一种血清学肿瘤标志物，常规用于协助诊断胰腺癌或评估其治疗效果。ca125是通过单克隆技术所证实的肿瘤相关抗原，本质是一种糖蛋白，存在于如腹膜、胸膜和心包膜等由体腔上皮衍生而来的组织中。ca125是胰腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌的首选糖类抗原肿瘤标志物。当肠癌等其他癌症发生时其血清含量通常会上升。
53.抗体稀释液：由tris-hcl缓冲液、牛血清白蛋白和叠氮钠组成。牛血清白蛋白可以保持抗体的活性和稳定性，减少非特异性结合，降低非特异性的背景着色，提高实验的特异性和灵敏度。
54.样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
55.细胞固定液为4％多聚甲醛液。
56.细胞通透液为0.2％triton-x100。
57.细胞荧光染色液：含有荧光标记抗体alexa fluor 488荧光素标记的细胞角蛋白抗体(alexa fluor 488-anti-ck18)、pe标记的抗人cd45抗体(pe-anti-cd45)和一种核酸染料dapi。
58.另一方面，本发明还提供了一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒的应用方法，具体检测步骤如下：
59.s1、外周血单核细胞的分离
60.1)取外周血10ml至加有抗凝剂50m离心管中，轻轻混匀；
61.2)将试管直立静置于室温或37℃温箱中30～60min，待红细胞自然沉降；
62.3)用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；
63.4)加入无ca2+、mg2+hank’s液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，同法在洗涤两次；
64.5)沉淀细胞用适量10％～20％灭活小牛血清的hank’s液重悬，制备成细胞悬液，作为处理后样本用于后续检测；
65.s2、捕获抗体的包被
66.1)采用200μl磷酸盐缓冲液清洗微流控芯片(芯片提前取出平衡至室温)；
67.2)分别将生物素标记的鼠抗hla-g抗体、生物素标记的鼠抗ca19-9抗体和生物素标记的鼠抗ca125抗体添加到1
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pbs无菌缓冲液溶液中，配制成5μg/ml浓度抗体捕获工作液。各取100μl混匀成混合抗体捕获工作液；
68.用注射器将100μl混合抗体捕获工作液注入到芯片中，然后将芯片置于湿盒中，4℃孵育过夜；在整个孵育过程中，确保所有芯片流道内始终覆盖着抗体捕获工作液；
69.3)用200μl的1
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pbs无菌缓冲液溶液清洗包被了捕获抗体的芯片3次，除去残留在芯片中的捕获抗体工作液；
70.4)封闭芯片，用5％bsa溶液27℃封闭芯片2小时，芯片上捕获抗体的包被完成；
71.s3、循环肿瘤细胞的捕获
72.1)用无菌磷酸盐缓冲液清洗芯片3次；
73.2)将上述制备的细胞悬液用注射器注入包被完成的芯片中，室温静置30min；
74.3)用无菌磷酸盐缓冲液清洗芯片3次；
75.s4、循环肿瘤细胞的免疫荧光染色
76.1)用200μl 1
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pbs无菌磷酸盐缓冲液清洗芯片3次；
77.2)将200μl 4％多聚甲醛液用注射器注入芯片，静置2小时，以固定捕获在芯片上的细胞；
78.3)用200μl 1
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pbs无菌磷酸盐缓冲液清洗芯片3次；
79.4)将200μl 0.2％triton-x100用注射器注入芯片，透化细胞；
80.5)将200μlalexa fluor 488荧光素标记的细胞角蛋白抗体(alexa fluor488-anti-ck18)、pe标记的抗人cd45抗体(pe-anti-cd45)抗体标记的细胞荧光染色液用注射器注入芯片，孵育2小时；
81.7)用200μl 1
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pbs无菌磷酸盐缓冲液清洗芯片3次；
82.8)将200μl dapi荧光染色剂用注射器注入芯片，静置15min；
83.9)置于荧光倒置显微镜下观察，记录荧光染色图像(参见附图1)，并进行分析。
84.结果
85.用dapi、alexa fluor 488标记的抗细胞角蛋白(ck)、alexa fluor555标记的抗cd45进行三色免疫荧光染色，认定ctcs的阳性标准是dapi阳性、ck阳性、cd45阴性。而白细胞的阳性标准是dapi阳性，ck阴性和cd45阳性。实验结果显示：检测的肿瘤细胞染色结果为阳性，可以检测出肿瘤细胞。
86.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。