本发明涉及中药的检测方法，尤其涉及一种补肾填精口服液的检测方法。
背景技术：
1、补肾填精口服液由人参、鹿茸等十五味药材组成，用于肾阳亏虚，腰膝痿软或冷痛，手足不温，阳事不举，精冷，精神萎糜或乏力等，现行标准为批件号为zgb2017-40的国家药品标准(修订)颁布件，现行标准中仅有黄芪、当归、枸杞子、人参的薄层色谱鉴别，且有杂质干扰，不能满足现有中药制剂标准日益严格的需求。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种补肾填精口服液的检测方法，提高补肾填精口服液质量标准的可控性，进一步确保产品内在质量和疗效。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
2、一种补肾填精口服液的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括薄层色谱法鉴别黄芪、人参、淫羊藿、枸杞子、当归和黑顺片的有效成分，以及高效液相色谱法测定肉苁蓉的有效成分。其中薄层色谱法鉴别黄芪和人参的步骤如下：
3、(1)供试品溶液的制备：取补肾填精口服液，加水饱和的正丁醇振摇提取，取正丁醇液，加氨试液洗涤，弃去氨洗液，用水洗涤，弃去水液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
4、(2)对照药材溶液的制备：取黄芪对照药材加水煎煮，放冷后滤过，取滤液同步骤(1)制成黄芪对照药材溶液；取人参对照药材加水煎煮，放冷后滤过，取滤液同步骤(1)制成人参对照药材溶液；
5、(3)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成黄芪甲苷对照品溶液溶液；取人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rg1对照品，加甲醇制成人参混合对照品溶液；
6、(4)阴性对照溶液的制备：取缺黄芪的阴性样品，同步骤(1)方法制缺黄芪阴性对照溶液；取缺人参的阴性样品，同步骤(1)方法制成缺人参阴性对照溶液；
7、(5)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、黄芪对照药材溶液、黄芪甲苷对照品溶液、缺黄芪的阴性对照溶液各5-10μl，以及上述供试品溶液、人参对照药材溶液、人参混合对照品溶液、缺人参阴性对照溶液各5-10μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为65:35:10)10℃下放置4小时以上(优选4-12小时)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光下和在紫外灯(365nm)下检视；
8、(6)结果分析：供试品色谱中，在与黄芪对照药材和黄芪甲苷对照品色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色的荧光斑点；供试品色谱中，在与人参对照药材和人参混合对照品色谱相应位置上，在日光下和紫外灯(365nm)下均判断是否显相同颜色的斑点。
9、优选地，所述薄层色谱法鉴别黄芪、人参的步骤如下：
10、(1)供试品溶液的制备：取补肾填精口服液30-50ml，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml-50ml，合并正丁醇液，加氨试液洗涤2次，每次40-50ml，弃去氨洗液，再用水洗涤两次，每次40-50ml，弃去水液，合并正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1-2ml使溶解，作为供试品溶液；
11、(2)对照药材溶液的制备：取黄芪对照药材1g，加水50ml，煎煮30-60min，放冷后滤过，取滤液同步骤(1)制成黄芪对照药材溶液；取人参对照药材1g，加水50ml，煎煮30-60min，放冷后滤过，取滤液同步骤(1)制成人参对照药材溶液；
12、(3)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的黄芪甲苷对照品溶液溶液；取人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rg1对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为人参混合对照品溶液；
13、(4)阴性对照溶液的制备：取缺黄芪的阴性样品30-50ml，同步骤(1)方法制成缺黄芪阴性对照溶液；取缺人参的阴性样品30ml，同步骤(1)方法制成缺人参阴性对照溶液；
14、(5)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、黄芪对照药材溶液、黄芪甲苷对照品溶液、缺黄芪阴性对照溶液各5-10μl，以及上述供试品溶液、人参对照药材溶液、人参混合对照品溶液、缺人参阴性对照溶液各2-5μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以三氯甲烷-甲醇-水(体积比为65:35:10)10℃下放置4小时以上(优选4-12小时)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光下和紫外灯(365nm)下检视；
15、(6)结果分析：供试品色谱中，在与黄芪对照药材和黄芪甲苷对照品色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色的荧光斑点；供试品色谱中，在与人参对照药材和人参混合对照品色谱相应位置上，在日光下和紫外灯(365nm)下判断是否均显相同颜色的斑点。
16、所述薄层色谱法鉴别淫羊藿的步骤如下：
17、(1)供试品溶液的制备：取补肾填精口服液，用水饱和正丁醇振摇提取后水洗，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解，加于中性氧化铝柱，40％甲醇洗脱，弃去洗脱液，再用40％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；
18、(2)对照药材溶液的制备：取淫羊藿药材，加水煎煮，放冷后滤过，取滤液同步骤(1)制成对照药材溶液；
19、(3)对照品溶液的制备：取淫羊藿苷、朝藿定c对照品，加甲醇制成混合溶液，作为对照品溶液；
20、(4)阴性对照溶液的制备：取缺淫羊藿的阴性样品，同步骤(1)方法制成缺淫羊藿阴性对照溶液；
21、(5)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、淫羊藿对照药材溶液、淫羊藿对照品溶液、缺淫羊藿阴性对照溶液4种溶液各2-5μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以甲醇-丁酮-氯仿-水(体积比为4:6:6:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝溶液，105℃加热，在紫外灯(365nm)下检视；
22、(6)结果分析：供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色荧光斑点。
23、优选地，所述薄层色谱法鉴别淫羊藿的步骤如下：
24、(1)供试品溶液的制备：取补肾填精口服液30-50ml，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次30-50ml，合并正丁醇液，水洗2次，每次30-50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2-5ml溶解。加于中性氧化铝柱(100-200目，5g，1.5cm内径)，40％甲醇30ml洗脱，弃去洗脱液，再用40％甲醇50-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1-2ml溶解，作为供试品溶液；
25、(2)对照药材溶液的制备：取淫羊藿药材1g，加水50ml，煎煮或超声30-60min，放冷后滤过，取滤液同步骤(1)制成对照药材溶液；
26、(3)对照品溶液的制备：取淫羊藿苷、朝藿定c对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；
27、(4)阴性对照溶液的制备：取缺淫羊藿的阴性样品30-50ml，同步骤(1)方法制成缺淫羊藿阴性对照溶液；
28、(5)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述4种溶液各2-5μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以甲醇-丁酮-氯仿-水(体积比为4:6:6:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝溶液，105℃加热，在紫外灯(365nm)下检视；
29、(6)结果分析：供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色荧光斑点。
30、所述薄层色谱法鉴别枸杞子、当归的步骤如下：
31、(1)供试品溶液的制备：取补肾填精口服液，加乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液。
32、(2)对照药材溶液的制备：取枸杞子对照药材，加水煎煮，滤过，滤液同步骤(1)制成对照药材溶液；取当归对照药材加水煎煮，滤过，滤液同步骤(1)制成对照药材溶液；
33、(3)阴性对照溶液的制备：取缺枸杞子的阴性样品，同步骤(1)方法制成缺枸杞子阴性对照溶液；取缺当归的阴性样品，同步骤(1)方法制成缺当归阴性对照溶液；
34、(4)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，分别吸取上述供试品溶液、枸杞子对照药材溶液和缺枸杞子阴性对照溶液，以及上述供试品溶液、当归对照药材溶液和缺当归阴性对照溶液，分别点于同一硅胶g薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为9:21:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯(365nm)下检视；
35、(5)结果分析：供试品色谱中，在与所述枸杞子对照药材色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色的斑点；供试品色谱中，在与所述当归对照药材色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色的斑点。
36、优选地，所述薄层色谱法鉴别枸杞子、当归的步骤如下：
37、(1)供试品溶液的制备：取补肾填精口服液15-30ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为当归供试品溶液；从当归供试品溶液中取1ml至10ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为枸杞子供试品溶液；
38、(2)对照药材溶液的制备：取枸杞子对照药材1g，加水50ml，超声或煎煮15-30min，滤过，滤液同步骤(1)制成枸杞子对照药材溶液；取当归对照药材1g，加水50ml，超声或煎煮15-30min，滤过，滤液同步骤(1)制成当归对照药材溶液；
39、(3)阴性对照溶液的制备：取缺枸杞子的阴性样品15-30ml，同步骤(1)方法制成缺枸杞子阴性对照溶液；取缺当归的阴性样品30ml，同步骤(1)方法制成缺当归阴性对照溶液；
40、(4)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取所述枸杞子供试品溶液、枸杞子对照药材溶液和缺枸杞子阴性对照溶液各1-2μl，以及所述当归供试品溶液、当归对照药材溶液和缺当归阴性对照溶液各1-2μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为9:21:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯(365nm)下检视；
41、(5)结果分析：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，在紫外灯(365nm)下判断是否显相同颜色荧光斑点。
42、所述薄层色谱法鉴别黑顺片的步骤如下：
43、(1)供试品溶液的制备：量取补肾填精口服液，加氨试液，用三氯甲烷振摇提取，加稀盐酸振摇提取，用浓氨溶液调节ph值至10，加三氯甲烷振摇提取，蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，作为供试品溶液；
44、(2)对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷(体积比为1:1)混合溶液制成的混合溶液，作为对照品溶液；
45、(3)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述2种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为6.4:5:1)为展开剂，置氨蒸气饱和15-30min的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化秘钾试液；
46、(4)结果分析：供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，判断是否显相同颜色荧光斑点。
47、优选地，所述薄层色谱法鉴别黑顺片的步骤如下：
48、(1)供试品溶液的制备：精密量取补肾填精口服液100ml，加氨试液15ml，用三氯甲烷振摇提取5次，每次30ml，加稀盐酸振摇提取5次，每次15-30ml，用浓氨溶液调节ph值至10，加三氯甲烷振摇提取3-5次，每次30ml，蒸干，残渣加无水乙醇0.5ml适量使溶解，作为供试品溶液；
49、(2)对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷(体积比为1:1)混合溶液制成每1ml各含有1mg的混合溶液，作为对照品溶液；
50、(3)薄层鉴别：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述2种溶液各10-15μl，分别点于同一硅胶g薄层板，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为6.4:5:1)为展开剂，置氨蒸气饱和15-30min的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化秘钾试液；
51、(4)结果分析：供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，判断是否显相同颜色荧光斑点。
52、所述高效液相色谱法鉴别肉苁蓉的步骤如下：
53、(1)供试品溶液的制备：取本品15-30ml，用正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，挥干，用甲醇复溶至25ml容量瓶中，摇匀，即得；
54、(2)对照品溶液的制备：取松果菊苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每l ml含0.2mg的混合溶液，即得；
55、(3)阴性对照溶液的制备：取缺肉苁蓉的阴性样品15-30ml，同步骤(1)方法制成缺肉苁蓉阴性对照溶液；
56、(4)测定法：分别精密吸取上述3种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，流速为1.0ml/min，按下表进行梯度洗脱；检测波长为330nm；柱温30-40℃；
57、
58、
59、(5)结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应位置上，有相应的色谱峰。
60、优选地，所述高效液相色谱法鉴别肉苁蓉的步骤如下：
61、(1)制备供试品溶液
62、取本品25ml，用正丁醇萃取3次，每次为30ml，合并正丁醇液，挥干，用甲醇复溶至25ml容量瓶中，摇匀，即得所述供试品溶液；
63、(2)制备对照品溶液
64、取松果菊苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每l m l含0.2mg的混合溶液，即得所述对照品溶液；
65、(3)制备阴性对照溶液
66、取缺肉苁蓉的阴性样品25ml，同步骤(10.1)方法制成缺肉苁蓉阴性对照溶液；
67、(4)高效液相色谱法测定
68、分别精密吸取上述3种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，流速为1.0ml/min，按下表进行梯度洗脱；检测波长为330nm；柱温35℃；
69、
70、(5)结果分析：供试品色谱图中，在与对照品色谱相应位置上，判断是否有相应的色谱峰。
71、本发明有益效果：本发明技术方案进一步完善了对补肾填精口服液的检测，所采用的色谱鉴别方法斑点清晰、分离度好，排除杂质干扰，所采用高效液相色谱法专属性好，色谱峰分离度高，提高了补肾填精口服液质量标准的可控性，进一步确保产品内在质量和疗效，保证患者用药安全意义重大。
72、以下将结合实施例，对本发明进行较为详细的说明。